普琪雯，焦慧宇，區(qū)文韜，劉健麗，林 勝

（福建農(nóng)林大學(xué)閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建農(nóng)林大學(xué)海峽兩岸特色作物安全生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/福建省農(nóng)產(chǎn)品安全研究平臺(tái)/害蟲(chóng)綠色防控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

水稻Oryza sativa是世界上分布最廣、人類(lèi)食用最多的糧食作物之一。褐飛虱被認(rèn)為是對(duì)水稻最有威脅的害蟲(chóng)之一[1]，主要以水稻韌皮部汁液為食物來(lái)源。由于缺乏抵抗褐飛虱入侵的第一道“屏障”，我國(guó)褐飛虱出現(xiàn)了連年暴發(fā)的現(xiàn)象，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]?？剐运疽恢笔欠乐蔚撅w虱研究中的焦點(diǎn)，目前已成功育成了攜帶bph1和bph2基因的抗稻飛虱水稻[3]，但很快就被稻飛虱適應(yīng)[4-6]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，沒(méi)有其他基因被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代水稻品種中。盡管如此，即使針對(duì)從未廣泛應(yīng)用的基因，稻飛虱種群適應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻的能力也有所增加（如bph8、Bph9、BPH25、BPH26）[6,7]。

cry30Fa1是由朱軍等[8]通過(guò)菌株分離，鑒定出的1種新型Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因。近期，王海鵬[9]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將cry30Fa1轉(zhuǎn)入受體水稻蜀恢818（R818）中，通過(guò)對(duì)目的基因的表達(dá)水平檢測(cè)、苗期抗蟲(chóng)性鑒定和田間抗蟲(chóng)性鑒定等途徑實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗褐飛虱cry30Fa1的優(yōu)化及成功轉(zhuǎn)化。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將cry30Fa1轉(zhuǎn)入明恢86水稻（MH86）的愈傷組織中，在進(jìn)一步誘導(dǎo)培育下得到新型轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻（KF30-14）[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KF30-14能有效抑制褐飛虱雌成蟲(chóng)體質(zhì)量、卵巢發(fā)育及繁殖力[11,12]，但相關(guān)影響機(jī)制尚不清楚。

課題組通過(guò)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，取食KF30-14水稻的褐飛虱雌蟲(chóng)的NlHRP基因顯著表達(dá)，其主要編碼富組氨酸蛋白。組氨酸（His）是褐飛虱的必需氨基酸之一，在其生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[13-15]。因此，本研究克隆了NlHRP基因，并研究了轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻（KF30-14）對(duì)其表達(dá)模式的影響，旨在為揭示轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻抗褐飛虱的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試水稻 轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻（KF30-14）與其親本水稻明恢86（MH86）均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng) 褐飛虱飼養(yǎng)于福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所人工氣候室，溫度（28±1）℃，光周期16L∶8D，相對(duì)濕度（80±1）%。已在KF30-14和MH86上連續(xù)飼養(yǎng)30代以上。

1.1.3 主要試劑與試劑盒 如表1。

表1 主要試劑與試劑盒Table 1 The mainly reagent and kits

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 如表2。

表2 主要儀器Table 2 The mainly instrument

1.2 目的基因篩選

通過(guò)對(duì)比KF30-14實(shí)驗(yàn)種群與MH86實(shí)驗(yàn)種群中羽化3 d的褐飛虱雌雄成蟲(chóng)和褐飛虱3齡若蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)顯著差異基因進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考序列比對(duì)后，通過(guò)維恩圖進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。

