王亞潔，劉卓琦，李華麗，潘慧鵬，楊春曉*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

FTZ-F1（Fushi-tarazu factor 1）是昆蟲體內(nèi)一種典型的核受體轉(zhuǎn)錄因子，在昆蟲的蛻皮、化蛹和成蟲繁殖中起到至關(guān)重要的作用。FTZ-F1在昆蟲多個(gè)組織中作為功能因子響應(yīng)20E（20-hydroxyecdysone，20-羥基蛻皮酮）信號(hào)，并介導(dǎo)下游基因的表達(dá)[1]。20E前體ecdysone在前胸腺（prothoracic glands，PGs）中合成并分泌到血淋巴，隨體液循環(huán)進(jìn)入靶細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被細(xì)胞色素P450羥化酶Shade（Cyp314a1）催化生成20E[2]。20E調(diào)節(jié)昆蟲的蛻皮及變態(tài)發(fā)育，是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵組分，由細(xì)胞色素P450單加氧酶基因、spook、phantom、disembodied（DIB）、shadow和shade等基因共同參與合成[3]。在完全變態(tài)昆蟲中，20E通過(guò)與蛻皮激素受體（ecdysone receptor，ECR）/超螺旋體（ultraspiracle，USP）異源二聚體結(jié)合來(lái)激活broad complex（BRC）、E74（Ecdysone-induced protein 74）、E75（Ecdysone-induced protein 75）和E93（Ecdysone-induced protein 93）等蛻皮激素早期應(yīng)答基因的表達(dá)[4,5]。這些早期應(yīng)答基因編碼的蛋白再激活HR3（hormone receptor 3）、HR4（hormone receptor 4）、HR38（hormone receptor 38）等中期應(yīng)答基因的表達(dá)，隨后這些中期應(yīng)答基因編碼的蛋白通過(guò)誘導(dǎo)核受體因子FTZ-F1再觸發(fā)晚期基因的表達(dá)[5,6]。因此，核受體FTZ-F1在20E通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。沉默昆蟲的FTZ-F1基因，昆蟲體內(nèi)20E相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)受到影響。例如，在馬鈴薯葉甲Leptinotarsa decemlineata中，沉默LdFTZ-F1會(huì)影響幼蟲化蛹，顯著抑制20E相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并降低20E滴度[7]。在果蠅Drosophila melanogaster中沉默DmFTZ-F1會(huì)導(dǎo)致phantom、DIB、shadow表達(dá)量的降低[8]。

在蛻皮過(guò)程中，TH（tyrosine hydroxylase）、DDC（Dopa decarboxylase）、laccase2和ebony等色素合成基因調(diào)控昆蟲體色的形成[9]。酪氨酸羥化酶（TH）將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴（Dopa）；之后，多巴脫羧酶（DDC）將多巴轉(zhuǎn)化為黑色素的前體多巴胺（Dopamine）；laccase2通過(guò)多巴和多巴胺催化黑色素的產(chǎn)生[9-12]。合成的色素前體從表皮細(xì)胞中分泌出來(lái)，然后摻入表皮，形成可視化的黑色斑紋和斑點(diǎn)。多巴胺還可由ebony轉(zhuǎn)化為N-β-丙烯基多巴胺（NBAD），參與表皮鞣化，使表皮呈現(xiàn)黃色或者淡黃色[13]。研究發(fā)現(xiàn)20E調(diào)控色素相關(guān)基因的表達(dá)，并且20E和保幼激素（JH）對(duì)昆蟲體內(nèi)總多巴胺水平具有特異性影響[11,14,15]。FTZ-F1首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)，編碼α型和β型兩種蛋白質(zhì)，已有研究證明βFTZ-F1參與調(diào)控昆蟲蛹?xì)ば纬?，是表皮形成所必須的[16]。沉默昆蟲體內(nèi)FTZ-F1基因會(huì)導(dǎo)致幼蟲蛻皮失敗并死亡。例如，將赤擬谷盜Tribolium castaneum5齡幼蟲注射800～1000 ng dsTcFTZ-F1造成100%的幼蟲在化蛹前死亡[17]。在黑腹果蠅Drosophila melanogaster中，βFTZ-F1調(diào)控蛻皮和變態(tài)相關(guān)基因，沉默DmFTZ-F1會(huì)抑制幼蟲蛻皮直至死亡[18]。在德國(guó)小蠊Blattella germanica中，BgFTZ-F1控制蛻皮脈沖的時(shí)間，沉默BgFTZ-F1導(dǎo)致幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和蛻皮失敗[19]。BmFTZ-F1與家蠶Bombyx mori幼蟲蛻皮和羽化有關(guān)[20]。沉默棉鈴蟲Helicoverpa armigera4齡幼蟲的HaFTZ-F1基因，導(dǎo)致幼蟲蛻皮過(guò)程受到抑制[21]。以上研究都表明FTZ-F1在昆蟲蛻皮過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

