王藝潔，徐文婷，楊立桃，梁晉剛

（1.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176）

人溶菌酶（Human lysozyme，hLZ）是一種糖苷水解酶，作為天然抗生素廣泛分布于淚液、唾液、血液、乳汁和其他分泌物中[1]，在宿主防御中發(fā)揮重要作用。體液中的溶菌酶保護機體，使其免受細(xì)菌的侵襲；而母乳中的溶菌酶可以傳遞給兒童，幫助他們建立先天免疫屏障。目前，溶菌酶已被證明具有抗細(xì)菌、真菌，抗炎癥，預(yù)防感染等功能[2-6]，已被用于食品工程中的防腐劑、乳品添加劑及炎癥治療等領(lǐng)域[7-9]。

溶菌酶天然存在于乳汁中，牛乳和山羊乳中僅含有0.130和0.250 μg/mL的溶菌酶，而人乳中含有400 μg/mL，其濃度是家畜乳汁的1600～3000倍[10]。受天然人溶菌酶的限制，隨著轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的發(fā)展，多種轉(zhuǎn)基因溶菌酶家畜被研發(fā)出來[11-15]，可在乳腺中表達(dá)大量的人溶菌酶。如Yu等[11]構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因溶菌酶山羊，最高可在羊乳中表達(dá)6.2 mg/mL的人溶菌酶；Jia等[14]構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因溶菌酶豬可在乳汁中表達(dá)0.320 μg/mL的溶菌酶，比天然豬生產(chǎn)的溶菌酶高50倍；Yang等[15]構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因溶菌酶牛可在乳汁中表達(dá)25.96 μg/mL重組溶菌酶。

由于轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的快速發(fā)展及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的需求，2017年我國制定了《轉(zhuǎn)基因動物安全評價指南》，其中除了分子特征、遺傳穩(wěn)定性等評價內(nèi)容外，還包括轉(zhuǎn)基因動物對環(huán)境的影響等內(nèi)容[16,17]。轉(zhuǎn)基因動物對環(huán)境的影響，如基因水平轉(zhuǎn)移等不可忽視[18]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)土壤、水、糞便、尿液及唾液中存在果蠅、老鼠和脂鯉等轉(zhuǎn)基因動物的人工序列殘留[19]。同時，公眾對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全性仍存在擔(dān)憂，需要對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行明確標(biāo)識[20]。因此，轉(zhuǎn)基因動物的環(huán)境安全評價和標(biāo)識管理都需要建立可靠、靈敏的檢測技術(shù)和方法。

轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的檢測方法根據(jù)檢測對象分為核酸檢測方法和蛋白質(zhì)檢測方法兩類。核酸檢測方法因為檢測靈敏度高，穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測。根據(jù)檢測靶序列的不同，核酸檢測方法可以被分為四類，分別是通用元件、基因特異性、構(gòu)建特異性及品系特異性。其中，品系特異性也被稱為轉(zhuǎn)化事件特異性，其檢測的靶標(biāo)序列包括外源DNA和外源基因整合位點兩側(cè)的受體基因組序列，品系特異性檢測的特異性最高[21]。根據(jù)擴增技術(shù)和產(chǎn)物檢測方法的不同，核酸檢測方法還可以分為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、多重PCR、實時定量PCR[22]、微滴式數(shù)字PCR[23]。微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是將每個DNA分子分配到獨立的油包水反應(yīng)微滴中，通過PCR擴增后，根據(jù)泊松分布的原理，統(tǒng)計陽性微滴個數(shù)和比例來實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。ddPCR可檢測出低拷貝痕量樣本，靈敏度極高，且無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此相較于傳統(tǒng)PCR和定量PCR存在明顯優(yōu)勢[24]。

在轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊的監(jiān)管中，主要是針對轉(zhuǎn)基因動物本身和其生產(chǎn)的產(chǎn)品，如羊奶、羊奶制品等。針對這些制品的檢測，目前的熒光定量PCR技術(shù)存在靈敏度低、依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等缺點。因此，本研究利用數(shù)字PCR技術(shù)，開發(fā)了一種轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊品系特異性定量檢測方法。并將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊樣品及其環(huán)境樣本的檢測，從而為轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識、遺傳穩(wěn)定性、基因水平轉(zhuǎn)移等環(huán)境安全評價提供高靈敏的檢測新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