1.3 NlHRP的序列及其表達(dá)模式分析

1.3.1 RNA提取及cDNA合成 用Trizol試劑提取褐飛虱組織與整蟲(chóng)的總RNA。步驟如下：取收集好的褐飛虱整蟲(chóng)或組織置于1.5 mL無(wú)酶離心管，再于每管加入2顆3 mm的鋼珠，使用組織破碎儀進(jìn)行30 s（30 Hz）破碎；取200 μL Trizol試劑，加入離心管中，使用組織破碎儀進(jìn)行30 s（30 Hz）破碎后常溫靜置10 min；再加40 μL氯仿于每個(gè)離心管中，振蕩5 s后常溫靜置10 min；4 ℃ 13000 r/min離心10 min；吸75 μL上清液，并轉(zhuǎn)移至新離心管；加75 μL同體積異丙醇后振蕩5 s混勻，將離心管置于-20 ℃冰箱中3 h以上；4 ℃ 13000 r/min離心20 min后棄上清；加600 μL無(wú)水乙醇，振蕩至沉淀懸浮，從而達(dá)到洗滌沉淀的目的；4 ℃ 13000 r/min 離心10 min后棄上清；加600 μL 無(wú)水乙醇，再次洗滌沉淀；4 ℃ 13000 r/min離心10 min后倒上清，用吸水紙吸取多余液體，側(cè)倒在通風(fēng)櫥里用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干；加適量DEPC水溶解RNA，劇烈振蕩1 min；1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，并使用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量。

使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN，KR118）試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)在冰上配置反轉(zhuǎn)錄混合液，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，Total RNA定量到1 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到20 μL，瞬離至沒(méi)有氣泡后放入PCR儀中進(jìn)行以下程序：42 ℃，15 min；95 ℃，3 min。將得到的cDNA放到-20 ℃冰箱保存。

1.3.2NlHRPEST序列擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以該基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物NlHRP-F和NlHRP-R（表3），通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得NlHRP的EST序列，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；5個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；74 ℃，60 s）；5個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；72 ℃，60 s）；5個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；70 ℃，60 s）；25個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；68 ℃，60 s）；68 ℃，5 min。

表3 NlHRP序列擴(kuò)增PCR引物Table 3 PCR primer of NlHRP sequence amplification

1.3.3NlHRP全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增 用HiScript-TS 5′/3′ RACE Kit試劑盒（Vazyme，China）進(jìn)行NlHRP的全長(zhǎng)擴(kuò)增。根據(jù)NlHRP的EST序列設(shè)計(jì)RACE引物，NlHRP-R與試劑盒中的通用引物用于5′ cDNA末端的快速擴(kuò)增，NlHRP-F與試劑盒中的通用引物用于3′ cDNA末端的快速擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃，1 min；25個(gè)循環(huán)（98 ℃，10 s；68 ℃，15 s；72 ℃，3 min）；72 ℃，5 min。

取第1輪PCR產(chǎn)物，進(jìn)行巢式PCR。NlHRP-inner-R、NlHRP-inner-F（表3）與試劑盒中的通用巢式引物用于第2輪巢式擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃，3 min；5個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；74 ℃，60 s）；5個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；72 ℃，60 s）；5個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；70 ℃，60 s）；25個(gè)循環(huán)（95 ℃，15 s；68 ℃，60 s）；68 ℃，5 min。最終得到的產(chǎn)物通過(guò)電泳切膠進(jìn)行回收純化，將回收純化產(chǎn)物連接到pESI-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)中，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，菌株送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4NlHRP的序列分析NlHRP-2開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)：NCBI ORFFINDER（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）；NlHRP蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：NCBI Conserved Domain Seach（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；NlHRP蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)：SignalP-5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）；NlHRP分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)：網(wǎng)站 Expasy（https://www.expasy.org/resources/protparam）；NlHRP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：網(wǎng)站 Psipred（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/&psipred_uuid=ef7ef9dc-e415-11ec-a6b3-00163e100d53）；NlHRP蛋白序列跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)：網(wǎng)站DETTAIBIO（http://www.detaibio.com/tools/transmembrane.html）。

1.3.5 褐飛虱不同組織和不同發(fā)育階段樣品收集 收集羽化24、72、96 h的褐飛虱雌蟲(chóng)，每個(gè)樣品4個(gè)生物學(xué)重復(fù)、每個(gè)重復(fù)至少含10頭蟲(chóng)，液氮處理后置于-80 ℃冰箱中保存。

