陳紅梅 張建欣 趙英仁

感染性疾病是具有明確病原體的一類(lèi)疾病，病原體主要包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等4大類(lèi)。臨床工作中盡快明確病原是診治感染性疾病的關(guān)鍵。但是傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法(包括涂片鏡檢、培養(yǎng)、抗原抗體的檢查等)陽(yáng)性率較低，導(dǎo)致病原學(xué)診斷十分困難。宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)(mNGS)通過(guò)對(duì)臨床樣本DNA或RNA進(jìn)行鳥(niǎo)槍法測(cè)序，可無(wú)偏倚檢測(cè)多種病原微生物是目前病原學(xué)診斷的新技術(shù)，發(fā)展迅速，在肺部感染、中樞神系統(tǒng)感染、血流感染、胸腹腔感染[1-5]等感染性疾病中，對(duì)病原學(xué)診斷特別是結(jié)核分枝桿菌、布氏桿菌、杜氏利士曼原蟲(chóng)等少見(jiàn)病原體的診斷發(fā)揮了重要的作用[6-9]。但由于此項(xiàng)新技術(shù)尚未完全成熟，在應(yīng)用過(guò)程中，我們也發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題，如序列數(shù)較低，難于判斷污染、定值亦或是真正致病的病原微生物；另外有些結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果不一致，導(dǎo)致臨床醫(yī)生決策兩難。所以，在臨床應(yīng)用過(guò)程中，如何正確解讀mNGS的檢測(cè)結(jié)果，也是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。本文通過(guò)分析典型病例的診療過(guò)程，旨在探討如何將mNGS更好地運(yùn)用于臨床，為臨床醫(yī)生提供更確切的診斷線索。

臨床資料

病例1，男，19歲，大一新生，因“發(fā)熱伴全身皮膚黃染4天”于2020年9月19日入院。4天前患者無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，最高體溫達(dá)38.2 ℃，無(wú)畏寒及寒戰(zhàn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)全身皮膚黃染。我院門(mén)診實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)：WBC計(jì)數(shù) 11.61×109/L(3.50～9.50×109/L，括號(hào)內(nèi)為正常參考值，以下相同)，PLT計(jì)數(shù) 48×109/L(125～350×109/L)；肝功能：總膽紅素715.8 μmol/L(3.4～17.1 μmol/L)，直接膽紅素627.9 μmol/L(0～3.4 μmol/L)，ALT 101 U/L(7～40 U/L)，AST 92 U/L(13～35 U/L)；腎功能：尿素36.62 mmol/L(3.10～8.80 mmol/L),肌酐557 μmol/L(41～81 μmol/L)；降鈣素原6.47 ng/ml(0～0.50 ng/ml)；凝血功能：凝血酶原時(shí)間14.2秒(9.8～12.1秒)，凝血酶原活動(dòng)度81%(84%～128%)。胸、腹部CT未見(jiàn)明顯異常。為進(jìn)一步診治，以“黃疸待查”收住院?；颊呔幼∮陉兾魇h中市，1周前來(lái)西安上大學(xué)，入學(xué)后在校軍訓(xùn)，無(wú)外出旅游及就餐史，既往體健，個(gè)人史及家族史無(wú)特殊。入院體格檢查皮膚鞏膜重度黃染，余無(wú)陽(yáng)性體征。入院后查肝炎病毒系列(甲、乙、丙、戊肝)均為陰性，EB病毒(EBV)及巨細(xì)胞病毒(CMV)均為陰性。磁共振胰膽管成像(MRCP)檢查未發(fā)現(xiàn)膽道梗阻因素。溶血指標(biāo)無(wú)異常。患者有發(fā)熱，WBC計(jì)數(shù)及降鈣素原明顯升高，影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)明確感染灶，考慮嚴(yán)重血流感染導(dǎo)致膿毒癥可能。但入院后行連續(xù)血培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。為進(jìn)一步明確病原，采外周血行mNGS檢查，檢測(cè)到鉤端螺旋體特異序列，為進(jìn)一步驗(yàn)證，行血清鉤端螺旋體抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，確診為鉤端螺旋體感染導(dǎo)致的急性肝腎功能損害。經(jīng)進(jìn)一步追問(wèn)病史，患者入學(xué)前整理舊書(shū)時(shí)有鼠類(lèi)排泄物接觸史，推測(cè)為可能的感染途徑。入院后經(jīng)兩次血漿置換及保肝退黃等對(duì)癥治療，并給予頭孢曲松鈉抗感染治療后，患者體溫恢復(fù)正常，肝功能及腎功能恢復(fù)正常后出院。

