段云鵬，姚 雪，李 品，王萌涵，胡守印，胡恩靜，劉永剛，楊淑芳，魏紀珍

（河南農業(yè)大學植物保護學院/河南省害蟲綠色防控國際聯合實驗室，鄭州 450002）

轉基因作物表達蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（Bt）殺蟲基因是迄今為止生物技術對農業(yè)害蟲防治的最重要貢獻。Bt作物已在29個國家廣泛種植，全球面積超過1億公頃，占全球轉基因作物種植面積的53%[1]。盡管轉Bt作物在全球得到了廣泛的種植，但是有關Bt殺蟲蛋白的作用機制和昆蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性機制還沒有被完全解析。更為嚴重的是，抗性問題日益突出，近年來報道的昆蟲抗性和田間防治失敗的案例也在持續(xù)增加[2-4]。Cry1Ac作為最重要的Bt殺蟲基因之一，最先在作物中表達，用于防治棉鈴蟲等鱗翅目害蟲。目前，第一代轉Cry1Ac基因棉花已在我國種植了26年，盡管有“天然庇護所”的保護，田間棉鈴蟲種群對Cry1Ac的抗性也在顯著增加[5-7]。因此，需要對Bt殺蟲蛋白的作用機制和抗性機理進行更加深入的研究。

前期對Bt殺蟲蛋白，尤其Cry1類蛋白受體和昆蟲對Cry1類蛋白的抗性機制研究表明，其主要功能受體包括鈣黏蛋白（cadherin）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）、氨肽酶（aminopeptidases-N）、三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白C2（ATP binding cassette subfamily C member 2，ABCC2）和三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白 C3（ABCC3）等[8-12]。近些年來的研究通過雙向電泳等方法也表明 V-ATPase亞基蛋白可以與Bt蛋白結合[13-15]，而且V-ATPase參與Bt的作用過程[16]，甚至改變V-ATPase的表達能夠引起昆蟲對Bt的耐性[17]。這說明V-ATPase亞基蛋白可能作為Bt的作用靶標正在逐步的被我們認識。

V-ATPase是一種在真核生物中進化古老的，高度保守的酶，存在于許多細胞器的膜中，如核內體、溶酶體和分泌囊泡，它們在這些細胞器的功能中發(fā)揮著各種重要作用[18]。它可以使細胞內的很多細胞器酸化，偶聯ATP水解的能量，通過細胞內和真核細胞的質膜質子運輸。這類酶的研究目前在其結構、功能、規(guī)律以及體外機制的闡述方面取得了巨大的進步，很多貢獻歸因于在昆蟲中的研究[19]。在昆蟲中V-ATPase是一種多亞基組成的膜結合復合酶體[15]，是昆蟲中腸上皮細胞 H+離子轉運體[16]。大量的證據表明昆蟲的V-ATPase在Cry蛋白毒性中發(fā)揮作用[13,15,20-23]。鑒于其分布和功能的多樣化，以及與Bt的作用關系，迫切地需要發(fā)現和驗證V-ATPase亞基蛋白在Bt的作用機制和抗性機制中的作用。

我們在前期的研究中通過構建棉鈴蟲的中腸酵母文庫篩選 Cry1Ac的結合蛋白中發(fā)現，棉鈴蟲 VATPase B可以與Cry1Ac結合，這與鄒朗云等[24]報道的V-ATPase B可以與Cry1Ac結合的結果一致。VATPase B作為Cry1Ac的結合蛋白是否參與Cry1Ac的毒力過程還沒有得到證實。本研究首先采用實時熒光定量PCR技術分析該基因在抗感Cry1Ac棉鈴蟲幼蟲及其受到Cry1Ac誘導時的表達情況；通過配體雜交 Ligand blot進一步地證實了其與 Cry1Ac的結合特性；通過在昆蟲細胞中過表達該基因驗證了其對Cry1Ac毒理的影響。本研究證實了V-ATPase B是Cry1Ac的功能受體，這為進一步研究V-ATPase B的Bt作用方式和在抗性機制中的作用，以及昆蟲對Bt的抗性治理等提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 敏感品系（JY）棉鈴蟲購于河南省濟源白云實業(yè)公司，抗性品系（LF60）棉鈴蟲由中國農業(yè)科學院植物保護研究所饋贈，該品系對Cry1Ac的抗性高于1000倍[25]，兩種品系棉鈴蟲均在培養(yǎng)箱中使用人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃、相對濕度（60±10）%、光周期16L∶8D。