茄二十八星瓢蟲Henosepilachna vigintioctopunctata屬于鞘翅目、瓢蟲科，主要為害茄科植物，如馬鈴薯Solanum tuberosum、番茄Lycopersicon esculentum、茄子Solanum melongena等。自2015年起，我國(guó)推進(jìn)馬鈴薯主糧化，近年來(lái)，隨著馬鈴薯種植面積不斷擴(kuò)大，茄二十八星瓢蟲的為害愈加嚴(yán)重[22]。目前，化學(xué)防治仍然是防控茄二十八星瓢蟲的主要手段。然而由于化學(xué)藥劑長(zhǎng)期、不合理地使用會(huì)引起環(huán)境污染以及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等問(wèn)題。因此，制定其他防控策略來(lái)對(duì)茄二十八星瓢蟲進(jìn)行綜合治理非常有必要[23]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）指外源或內(nèi)源的雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）在生物體內(nèi)被核酸內(nèi)切酶 Dicer切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段siRNA，之后通過(guò)序列配對(duì)的模式干擾靶標(biāo)基因翻譯蛋白過(guò)程或降解 mRNA序列，從而產(chǎn)生基因沉默的現(xiàn)象[24]。近十年，RNAi在害蟲防治中的應(yīng)用得到了廣泛的研究[25-28]。RNAi已成為了通過(guò)抑制基因表達(dá)進(jìn)行害蟲生物防治的有效手段。以RNAi為基礎(chǔ)的害蟲防治是控制茄二十八星瓢蟲的一個(gè)潛在可行的解決方案[28-32]。

為篩選基于RNAi技術(shù)的茄二十八星瓢蟲綠色防控的候選靶標(biāo)基因，通過(guò)飼喂茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲100 ng/μL的dsHvFTZ-F1處理過(guò)的葉片，使得幼蟲無(wú)法蛻皮進(jìn)入2齡，直至死亡，死亡率為90%[32]。在本研究中，我們利用飼喂法RNAi，探究低濃度處理下沉默HvFTZ-F1基因?qū)η讯诵瞧跋x存活和發(fā)育的影響，為降低防控成本、實(shí)現(xiàn)RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物與蟲源

本研究所用的茄二十八星瓢蟲于2018年4月采集自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)的龍葵，將瓢蟲與葉片均置于放有濾紙和棉球保濕的培養(yǎng)皿中，在人工氣候箱中繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度70%～80%，光周期14L∶10D。

1.2 RNA的提取與cDNA的合成

采用TRIzol法提取樣品總RNA，使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測(cè)定RNA濃度，所有樣本RNA的OD260/OD230在1.8～2.2。使用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Dalian，China）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所得cDNA稀釋10倍用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 dsRNA的體外合成

使用包含T7啟動(dòng)子序列的特異性引物[33]進(jìn)行HvFTZ-F1和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）dsRNA 的合成。PCR 反應(yīng)體系：10 μL 5×PCR buffer，1.0 μL dNTP mix，5.0 μL 上游引物（10 μmol/L），5.0 μL 下游引物（10 μmol/L），0.25 μLTaq（5 U/μL）（TaKaRa，China）。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用 DNA膠回收試劑盒（Tiangen，Beijing，China）進(jìn)行回收，作為合成dsRNA的模板。使用MEGAscript T7 RNAi試劑盒（Thermo Fisher Scientific，USA）合成dsRNA，分別得到dsHvFTZ-F1和dsGFP。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA質(zhì)量并使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）測(cè)定dsRNA濃度。