G0代轉(zhuǎn)人溶菌酶基因山羊（hLZ-J1）是由上海轉(zhuǎn)基因研究中心和上海杰隆生物工程股份有限公司通過體細(xì)胞克隆技術(shù)開發(fā)的，并由G0代繁育出F1～F8代[11]。從轉(zhuǎn)基因山羊hLZ-J1品系的后代共采集5份頸動脈血液樣本（編號為B254，B325，B490，B514，B241），2份羊乳樣本（編號為M221，M141），5份羊糞樣本（編號為F1～F5）及4份轉(zhuǎn)基因羊羊圈的土壤樣本（編號為S1～S4）。從非轉(zhuǎn)基因山羊中采集1份頸動脈血液樣本（編號為B222），2份羊乳樣本（編號為M388，M262），1份羊糞樣本（編號為F6）及1份非轉(zhuǎn)基因山羊羊圈土壤樣本（編號為S5）。轉(zhuǎn)基因人乳清蛋白（hSA）山羊，轉(zhuǎn)基因阮病毒（PRNP）敲除山羊，轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白（hLF）山羊的血液樣本由上海杰隆公司提供。

1.2 DNA提取

使用TIANamp Genomic DNA Kit（DP304，TIANGEN Biotech，北京）從200 μL血液或2 mL羊乳樣本中提取DNA。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（51604，QIAGEN，上海）從500 mg糞便樣本中提取糞便DNA。使用DNeasy Power Soil Kit（142579，QIAGEN，上海）從500 mg土壤樣品中提取土壤DNA。使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，Waltham Mass，MA）對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量評估和濃度測定。提取的DNA在-20 ℃冰箱冷凍儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 數(shù)字PCR引物探針設(shè)計與合成

基于品系特異性檢測原理，根據(jù)轉(zhuǎn)基因羊hLY-J1的品系特異性序列，使用軟件Beacon Designer 8設(shè)計引物和探針，序列見表1和圖1。山羊催乳素受體基因（PRLR）為內(nèi)源性參考基因，其引物和探針（表1）來自本實驗室已發(fā)表的研究[25]。本研究所用的引物和探針均訂購自Invitrogen（上海）公司。

表1 引物和探針序列Table 1 The sequence of primers and probes

圖1 轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊hLZ-J1品系特異性引物和探針的信息和位置示意圖Fig.1 Schematic information and location of the event-specific primers and probe for GM event hLZ-J1

1.4 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR的反應(yīng)體積為25 μL，含有2×Hieff PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，10 ng基因組DNA模板，用ddH2O補齊25 μL。PCR程序：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。常規(guī)PCR擴增的片段大小為101 bp。

1.5 微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）反應(yīng)

ddPCR試驗在Bio-Rad公司的QX200微滴式數(shù)字PCR儀上完成。整個試驗包括ddPCR反應(yīng)體系配制、微滴生成、PCR擴增反應(yīng)及熒光信號讀取 4個步驟。反應(yīng)體系配置：于冰上加入 2×ddPCR Supermix（1863024，Bio-Rad）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，1 μL DNA 模板和6.5 μL ddH2O，補足20 μL ddPCR反應(yīng)體系。微滴發(fā)生：將ddPCR反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡的小孔中，于發(fā)生卡下方一排小孔中加入微滴發(fā)生油70 μL，蓋上膠墊后，放入Bio-Rad QX200微滴生成儀中制備微滴。ddPCR擴增：將微滴通過移液器轉(zhuǎn)移至96孔板中，使用配套鋁膜熱封。放入常規(guī)PCR儀反應(yīng)，擴增程序為95 ℃ 5min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40個循環(huán)；98 ℃ 10 min。熒光信號讀?。簩U增后的96孔板轉(zhuǎn)移至BIO-RAD QX200 Droplet Reader儀器中讀取，使用配套軟件QuantaSoft分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性驗證試驗