1.1.2 細胞系及細胞培養(yǎng)基 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda卵母細胞系（Sf9）為美國亞利桑那大學饋贈，培養(yǎng)在（28±1）℃的培養(yǎng)箱中[26]。Sf-900TMⅡ SFM培養(yǎng)基，含10%熱激失活牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 Cry1Ac原毒素與活化毒素均購于北京綻諾思特生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒HiScript?RT SuperMix for qPCRⅢ（+gDNA wiper）、DNA聚合酶（2×Taq Master Mix）、PCR產物回收試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、熒光定量PCR反應試劑盒（ChamQTM Universal SYBR?qPCR Master Mix）、質粒DNA小量提取試劑盒，購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)細胞DH5α，購于北京擎科生物有限公司；大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司；氨芐青霉素、臺盼藍染色液、20×PBS緩沖液、高效RIPA裂解液（含一支PMSF）、PAGE膠蛋白微量回收試劑盒、牛血清白蛋白V（BSA）、5×蛋白上樣緩沖液，購于北京索萊寶科技有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、BagⅡ酶，購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；超敏型ECL發(fā)光液，購于亞科因（武漢）生物技術有限公司；蛋白電泳凝膠制備試劑盒，購于陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；轉染試劑，購于普洛麥格（北京）生物技術有限公司；鼠抗His-Tag單克隆抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體，購于亞科因（武漢）生物技術有限公司；His標簽的pIEx-RFP載體由山東大學饋贈；增強綠色熒光蛋白EGFP，其序列參考[27]方法設計合成并由本實驗室保存；其他化學試劑均為國產分析純。NANODROP 1000全波長微量掃描分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產；Tanon 4600化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司生產；DYY-3C電泳儀，北京六一儀器廠生產；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司生產；Mastercycle Pro S型PCR儀，Centrifuge5417R型臺式離心機，德國Eppendorf公司生產；ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司生產。

1.2 樣品制備和cDNA合成

分別選取齡期及大小一致的敏感與抗性棉鈴蟲，收集3～5齡幼蟲各5～10頭，比較其不同發(fā)育時期不同品系中腸V-ATPase B的表達量。選取大小一致的4齡末期棉鈴蟲，獨立置于24孔養(yǎng)蟲盒中饑餓處理12 h后，飼喂含50 mmol/L Na2CO3緩沖液的人工飼料[27]作為對照組，同時飼喂含25 μg/mL Cry1Ac原毒素（LC30）[26]的人工飼料，在樣品取食3、6、12、24和36 h時，每個重復取4～5頭樣品，解剖取其中腸，共3個生物學重復，Cry1Ac誘導后，比較不同時間點V-ATPase B基因的表達量。

利用RNA提取試劑盒在冰上分別提取各處理樣品總RNA，使用DEPC水調整濃度并使用反轉錄試劑盒合成cDNA模板用于后續(xù)試驗。

1.3 載體構建

以棉鈴蟲cDNA為模板，利用特異性引物V-ATPase B-CDS-F/R（表1）對V-ATPase B基因編碼區(qū)（sequence coding for aminoacids in protein，CDS）（登錄號：XM_021331943.1）擴增，本試驗中所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。50 μL PCR反應體系和擴增條件參考[27]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μL PCR產物，純化產物并將片段連接至克隆載體。用熱激法將5 μL重組產物轉入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經氨芐青霉素的抗性篩選，獲得陽性重組子并進行菌落PCR驗證。PCR擴增條件參考[27]。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μL產物后，將陽性克隆菌液注入5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，提取質粒并由北京擎科生物科技有限公司測序。