1.4 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲存活和發(fā)育的影響

用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1溶液浸泡直徑為12 mm的圓形茄子葉片1 min，待葉片自然風(fēng)干后飼喂茄二十八星瓢蟲1齡初幼蟲，每隔24 h更換一次葉片，飼喂dsHvFTZ-F1處理的葉片48 h后，更換為新鮮的未經(jīng)dsRNA處理的茄子葉片。將幼蟲放入有濾紙和加濕棉球的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，用相同方法以5 ng/μL的dsGFP作為對(duì)照組。每個(gè)dsRNA濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含有10頭1齡幼蟲，培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中（溫度25 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，光周期14L∶10D）。每隔12 h統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中茄二十八星瓢蟲的死亡數(shù)目，拍攝并記錄dsRNA處理下茄二十八星瓢蟲的存活和發(fā)育情況。

1.5 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E和色素沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1處理1齡幼蟲。每10頭幼蟲為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理后48 h收樣。所有樣本均用液氮迅速冷凍，用1.5 mL無(wú)RNA酶的離心管保存于-80 ℃，之后進(jìn)行總RNA的提取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所得cDNA用于檢測(cè)dsHvFTZ-F1處理后對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲HvFTZ-F1基因、20E相關(guān)基因（HvSPOOK，HvSHADOW，HvSHADE，HvDIB，HvE75，HvECR，HvHR3）和色素沉積相關(guān)基因（HvDDC，HvTH，Hvebony）表達(dá)量的影響。

1.6 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E滴度的影響

為研究HvFTZ-F1沉默對(duì)20E滴度的影響，首先通過(guò)連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)20E溶液構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1和5 ng/μL的dsGFP（對(duì)照組）處理1齡幼蟲，每10頭幼蟲為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理后48 h收樣。所收樣本以1∶9（w/v）比例加入PBS緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），使用研磨器（Tiangen，China）在冰上充分研磨并稀釋。所得勻漿以5000 r/min離心10 min，使用昆蟲蛻皮酮酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（Insect Ecdysone ELISA Kit，MLBIO，China）測(cè)定上清液中20E滴度。使用酶標(biāo)儀（BIO-RAD，CA，USA）測(cè)定光密度（optical densities，ODs）。

1.7 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲多巴胺滴度的影響

為研究HvFTZ-F1沉默對(duì)多巴胺滴度的影響，首先通過(guò)連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)多巴胺溶液構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1和5 ng/μL的dsGFP（對(duì)照組）處理1齡幼蟲，每10頭幼蟲為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，處理后48 h收樣。所收集樣本以1∶9（w/v）的比例加入PBS緩沖液，使用研磨器在冰上充分研磨并稀釋。所得勻漿以3000 r/min離心20 min，使用昆蟲多巴胺酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（Insect Dopamine ELISA kit，NJJCBIO，China）對(duì)上層清液進(jìn)行多巴胺濃度測(cè)定。使用酶標(biāo)儀（iMark，BIO-RAD，USA）檢測(cè)OD值。

1.8 RT-qPCR分析

對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行RT-qPCR分析，RT-qPCR的反應(yīng)體系：cDNA模板1.0 μL，引物F和R（10 μmol/L）各 0.625 μL，TB Green 7.5 μL，ddH2O 5.25 μL，共 15 μL。RT-qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?3 個(gè)階段，分別為變性階段95 ℃，30 s；定量分析階段（95 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析階段（65 ℃～95 ℃，每升溫0.5 ℃檢測(cè)一次熒光信號(hào)，每次檢測(cè)持續(xù)5 s）[33]。反應(yīng)在96孔板Microseal PCR plates中進(jìn)行，RT-qPCR的反應(yīng)儀器為Bio-Rad C1000 Real-Time PCR system（Bio-Rad C1000 Real-Time PCR system，BIO-RAD，USA）。使用HvRPS18和HvRPL13作為內(nèi)參基因，各基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算[34]，所用引物序列參照之前研究[33]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析HvFTZ-F1及相關(guān)基因在處理組和對(duì)照組中的表達(dá)水平差異，以及比較不同處理下 20E滴度和多巴胺滴度的差異（P＜0.05）。百分比數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行反正弦平方根變換。使用IBM SPSS Statistics v.24.0軟件（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲生存及發(fā)育的影響