為了驗證轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊hLZ-J1品系特異性ddPCR檢測方法（后文簡稱“本方法”）的特異性，以轉(zhuǎn)基因人溶菌酶山羊hLZ-J1、轉(zhuǎn)基因人乳清蛋白山羊、轉(zhuǎn)基因阮病毒敲除山羊、轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白山羊和非轉(zhuǎn)基因山羊的血液樣本DNA為模板，分別利用常規(guī)PCR和ddPCR進(jìn)行測試。在常規(guī)PCR分析中，使用ddPCR引物對以上樣本進(jìn)行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1為模板的反應(yīng)得到長度為101 bp擴增子，而轉(zhuǎn)基因人乳清蛋白山羊、轉(zhuǎn)基因阮病毒敲除山羊、轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白山羊、非轉(zhuǎn)基因山羊及H2O未發(fā)生擴增（圖2A），說明該引物具有良好的特異性。在ddPCR反應(yīng)中，所有樣本均有高質(zhì)量微滴生成，微滴數(shù)在 11980～14216。轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1有陽性微滴生成，且陽性微滴和陰性微滴界限分明，而轉(zhuǎn)基因人乳清蛋白山羊、轉(zhuǎn)基因阮病毒敲除山羊、轉(zhuǎn)基因人乳鐵蛋白山羊、非轉(zhuǎn)基因山羊和H2O均無陽性微滴生成（圖2B），說明設(shè)計的引物、探針特異性好，建立的方法可以特異性地檢測轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1的成分。

圖2 PCR和ddPCR驗證方法的特異性Fig.2 Specificity evaluation using conventional PCR and ddPCR

2.2 方法靈敏度及可重復(fù)性試驗

為了研究本方法的適用性，分別對方法的靈敏度、穩(wěn)定性和可靠性進(jìn)行了測試。利用梯度稀釋法，將轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1血液DNA溶液分別稀釋為7個不同濃度（6000、600、60、30、15、10和5拷貝/μL）的DNA稀釋液，分別作為模板進(jìn)行ddPCR分析測定，每個反應(yīng)設(shè)置3個重復(fù)。試驗結(jié)果如表2所示，7個濃度樣品的hLZ-J1拷貝數(shù)分別為6693.33、657.33、65.00、26.67、16.47個拷貝，測定值與理論值接近，拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）介于0.46～70.24，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）介于1.05%～12.87%，均在可接受范圍內(nèi)（小于25%）。且隨著DNA模板濃度的增加，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，越準(zhǔn)確。上述結(jié)果表明本方法的可重復(fù)性好，可用于轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1成分的檢測。

表2 品系特異性ddPCR方法的靈敏度及可重復(fù)性分析Table 2 Sensitivity and repeatability evaluation of the event-specific ddPCR assay

根據(jù)圖3微滴生成結(jié)果顯示，從每反應(yīng)模板6000拷貝到15拷貝的樣本均產(chǎn)生陽性微滴，且陽性微滴和陰性微滴區(qū)分明顯。其中，反應(yīng)模板為15拷貝時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.87%；反應(yīng)模板為10拷貝時，未檢測到陽性微滴。因此可以確定，本方法的檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）均為每反應(yīng)15個拷貝。因此，當(dāng)反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1的基因組DNA大于15個拷貝時，均能實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

圖3 轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1品系特異性ddPCR靈敏度試驗Fig.3 Sensitivity evaluation of the event-specific ddPCR assay of transgenic goat hLZ-J1

2.3 實際樣本的檢測

我們進(jìn)一步利用本方法對四類實際樣本進(jìn)行定量檢測，評估方法的適用性。四類實際樣本分別是血液、羊乳、糞便和土壤，具體包括6個血液樣本、4個羊乳樣本、6個山羊糞便樣本和5個山羊羊圈環(huán)境土壤樣本，所有樣本測試均重復(fù)3次。檢測結(jié)果如表3所示，在羊血樣本中，B254，B325，B490，B514，B241的hLZ-J1拷貝數(shù)分別為4863.33、7490、4496.67、5020、6886.67個拷貝，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.35%～2.02%，山羊內(nèi)源基因拷貝數(shù)分別為4753.33、7406.67、4450.00、4896.67、6516.67個拷貝，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.31%～2.51%，結(jié)果說明這些血液樣本均來自轉(zhuǎn)基因羊 hLZ-J1，且溶菌酶外源基因能在其后代中穩(wěn)定遺傳。在B222血液樣本的檢測中，山羊內(nèi)源基因拷貝數(shù)為7683.33個拷貝，RSD為0.49%，檢測不到hLZ基因，說明B222不來源于轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1。

表3 實際的血液、羊乳、糞便和土壤樣本ddPCR檢測結(jié)果Table 3 ddPCR results of practical samples of blood, milk, fecal, and soil