用醫(yī)學(xué)顯微解剖鑷（5.SA）解剖褐飛虱雌蟲(chóng)的頭、胸、中腸、脂肪體、卵巢各組織，其中脂肪體放入RNA laterTMRNA Stabilization Reagent（Qiagen，Germany）中保存，其他組織放入液氮中保存。每個(gè)樣品4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少30個(gè)蟲(chóng)體組織，液氮處理后放于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.6NlHRP在褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期、不同組織中的表達(dá)分析 根據(jù)基因NlHRP預(yù)測(cè)的保守結(jié)構(gòu)域序列，通過(guò)NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。

將保存在-80 ℃冰箱中不同發(fā)育時(shí)期的褐飛虱與褐飛虱組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，稀釋至50 ng/μL。根據(jù)樣品收集情況，設(shè)計(jì)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)，Actin作為內(nèi)參基因，使用qNlHRP-F/qNlHRP-R和Actin-F/Actin-R進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，引物序列見(jiàn)表4。根據(jù)試劑盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，China）說(shuō)明書(shū)，在冰上配置qPCR混合液（表4）。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，擴(kuò)增程序如下：95 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s）；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，1 s。

表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 4 Reaction system of fluorescent quantitation PCR amplification

兩個(gè)實(shí)驗(yàn)種群間NlHRP表達(dá)量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因獲得

Venn圖顯示，KF30-14影響褐飛虱雌蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的基因中表達(dá)量差異顯著的共有基因31條，同時(shí)在雄蟲(chóng)與雌蟲(chóng)、若蟲(chóng)中有表達(dá)量差異顯著的共有基因4條（圖1）。通過(guò)對(duì)表達(dá)量有顯著差異的基因進(jìn)行分析，為選取與雌蟲(chóng)生殖相關(guān)的基因，在不含雄蟲(chóng)的雌蟲(chóng)與若蟲(chóng)的表達(dá)量顯著差異的 27條基因中進(jìn)行研究，并在后續(xù)試驗(yàn)中成功克隆出了基因NlHRP。

圖1 兩種水稻上的褐飛虱表達(dá)量差異顯著的基因Venn圖Fig.1 Venn diagram of genes with remarkably different expression between BPHs in the two rice

2.2 NlHRP的序列及表達(dá)模式

2.2.1NlHRP克隆及序列 經(jīng)過(guò)對(duì)NlHRP全長(zhǎng)序列克隆、測(cè)序、拼接，獲得了基因NlHRP完整的CDS序列（圖2）?？寺〉腘lHRP基因全長(zhǎng)905 bp，位于褐飛虱2號(hào)染色體上。使用NCBI ORFFINDER預(yù)測(cè)NlHRP的開(kāi)放閱讀框，ORF長(zhǎng)為837 bp，共編碼278個(gè)氨基酸。通過(guò)網(wǎng)站Psipred預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3），其中該蛋白包括ɑ-螺旋16.18%、β-折疊2.51%、無(wú)規(guī)則卷曲81.29%。用NCBI Conserved Domain Seach發(fā)現(xiàn)NlHRP編碼的蛋白無(wú)保守結(jié)構(gòu)域，用SignalP-5.0預(yù)測(cè)NlHRP蛋白的信號(hào)肽，預(yù)測(cè)氨基酸序列中1～19位氨基酸為該蛋白質(zhì)的N端信號(hào)肽序列。通過(guò)DETTAIBIO網(wǎng)站對(duì)蛋白序列中的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該蛋白可能是一個(gè)外分泌蛋白，利用信號(hào)肽來(lái)引導(dǎo)該蛋白定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間從而行使該蛋白的功能。經(jīng)過(guò)網(wǎng)站 Expasy預(yù)測(cè)，該基因編碼的蛋白分子量為31.4 kD，等電點(diǎn)為5.02。

