陸秉文 胥 靜 謝立科 楊 強

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(RVO)是繼糖尿病視網(wǎng)膜病變后第二位常見視網(wǎng)膜血管病變，由于組織缺血、缺氧常引起黃斑水腫及視網(wǎng)膜新生血管病變，RVO是當前主要的致盲性眼病之一[1]。RVO發(fā)病機制尚不清楚，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在其中起著重要作用，玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物是目前西醫(yī)治療RVO繼發(fā)黃斑水腫的主要手段[2]。然而，抗VEGF藥物治療后黃斑水腫易反復發(fā)作，且價格昂貴，頻繁注射不僅增加患者發(fā)生眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜萎縮等的風險，更加重患者的經(jīng)濟負擔。因此，尋找一種安全有效、價格低廉，更適用于臨床治療RVO的藥物顯得至關重要。

青蒿琥酯(Art)是青蒿素的衍生物之一，除抗瘧作用外，還同時具有抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抑制血管增生等作用[3]。前期有關研究報道，Art能夠通過下調(diào)VEGF表達抑制兔虹膜和視網(wǎng)膜新生血管形成[4]。且研究發(fā)現(xiàn)，Art通過調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路抑制腫瘤血管新生[5]。然而，目前有關Art在RVO治療方面的研究鮮有報道。我們前期針對RVO致病原因、RVO繼發(fā)黃斑水腫發(fā)病機制、Art潛在作用靶點及Art治療RVO繼發(fā)黃斑水腫的效果進行了探討[6]。本研究通過532 nm激光建立大鼠視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO)模型，觀察Art對BRVO的干預作用，以及對HIF-1α/VEGF信號通路的影響，進一步探討Art治療RVO的分子機制，以期為臨床治療RVO提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組取SPF級雌性Wistar大鼠(6～8周齡)150只，體重(200±20)g，眼前節(jié)、眼底檢查無異常，大鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。飼養(yǎng)條件：溫度(22±1)℃，濕度60%～70%，光照12 h明暗交替。適應性飼養(yǎng)1周后，將動物隨機分為6組，每組25只，右眼為實驗眼：空白對照組、模型對照組(玻璃體內(nèi)注射生理鹽水)、康柏西普組(玻璃體內(nèi)注射康柏西普)、Art高濃度組(玻璃體內(nèi)注射50.0 mg·L-1Art)、Art中濃度組(玻璃體內(nèi)注射25.0 mg·L-1Art)、Art低濃度組(玻璃體內(nèi)注射12.5 mg·L-1Art)；空白對照組采用未造模大鼠進行實驗，其他各組采用BRVO模型大鼠進行實驗。本研究動物處理遵循《實驗動物管理條例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器注射用Art(規(guī)格：60 mg；國藥準字：H10930195)(桂林南藥股份有限公司)，康柏西普眼用注射液(規(guī)格：10 g·L-1，0.2 mL/支；批號：202006b07)(成都康弘生物科技有限公司)，復方托吡卡胺滴眼液、氧氟沙星滴眼液及加替沙星眼用凝膠(沈陽興齊眼藥股份有限公司)，孟加拉紅(北京百奧萊博科技有限公司)，SYBR Green熒光定量試劑盒(TaKaRa公司)，實驗研究引物(大連萬澤貿(mào)易有限公司)。Nd:YAG激光光凝儀(法國Quantel Medical公司)，Speotralis HRA+OCT激光眼科診斷儀(德國Heidelberg公司)，CFX-96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BRVO模型建立參照鄒紅等[7]采用光化學法建立大鼠BRVO模型：以復方托吡卡胺滴眼液滴大鼠右眼充分散瞳，稱重后按照10 g·L-1水合氯醛溶液(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，以30 mg·kg-1尾靜脈注射孟加拉紅溶液(30 g·L-1)，行角膜表面麻醉及眼表涂加替沙星眼用凝膠后放置蓋玻片，以532 nm激光封閉視網(wǎng)膜視盤顳上方相鄰2支視網(wǎng)膜靜脈(光斑直徑50 μm，能量100 mW，曝光時間0.2 s)。每支靜脈光凝25～30點，使被光凝封閉的靜脈段長度約1視盤直徑，被封閉靜脈變細變白，血流停滯，遠端迂曲擴張。之后行眼底照相及熒光素眼底血管造影檢查，驗證造模是否成功。