經(jīng)5 ng/μL的dsRNA處理后，dsGFP對(duì)照組幼蟲在處理3 d后發(fā)育至2齡。dsHvFTZ-F1處理的幼蟲無(wú)法蛻皮進(jìn)入2齡直至死亡，并且所有幼蟲的死亡狀態(tài)均為后腸從肛門處伸出（圖1）。

圖1 茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲經(jīng)dsHvFTZ-F1處理3 d后表型的變化Fig.1 Phenotypic changes of the H.vigintioctopunctata 1st instar larvae treated with dsHvFTZ-F1 for 3 days

取食dsHvFTZ-F1處理的葉片，可導(dǎo)致茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲的死亡率達(dá)65.00%（t＝16.57，df＝8，P＜0.0001）（圖2）。

圖2 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲存活率的影響Fig.2 The impact of ingetion of 5 ng/μLdsHvFTZ-F1 treated leaves on the survival rate of the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

2.2 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E和色素沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

經(jīng)dsHvFTZ-F1處理2 d后，1齡幼蟲的HvFTZ-F1基因表達(dá)水平顯著降低了63.69%（t＝4.426，df＝4，P＝0.011）；HvE75（t＝11.173，df＝2，P＝0.008）的表達(dá)水平降低了 20.76%；HvHR3（t＝3.636，df＝2，P＝0.068）、HvECR（t＝0.14，df＝2，P＝0.901）的表達(dá)量無(wú)顯著變化（圖3A）。

同樣，經(jīng)dsHvFTZ-F1處理后HvDIB、HvSPOOK、HvSHADOW、HvSHADE表達(dá)水平顯著降低，分別下調(diào) 85.36%（t＝118.238，df＝2，P＜0.0001），66.32%（t＝49.844，df＝2，P＜0.0001），52.74%（t＝20.336，df＝2，P＝0.002），31.12%（t＝10.993，df＝2，P＝0.008）（圖 3B）。

HvDDC、HvTH、Hvebony表達(dá)水平在5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理后顯著降低，分別降低了88.74%（t＝36.913，df＝4，P＜0.0001），91.97%（t＝55.982，df＝2，P＜0.0001），86.15%（t＝47.937，df＝2，P＜0.0001）（圖3C）。

圖3 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲中HvFTZ-F1及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.3 The impact of ingetion of 5 ng/μL dsHvFTZ-F1 treated leaves on the gene expression of HvFTZ-F1 and related genes in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

2.3 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E滴度的影響

經(jīng)dsHvFTZ-F1處理2 d后，1齡幼蟲的20E滴度顯著降低了15.97%（t＝3.693，df＝4，P＝0.021）（圖4）。

圖4 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲中20E滴度的影響Fig.4 The impact of ingetion of 5 ng/μL dsHvFTZ-F1 treated leaves on the 20E titer in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

2.4 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲多巴胺滴度的影響

1齡幼蟲的多巴胺滴度在dsHvFTZ-F1處理2 d后顯著降低了21.38%（t＝44.281，df＝4，P＜0.0001）（圖5）。

圖5 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲中多巴胺滴度的影響Fig.5 The impact of ingetion of 5 ng/μL dsHvFTZ-F1 treated leaves on the dopamine titer in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

3 討論

近期研究發(fā)現(xiàn)HvFTZ-F1基因在茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲和2齡幼蟲中的表達(dá)量顯著高于3齡和4齡幼蟲中的表達(dá)量，在幼蟲階段每次蛻皮前或蛻皮時(shí)高表達(dá)[32]。并且HvFTZ-F1在預(yù)蛹期高表達(dá)，與FTZ-F1基因在赤擬谷盜[17]、馬鈴薯葉甲[7]、棉鈴蟲[21]等昆蟲中的研究結(jié)果相似。HvFTZ-F1在不同發(fā)育階段的特異表達(dá)模式，表明HvFTZ-F1是茄二十八星瓢蟲生存發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因。