圖2 NlHRP的核苷酸序列及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of NlHRP

圖3 NlHRP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.3 Prediction diagram of secondary structure of NlHRP protein

2.2.2NlHRP表達(dá)模式 在羽化24、72、96 h時(shí)，NlHRP在KF30-14實(shí)驗(yàn)種群的褐飛虱雌蟲(chóng)的表達(dá)量均高于MH86種群，且在羽化72 h時(shí)KF30-14實(shí)驗(yàn)種群的NlHRP表達(dá)量顯著高于MH86實(shí)驗(yàn)種群（圖4）。不同組織的表達(dá)譜分析結(jié)果表明，NlHRP在頭部、中腸、胸部都有較高的表達(dá)豐度，其中頭部表達(dá)量最高（圖5），且NlHRP在KF30-14實(shí)驗(yàn)種群褐飛虱頭部的表達(dá)量顯著高于MH86實(shí)驗(yàn)種群褐飛虱。

圖4 褐飛虱分別在羽化24、72、96 h時(shí)NlHRP的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of NlHRP in N.lugens at 24, 72 and 96 h after eclosion

圖5 NlHRP在褐飛虱不同組織中的表達(dá)量Fig.5 NlHRP expression in different tissues of N.lugens

3 討論

褐飛虱缺乏合成組氨酸等 10種必需氨基酸的能力，而褐飛虱的唯一食物來(lái)源——水稻韌皮部汁液，并不能提供這些必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]。研究人員對(duì)類(lèi)酵母共生體（YLS）基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，YLS保留了與宿主高度互補(bǔ)的氨基酸合成途徑，其基因組中存在必需氨基酸生物合成所需的所有基因，因此，YLS作為額外的供應(yīng)源，可以提供褐飛虱無(wú)法合成的必需氨基酸[17]。本研究中，我們獲得了褐飛虱的一種編碼富組氨酸蛋白的基因序列——NlHRP。KF30-14種群中羽化72 h的褐飛虱雌蟲(chóng)與MH86種群中羽化72 h的褐飛虱雌蟲(chóng)相比，NlHRP表達(dá)量顯著升高，而在兩個(gè)種群中的褐飛虱在羽化24 h與96 h時(shí)NlHRP表達(dá)量未達(dá)到顯著差異水平，而褐飛虱體內(nèi)的組氨酸是由YLS獨(dú)立合成[18-20]，Tang等[21]提出，細(xì)菌內(nèi)共生體也決定了稻飛虱種群對(duì)水稻品種的偏好。由于它們?cè)诘撅w虱營(yíng)養(yǎng)中的作用，類(lèi)酵母共生體（YLS）也被認(rèn)為在稻飛虱（褐飛虱）對(duì)抗性水稻品種的毒力適應(yīng)中發(fā)揮作用[22-24]，有研究人員發(fā)現(xiàn)在對(duì)褐飛虱具有抗性的轉(zhuǎn)基因水稻上取食的褐飛虱YLS密度高于常規(guī)水稻，且研究結(jié)果表明YLS密度會(huì)隨著水稻品種的抗性提高而升高[25]。故推測(cè)NlHRP蛋白的合成受YLS密度影響，而KF30-14種群的褐飛虱在羽化72 h時(shí)，NlHRP表達(dá)量顯著升高現(xiàn)象可能與YLS有關(guān)。

檢測(cè)NlHRP在羽化72 h的褐飛虱雌蟲(chóng)各組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示KF30-14種群中的褐飛虱頭部中NlHRP表達(dá)量顯著高于MH86種群，且NlHRP在頭部與胸部均出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，說(shuō)明NlHRP可能與褐飛虱神經(jīng)和降低肌肉氧化損傷有關(guān)[26]。

上述這些結(jié)果表明NlHRP與轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻的抗蟲(chóng)性有關(guān)，而NlHRP蛋白的功能及NlHRP表達(dá)量的變化與轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻的抗褐飛虱機(jī)理間的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。