1.2.2 玻璃體內(nèi)注射治療造模成功后第3天給藥。大鼠稱重后腹腔注射麻醉，右眼以復方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳。行角膜表面麻醉后將大鼠置于手術(shù)顯微鏡下，左手持顯微鑷固定眼球，右手持微量注射器距角膜緣后1 mm處用30G注射針頭垂直鞏膜進針，進針后立即調(diào)整注射角度，避免劃傷晶狀體或損壞視網(wǎng)膜，緩慢推入3 μL藥物或生理鹽水，留針30 s后迅速拔出針頭，立即用消毒棉簽輕壓注射點止血，局部涂抹加替沙星眼用凝膠。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織病理學觀察玻璃體內(nèi)注藥后1 d、3 d、7 d和14 d，過量麻醉處死大鼠后小心摘取眼球，分離視網(wǎng)膜組織，按染色要求處理后行石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟后行HE染色，于200倍光鏡下觀察距視盤中心上方15 mm處視網(wǎng)膜組織的病理學改變并照相，采用LEICAQWIN圖像分析軟件于距視盤中心15 mm處雙側(cè)測量視網(wǎng)膜內(nèi)層(包括內(nèi)核層、內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細胞層和神經(jīng)纖維層)厚度，每只眼球取6張切片，結(jié)果取平均值。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測視網(wǎng)膜組織VEGF、HIF-1α mRNA表達玻璃體內(nèi)注藥后1 d、3 d、7 d和14 d，過量麻醉處死大鼠后小心摘取眼球，分離視網(wǎng)膜組織，Trizol法提取總RNA，測定濃度后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板進行后續(xù)實驗。引物序列見表1。使用2-ΔΔCt計算各mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 玻璃體內(nèi)注藥后各組大鼠眼底照相檢查結(jié)果玻璃體內(nèi)注藥后1 d，模型對照組，康柏西普組，Art高、中、低濃度組大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜靜脈阻塞、迂曲擴張及視網(wǎng)膜出血水腫表現(xiàn)。玻璃體內(nèi)注藥后7 d，康柏西普組和Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜靜脈再通，僅有小部分靜脈血管阻塞；而康柏西普組和Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜靜脈阻塞表現(xiàn)差異不明顯(圖1和圖2)。

圖1 玻璃體內(nèi)注藥后1 d各組大鼠眼底照相檢查 A：空白對照組；B：模型對照組；C：康柏西普組；D：Art高濃度組；E：Art中濃度組；F：Art低濃度組。紅色三角示血管阻塞部位。

圖2 玻璃體內(nèi)注藥后7 d各組大鼠眼底照相檢查 A：空白對照組；B：模型對照組；C：康柏西普組；D：Art高濃度組；E：Art中濃度組；F：Art低濃度組。紅色三角示血管阻塞部位。

2.2 玻璃體內(nèi)注藥后7 d各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果玻璃體內(nèi)注藥后7 d，空白對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，細胞排列整齊；模型對照組大鼠視網(wǎng)膜組織水腫，其中神經(jīng)纖維層與內(nèi)叢狀層水腫明顯，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞可見空泡樣變性?？蛋匚髌战M和Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜水腫基本消失，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞空泡變性明顯改善(圖3)。

圖3 玻璃體內(nèi)注藥后7 d各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200) A：空白對照組；B：模型對照組；C：康柏西普組；D：Art高濃度組；E：Art中濃度組；F：Art低濃度組。

2.3 玻璃體內(nèi)注藥后不同時間各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較玻璃體內(nèi)注藥后不同時間各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度見表2。玻璃體內(nèi)注藥后3 d、7 d、14 d，康柏西普組，Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度明顯小于模型對照組(均為P<0.05)，康柏西普組與Art高、中、低濃度組間差異無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)。

表2 玻璃體內(nèi)注藥后不同時間各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較

2.4 玻璃體內(nèi)注藥后不同時間各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、HIF-1α mRNA相對表達量玻璃體內(nèi)注藥后1 d、3 d，模型對照組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA相對表達量較空白對照組均升高(均為P<0.05)；注藥后7 d， HIF-1α mRNA相對表達量則降低(P<0.05)。注藥后1 d、3 d，康柏西普組，Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA相對表達量較模型對照組均降低(均為P<0.05)。注藥后7 d，Art中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA相對表達量較模型對照組則均升高(均為P<0.05)(表3)。