以克隆載體為模板，利用兩對特異性引物 V-ATPase B-SacⅠ和 V-ATPase B-BagⅡ；V-ATPase BEcoRⅠ和V-ATPase B-XhoⅠ對V-ATPase B基因編碼區(qū)擴增，50 μL PCR反應體系與擴增條件參考文獻[27]。用5×Loading Buffer和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μL PCR產物，純化產物并將片段分別連接至表達載體pIEx-RFP與pGEX-6P-1。用熱激法將5 μL重組產物轉入50 μL DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經氨芐青霉素的抗性篩選，獲得陽性重組子并進行菌落PCR驗證。PCR擴增條件同上。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測5 μL產物后，將陽性克隆菌液注入5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，提取質粒并由北京擎科生物科技有限公司測序。

1.4 熒光定量RT-PCR反應

用特異性引物q-V-ATPase B-F/R對不同品系、不同齡期、不同處理后組織的V-ATP-B基因表達量檢測，以EF-1α（U20129.1）和β-actin（HM629442.1）為內參基因設計內參引物 EF-1α-F/R和β-Actin-F/R（表1）。20 μL PCR反應體系與程序參考文獻[27]。每組處理有3組生物學重復，每組生物學重復設置3組技術重復。用擴增效率和循環(huán)數的平均數計算所有基因的表達水平，采用2―△△Ct方法分析試驗結果[28]。

表1 本研究所用引物信息Table 1 List of primers in this study

1.5 細胞轉染和毒理測定

Sf9細胞系使用Sf-900TMⅡ SFM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉染細胞并在轉入24 h后觀察轉入pIEx-RFP和V-ATPase B-pIEx-RFP細胞并拍照[27]。轉染48 h后收集細胞并用細胞計數板計數，使用96孔細胞培養(yǎng)板每孔接種100 μL（含1×104個細胞），置于（28±1）℃培養(yǎng)箱中貼壁生長2 h；在倒置顯微鏡200倍視野下，每孔選擇兩個獨立視野，記錄Cry1Ac活化毒素處理前的細胞存活數量。去除含抗生素和血清的培養(yǎng)基，加入100 μL含有200 μg/mL Cry1Ac活化毒素且無血清及抗生素的細胞培養(yǎng)基，置于（28±1）℃培養(yǎng)箱中處理5 h；記錄存活細胞數[27]，收集剩余細胞用于后續(xù)試驗。每次毒理測定重復3次，每組獨立重復轉染3次。死亡率的計算采用Abbott公式，死亡率＝（處理前細胞數目―處理后細胞數目）/處理前細胞數目×100%[29]。

1.6 V-ATPase B蛋白的提取與Western-blot鑒定

將轉染后的細胞收集并500 g/min離心3 min，用1 mL 1×PBS緩沖液清洗沉淀兩次，再次離心保留沉淀，加入高效RIPA裂解液100 μL、終濃度為1 mmol/L PMSF、5×蛋白上樣緩沖液25 μL并混勻，沸煮5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據蛋白電泳凝膠制備試劑盒說明書配置SDS-PAGE膠，并通過凝膠電泳檢測目的蛋白的表達。將目的蛋白轉到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；加入1∶2000稀釋的His標簽小鼠單克隆抗體（一抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，加入1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，使用化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)儀器拍照。

1.7 V-ATPase B蛋白的誘導、純化與Ligand-blot驗證結合

將V-ATPase B-pGEX-6P-1質粒轉化表達菌株Rosetta（DE3）。通過氨芐青霉素篩選后，挑取單菌落，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，當菌液OD600約為0.6時，取1 mL菌液加入終濃度30%的甘油保存，取400 μL誘導前菌液于4 ℃冰箱保存，剩余菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃，180 r/min誘導4 h。取400 μL誘導后菌液，與誘前菌液6000 r/min離心3 min，棄上清用100 μL 1×PBS重懸，加入25 μL蛋白上樣緩沖液，沸煮5 min后于冰上備用。