為了探究HvFTZ-F1的功能，我們通過(guò)飼喂dsHvFTZ-F1抑制茄二十八星瓢蟲HvFTZ-F1基因的表達(dá)，結(jié)果表明HvFTZ-F1基因沉默會(huì)導(dǎo)致茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲出現(xiàn)發(fā)育障礙并死亡。經(jīng)處理的1齡幼蟲不能正常蛻皮進(jìn)入2齡，表明HvFTZ-F1在茄二十八星瓢蟲蛻皮中發(fā)揮重要作用。在黑腹果蠅、淡色庫(kù)蚊Culex pipiens pallens等昆蟲中，F(xiàn)TZ-F1對(duì)于表皮形成均有影響，進(jìn)一步說(shuō)明HvFTZ-F1可能參與茄二十八星瓢蟲表皮的形成[35,36]。處理組幼蟲的死亡狀態(tài)均為后腸攜帶新鮮糞便從肛門伸出，之前的研究表明，100 ng/μL dsHvFTZ-F1也會(huì)導(dǎo)致1齡幼蟲出現(xiàn)同樣的死亡狀態(tài)，同時(shí)伴隨滲透壓基因的顯著升高，因此我們推測(cè)，低劑量的dsHvFTZ-F1處理同樣能影響茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲的滲透壓調(diào)節(jié)[32]。

HvFTZ-F1沉默導(dǎo)致1齡幼蟲Halloween基因（HvDIB、HvSPOOK、HvSHADOW、HvSHADE）和20E相關(guān)基因HvE75表達(dá)水平不同程度的下調(diào)，顯著降低了幼蟲體內(nèi)的20E滴度。在果蠅、馬鈴薯甲蟲和棉鈴蟲等昆蟲中，RNAi介導(dǎo)的FTZ-F1沉默導(dǎo)致蛻皮激素滴度顯著降低[7,8,21]，我們的研究結(jié)果與在這些昆蟲中的研究結(jié)果一致，表明HvFTZ-F1參與茄二十八星瓢蟲的20E信號(hào)通路。并且，HvFTZ-F1沉默降低了色素沉著相關(guān)基因（HvTH，HvDDC，Hvebony）的表達(dá)水平。有研究報(bào)道，在亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis和西方蜜蜂Apis mellifera中，20E相關(guān)基因影響了色素沉積相關(guān)基因的表達(dá)。向亞洲玉米螟注射20E會(huì)導(dǎo)致Oflaccase2表達(dá)水平升高[37]；西方蜜蜂Amlaccase2的表達(dá)水平受蛻皮激素的調(diào)節(jié)，且Amlaccase2在成蟲外骨骼分化過(guò)程中起重要作用，其表達(dá)的改變可導(dǎo)致蛻皮激素釋放受阻和外骨骼異常[38]。類似的其他報(bào)道稱，向棉鈴蟲注射20E促進(jìn)了TH的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)一步加強(qiáng)了色素相關(guān)基因與20E的相關(guān)性[39]。20E可能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子參與黑色素生化模塊的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)昆蟲蛻皮后的黑化和硬化。

另外，HvFTZ-F1沉默降低了茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲多巴胺滴度，因此我們推測(cè)FTZ-F1可通過(guò)調(diào)控20E信號(hào)，控制色素合成基因的表達(dá)和多巴胺滴度，并影響昆蟲蛻皮，或HvFTZ-F1直接參與茄二十八星瓢蟲多巴胺的合成，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。在煙草天蛾Manduca sexta中，注射20E會(huì)抑制表皮黑色素沉積[11]，說(shuō)明蛻皮激素滴度的降低會(huì)啟動(dòng)黑色素合成信號(hào)通路，還需進(jìn)一步探究茄二十八星瓢蟲體內(nèi)的20E滴度下降對(duì)多巴胺滴度的變化的影響。

本研究首次采用低濃度 5 ng/μL的 dsHvFTZ-F1處理茄二十八星瓢蟲 1齡幼蟲，以探究低濃度dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲存活和發(fā)育的影響。相較于之前采用100 ng/μL dsHvFTZ-F1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[32]，較低濃度的dsRNA處理同樣也能夠造成生長(zhǎng)發(fā)育障礙及較高的死亡率。HvFTZ-F1基因可被認(rèn)為是一個(gè)潛在的靶標(biāo)基因，用于開發(fā)基于RNAi技術(shù)的生物農(nóng)藥防治茄二十八星瓢蟲。