表3 玻璃體內(nèi)注藥后不同時間各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA相對表達量

玻璃體內(nèi)注藥后7 d、14 d，模型對照組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF mRNA相對表達量較空白對照組均升高(均為P<0.05)；康柏西普組，Art高、中、低濃度組VEGF mRNA相對表達量較模型對照組均降低(均為P<0.05)(表4)。

表4 玻璃體內(nèi)注藥后不同時間各組大鼠視網(wǎng)膜組織 VEGF mRNA相對表達量

3 討論

視網(wǎng)膜血管阻塞病理機制復雜，其發(fā)病與高血壓、糖尿病、動脈硬化等全身性疾病關系密切。盡管玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物是目前治療RVO繼發(fā)黃斑水腫的有效方法，但抗VEGF治療仍存在諸多局限性，患者易反復發(fā)作黃斑水腫，且抗VEGF藥物價格昂貴，頻繁注射不僅增加患者發(fā)生眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜萎縮等風險，更加重患者的經(jīng)濟負擔。

Art是青蒿素的衍生物之一，由于其半衰期長、水溶性好、副作用少等特點，近年來被廣泛用于眼科臨床。根據(jù)Art的藥理特點，我們推測它能對RVO產(chǎn)生一定的治療效果。Li等[8]利用玻璃體內(nèi)注射80 μg Art治療因角膜、虹膜和視網(wǎng)膜新生血管所致的無光感患者，發(fā)現(xiàn)注射 Art后患者眼部新生血管均較以前減少，視盤水腫減輕。我們前期亦總結(jié)了Art在眼科的應用前景及潛在作用機制，并針對RVO致病原因、RVO繼發(fā)黃斑水腫發(fā)病機制、Art潛在作用靶點以及Art對RVO繼發(fā)黃斑水腫的治療作用進行了探討[9]。

本次我們通過眼底照相觀察發(fā)現(xiàn)，玻璃體內(nèi)注藥后1 d，模型對照組，康柏西普組，Art高、中、低濃度組大鼠均出現(xiàn)視網(wǎng)膜靜脈阻塞、迂曲擴張及視網(wǎng)膜出血水腫表現(xiàn)。玻璃體內(nèi)注藥后7 d，康柏西普組和Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜靜脈再通，僅有小部分靜脈血管阻塞；而康柏西普組和Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜靜脈阻塞表現(xiàn)差異不明顯。HE染色結(jié)果顯示：玻璃體內(nèi)注藥后7 d，空白對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，細胞排列整齊；模型對照組大鼠視網(wǎng)膜組織水腫，其中神經(jīng)纖維層與內(nèi)叢狀層水腫明顯，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞可見空泡樣變性?？蛋匚髌战M和Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜水腫基本消失，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞空泡變性明顯改善。玻璃體內(nèi)注藥后3 d、7 d、14 d，康柏西普組，Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度均明顯小于模型對照組。這提示Art對實驗性BRVO所致視網(wǎng)膜損傷具有一定保護作用。

本研究中玻璃體內(nèi)注藥后1 d、3 d，模型對照組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA相對表達量較空白對照組均升高；注藥后7 d， HIF-1α mRNA相對表達量則降低。注藥后1 d、3 d，康柏西普組，Art高、中、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α mRNA相對表達量較模型對照組均降低。由此可見，Art能夠通過降低造模后早期HIF-1α的表達以及造模后期VEGF的表達，從而減少大鼠實驗性BRVO的視網(wǎng)膜損傷。

目前制作BRVO模型方法較多，如血管結(jié)扎法、透熱法和光化學法等。由于光化學法只損傷視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，通過一系列級聯(lián)反應導致血小板聚集形成血栓，與人類BRVO的靜脈血栓成分及形成機制相近似，操作簡便且對動物眼球損傷小[10]，因此，本研究采用此種造模方法。

綜上所述，體內(nèi)研究結(jié)果證實Art能夠減輕BRVO大鼠視網(wǎng)膜損傷程度，其機制可能與調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路有關。Art作為中醫(yī)藥作用靶點多且毒副作用小，其在眼科疾病中有廣闊的應用前景，它的潛在價值有待進一步研究證實。