在羊乳樣本的檢測中，M221和M141的hLZ-J1拷貝數(shù)分別為874和698個拷貝，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.43%和2.35%；內(nèi)源基因拷貝數(shù)分別為861.33和778.00個拷貝，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.51%和2.20%，說明這些羊乳來自轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1。在M388、M262中檢測到山羊內(nèi)源基因含有812.67、694.67個拷貝，RSD分別為1.02%和1.01%，但是檢測不到轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1的成分，說明M388、M262中不含轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1羊乳的成分。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因山羊hLZ-J1羊乳樣品中普遍存在基因組DNA，可能來源于乳腺中脫落的體細(xì)胞。

在山羊糞便樣本的檢測中，樣本 F3、F4、F6均觀察到山羊內(nèi)源基因的擴增，分別為 15.53、20.20、19.87個拷貝，其微弱的陽性信號說明糞便中可能含有山羊消化道脫落細(xì)胞。在這三個樣本中，僅有F3和F4檢測到hLZ-J1的擴增，拷貝數(shù)分別為16.4和17.93個拷貝，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為10.42%和12.68%，這兩個樣品的hLZ-J1拷貝數(shù)均在定量限附近，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于25%，說明F3和F4糞便樣本均來自轉(zhuǎn)基因山羊hLZ-J1。除此之外，在其他糞便樣本（F1、F2和F5）中，均檢測到hLZ-J1和羊內(nèi)源基因的擴增。這些結(jié)果表明，部分羊糞便樣本可以檢測出羊基因組DNA和轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1基因組DNA，這部分DNA可能源于羊腸道脫落的細(xì)胞。

在5個羊圈環(huán)境土壤樣本中，均未檢測到羊內(nèi)源基因成分和hLZ-J1轉(zhuǎn)基因成分，表明轉(zhuǎn)基因山羊的羊圈環(huán)境土壤樣本中不存在羊和轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1的基因組DNA殘留。糞便和土壤樣本的檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1基因組DNA在消化道和羊圈環(huán)境土壤中未發(fā)生可以觀測到的基因水平轉(zhuǎn)移。

3 討論

本研究建立了一種轉(zhuǎn)基因人溶菌酶山羊品系特異性微滴數(shù)字PCR檢測方法。該方法具有良好的特異性和靈敏度。方法的檢測限和定量限均達(dá)到每反應(yīng)15個拷貝，且反應(yīng)重復(fù)性好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.87%，滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分定量檢測方法的要求。本方法與實驗室以前開發(fā)的轉(zhuǎn)基因溶菌酶羊qPCR檢測方法相比[26]，具有更高的靈敏度。同時，建立的 ddPCR方法不需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以對樣本進(jìn)行定量，更加便捷。本方法的建立為轉(zhuǎn)基因羊hLZ-J1的鑒定、遺傳穩(wěn)定性評估、環(huán)境安全評價提供了可靠的技術(shù)支持。

隨著轉(zhuǎn)基因動物的研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，其對環(huán)境的影響逐漸引起廣泛關(guān)注。例如，轉(zhuǎn)基因動物 DNA是否會通過糞便、皮膚細(xì)胞、尸體分解及其他方式轉(zhuǎn)移到環(huán)境中；轉(zhuǎn)基因動物逃逸是否會將外源基因引入非預(yù)期的種群和物種中等問題。目前研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因DNA在自然環(huán)境中留存的時間遠(yuǎn)超出預(yù)期，已有部分研究報道轉(zhuǎn)基因植物的DNA在環(huán)境樣本里可以被檢測到[27]，且在不同自然環(huán)境中的留存時間也不盡相同，例如，在水生環(huán)境中可以保存數(shù)小時至數(shù)天，在陸地土壤環(huán)境中可以存在數(shù)天至數(shù)年[28]。但目前對于轉(zhuǎn)基因動物DNA的水平轉(zhuǎn)移研究甚少，人們對轉(zhuǎn)基因動物DNA的傳播及對生態(tài)的影響還存在較大的疑慮。本研究通過對糞便和土壤實際樣本的檢測，說明部分糞便中存在痕量轉(zhuǎn)基因羊 hLZ-J1品系特異性序列DNA，可能來自于消化道脫落細(xì)胞。但在土壤中未檢測出轉(zhuǎn)基因DNA成分，盡管山羊消化道的脫落細(xì)胞可能存在于糞便當(dāng)中，但糞便沉積在土壤中，戶外環(huán)境能夠迅速降解 DNA。因此，轉(zhuǎn)基因動物基因組DNA無法在環(huán)境中長期存在，進(jìn)而在土壤微生物間發(fā)生轉(zhuǎn)基因DNA的基因水平轉(zhuǎn)移。