根據蛋白電泳凝膠制備試劑盒說明書配置 SDS-Page膠，并通過凝膠電泳檢測目的蛋白的表達。蛋白膠脫色后，使用膠回收試劑盒，回收純化蛋白，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

用純化后的蛋白加入終體積0.25倍的蛋白上樣緩沖液，沸煮5 min，同上配置SDS-Page膠，并通過凝膠電泳展現目的蛋白。將目的蛋白轉到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜；加入終濃度2 μg/mL Cry1Ac活化毒素，孵育2 h，1×PBST緩沖液洗脫5次，加入1∶10000稀釋的Cry1A抗體（一抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，加入1∶10000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h；1×PBST緩沖液洗脫5次，使用化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)儀器拍照。

1.8 數據統(tǒng)計與分析

數據使用Excel 2019軟件進行統(tǒng)計分析，不同處理間的比較采用單因素方差分析，采用t檢驗法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 V-ATPase B基因在Cry1Ac抗感棉鈴蟲品系中的表達差異

熒光定量PCR檢測結果表明，V-ATPase B基因在3、4、5齡棉鈴蟲各齡期中腸均有表達，并且其在敏感品系JY的表達量均顯著高于同齡期抗性品系LF60中的表達量（3齡中P＝0.00001，4齡中P＝0.02045，5齡中P＝0.00531，圖1）。

圖1 V-ATPase B基因在抗感Cry1Ac棉鈴蟲中表達差異Fig.1 The expression level of V-ATPase B in Cry1Ac-susceptible and -resistance Helicoverpa amigera

2.2 V-ATPase B基因響應Cry1Ac刺激下調表達

棉鈴蟲5齡幼蟲取食含有亞致死劑量25 μg/mL的Cry1Ac原毒素后，中腸組織中V-ATPase B基因表達量顯著降低。從取食3 h后一直到36 h，棉鈴蟲中腸中V-ATPase B表達量持續(xù)顯著下降（3 h時P＝0.00480，6 h時P＝0.00002，12 h時P＝0.00013，24 h時P＝0.00003，36 h時P＝0.00001，圖2）。

圖2 5齡棉鈴蟲幼蟲取食Cry1Ac后的V-ATPase B基因表達量Fig.2 The expression level of V-ATPase B of the 5th-instar Helicoverpa amigera larvae fed with Cry1Ac

2.3 Ligand blot驗證V-ATPase B與Cry1Ac結合

通過原核表達V-ATPase B蛋白，經SDS-PAGE梯度膠電泳檢測，V-ATPase B蛋白在80.8 kDa處表達（基因54.9 kDa＋標簽蛋白25.9 kDa），結果表明V-ATPase B被成功誘導表達（圖3A）。進一步地對原核表達的V-ATPase B蛋白進行純化，基本得到一條明顯單一的V-ATPase B蛋白（圖3B）。然后通過Ligand blot試驗證實顯示V-ATPase B可以與Cry1Ac活化毒素特異結合（圖3C）。說明V-ATPase B可能為Cry1Ac活化毒素受體結合蛋白。

圖3 V-ATPase B蛋白的表達純化及與Cry1Ac的結合特性Fig.3 Expression and purification of V-ATPase B protein and its binding properties with Cry1Ac

2.4 V-ATPase B的亞細胞定位

將V-ATPase B-pIEx-RFP和pIEx-RFP質粒分別轉染Sf9細胞。熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光，說明相應蛋白已成功表達于細胞中，V-ATPase B蛋白主要定位在細胞質中，在細胞核中沒有表達（圖4）。

圖4 V-ATPase B在細胞內的表達和定位Fig.4 The expressions and localization of V-ATPase B in cells

2.5 表達V-ATPase B蛋白增強了Cry1Ac的細胞毒力

在觀察到V-ATPase B蛋白的表達后，進一步通過Western blot確定了V-ATPase B蛋白在細胞內的表達（圖5A）。隨后，用終濃度為 200 μg/mL Cry1Ac活化毒素處理細胞，Sf9細胞的死亡率顯著提高（P＝0.03233，圖5B）。結果表明，過表達V-ATPase B可以增加細胞對Cry1Ac的敏感性。

圖5 表達V-ATPase B對Sf9細胞毒性的影響Fig.5 Effects of overexpression of V-ATPase B on the cytotoxicity in Sf9 cells

3 討論

本研究中我們發(fā)現V-ATPase B基因在Cry1Ac抗性品系中低表達（圖1），盡管本研究中是用LF60的抗性品系跟濟源購買的敏感品系（據了解近些年采于田間）相比的，但是V-ATPase B基因在室內篩選的BtR抗性品系中也顯著降低表達[24]，這進一步說明了V-ATPase B基因在抗性品系中低表達是普遍存在的。此外在受到Cry1Ac誘導時，V-ATPase B基因也下調表達，這跟很多V-ATPase B基因在受到Bt誘導時低表達的結果一致[30-32]。因此V-ATPase B基因可能作為功能受體參與棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性，機體通過降低V-ATPase B基因的表達來減少Cry1Ac對昆蟲的傷害。

V-ATPase B作為Bt的結合蛋白已經被廣泛報道，例如Qiu等[16]報道甜菜夜蛾Spodoptera exigua的V-ATPase B可以與Cry2Aa結合；Xie等[33]報道小菜蛾Plutella xylostella的V-ATPase B和Cry1Ac具有結合特性。鄒朗云等[24]也通過Ligand blot證實棉鈴蟲的V-ATPase B可以與Cry1Ac、Cry2Ab和Cry1C結合。我們通過構建棉鈴蟲的中腸酵母文庫篩選Cry1Ac的結合蛋白，也篩選到了結合蛋白V-ATPase B（未發(fā)表數據），在本研究中也進一步地通過Ligand blot證實棉鈴蟲V-ATPase B可以與Cry1Ac結合（圖3）。上述研究多方證實了V-ATPase B是Cry1Ac的結合蛋白。然而，我們對V-ATPase B的亞細胞定位研究表明其主要分布在細胞質中（圖4），這與其他研究報道V-ATPase B基因主要存在于細胞內許多細胞器的膜中的結果一致[18]。但是已報道的Bt蛋白的受體多位于細胞膜上，我們分析盡管V-ATPase B在胞內分布卻能與Bt蛋白結合的原因，可能與之前我們推測的ATPs-α與Cry2Ab蛋白互作的方式一樣[27]。一方面據報道Cry1Ac的部分結構可以插入膜內[35]，這些結構可能與膜內的受體，如V-ATPase B結合。此外，整個活化的Cry蛋白可以透過細胞膜進入細胞質[36,37]，進而與細胞質內分布的V-ATPase B結合?？傊?，綜合文獻和我們的研究結果表明棉鈴蟲V-ATPase B是Cry1Ac的一個結合蛋白。

V-ATPase B蛋白不但是Bt殺蟲蛋白的結合蛋白，它也參與Bt的毒力過程。Qiu等[16]報道了甜菜夜蛾的V-ATPase B不僅與Cry2Aa結合，而且通過RNAi干擾V-ATPase B能顯著降低甜菜夜蛾對Cry2Aa的敏感度。此外，敲除二化螟Chilo suppressalis幼蟲的V-ATPase A基因導致二化螟幼蟲對表達Cry2Aa和Cry1Ca水稻的敏感性顯著降低[38]。本研究中，我們通過在昆蟲細胞系中過表達棉鈴蟲V-ATPase B基因，發(fā)現細胞對Cry1Ac的敏感度增強（圖5），這一結果證實棉鈴蟲V-ATPase B參與了Cry1Ac的毒力過程。這是我們首次報道V-ATPase B在Cry1Ac毒力過程的功能。由于V-ATPase B基因在抗性品系中低表達，同時V-ATPase B蛋白與Cry1Ac結合，我們推測棉鈴蟲V-ATPase B是Cry1Ac的功能受體。但是關于V-ATPase B在棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性機制中的作用和貢獻還有待進一步的研究。