病例2，男，31歲，職員，因“發(fā)熱伴咳嗽1周”于2021年2月18日入院。患者1周前勞累后出現(xiàn)發(fā)熱，體溫波動(dòng)于37.5～39.8 ℃之間，伴咳嗽，咳少量白痰。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查血常規(guī)提示W(wǎng)BC計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞百分比升高，降鈣素原輕度升高，胸部CT檢查結(jié)果示胸膜肥厚粘連，胸腔積液、雙下肺炎癥。予以抗細(xì)菌、抗病毒等治療后，體溫仍反復(fù)波動(dòng)。后轉(zhuǎn)來(lái)我院，門(mén)診以“肺部感染？”收住院。患者個(gè)人史無(wú)特殊，述其妻子2年前曾患輸卵管結(jié)核,治療3個(gè)月痊愈。入院體格檢查：T 38 ℃，雙下肺呼吸音粗，余無(wú)陽(yáng)性體征。入院復(fù)查胸部CT提示右下肺新發(fā)斑片狀影、兩下肺纖維條索影。血常規(guī)：WBC計(jì)數(shù) 10.77×109/L，中性粒細(xì)胞百分比77.8%(40.0%～75.0%)。降鈣素原正常?？紤]為肺部感染，為明確病原，行痰細(xì)菌、真菌及結(jié)核菌涂片、培養(yǎng)檢查，呼吸道病毒系列等病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。序貫應(yīng)用“更昔洛韋”抗病毒、“莫西沙星、哌拉西林鈉他唑巴坦鈉”抗細(xì)菌治療后，患者發(fā)熱、咳嗽等癥狀無(wú)明顯緩解。因結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)陽(yáng)性，且既往有結(jié)核患者密切接觸史，考慮結(jié)核桿菌感染可能性大。進(jìn)一步行支氣管鏡檢查，采集肺泡灌洗液行mNGS檢測(cè)，結(jié)果提示結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，特異序列數(shù)為9。診斷為肺結(jié)核。常規(guī)抗結(jié)核治療后，患者體溫逐漸降至正常，咳嗽癥狀緩解，經(jīng)規(guī)律、足療程治療后，肺部炎癥滲出消失。

病例3，男，48歲，貨車(chē)司機(jī)，因“發(fā)熱1月余”于2020年6月4日入院。患者1個(gè)月前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)37.8 ℃，輕度頭痛，未重視，3周前體溫升高至39 ℃，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查血常規(guī)提示W(wǎng)BC計(jì)數(shù) 17.78×109/L，中性粒細(xì)胞百分比92.2%，血培養(yǎng)4次結(jié)果均為陰性。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院擬診“菌血癥”，給予“莫西沙星、頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉”靜脈滴注等治療1周后體溫恢復(fù)正常，3天后出院。1周前再次出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)38 ℃，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院再次給予莫西沙星治療體溫?zé)o下降。3天前患者夜間突發(fā)寒戰(zhàn)高熱，體溫達(dá)42 ℃，于我院就診，門(mén)診以“發(fā)熱待查：中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染？”收入院。個(gè)人及家族史無(wú)特殊，開(kāi)車(chē)運(yùn)輸路線固定，否認(rèn)特殊病畜等接觸史。入院后進(jìn)一步行血培養(yǎng)、骨髓培養(yǎng)等病原學(xué)檢查，結(jié)果均為陰性，胸部影像學(xué)及普通超聲心動(dòng)圖檢查無(wú)異常。因患者頭痛，行腦脊液檢查，結(jié)果提示壓力正常，腦脊液常規(guī)生化無(wú)異常，腦脊液涂片及培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，但腦脊液mNGS提示貝氏柯克斯體(Q熱的病原體)陽(yáng)性，1個(gè)特異序列。進(jìn)一步檢測(cè)特異抗體結(jié)果為陰性，給予多西環(huán)素治療無(wú)效。后進(jìn)一步經(jīng)食道超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈瓣左冠瓣約1 cm大小贅生物，診斷為感染性心內(nèi)膜炎，給予萬(wàn)古霉素抗感染治療后，體溫明顯下降，后轉(zhuǎn)至心外科手術(shù)治療。

病例4，女，24歲，研究生在讀，因“發(fā)熱2周、全身皮疹12天”于2021年6月8日入院?；颊?周前無(wú)明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)39.2 ℃，伴畏寒、肌肉酸痛、咽痛、雙膝關(guān)節(jié)疼痛，12天前出現(xiàn)面部、四肢、腹部及背部散在紅色皮疹，突出于皮面，無(wú)瘙癢及脫屑，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查鐵蛋白>2 000 ng/ml(13～150 ng/ml)，肝功能異常。給予抗感染及對(duì)癥治療后效果不佳。為求進(jìn)一步診治遂來(lái)我院，門(mén)診以“發(fā)熱、皮疹待查”收入院。既往史、個(gè)人史、流行病學(xué)史無(wú)特殊。入院體格檢查：T 38.8 ℃。右上臂可見(jiàn)散在紅色丘疹，突出于皮膚表面，壓之褪色。咽后壁紅腫。余無(wú)陽(yáng)性體征。入院后血常規(guī)檢查：WBC計(jì)數(shù) 15.73×109/L，中性粒細(xì)胞百分比94.5%，PLT計(jì)數(shù)541×109/L，C反應(yīng)蛋白64.1 mg/L(0～10.0 mg/L)，鐵蛋白1 457 ng/ml(13～150 ng/ml)；肝功能：ALT 100 U/L，白蛋白32.3 g/L(40.0～55.0 g/L)。胸、腹部CT檢查結(jié)果提示雙側(cè)胸腔少量積液，盆腔積液，脾臟增大。正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)-CT檢查結(jié)果示全身多發(fā)稍大淋巴結(jié)，葡萄糖代謝不同程度增高，骨髓葡萄糖代謝彌漫增高，脾臟增大并葡萄糖代謝增高，考慮血液系統(tǒng)異常增殖性病變，建議行骨髓活檢；雙側(cè)少量胸腔積液。骨髓涂片及活檢結(jié)果均無(wú)異常。行常規(guī)病原學(xué)檢查結(jié)果均為陰性，血液mNGS結(jié)果陰性。腫瘤標(biāo)志物及風(fēng)濕免疫性疾病相關(guān)檢查結(jié)果均為陰性。成人Still病屬于排除性診斷，臨床上需排除感染性疾病、風(fēng)濕免疫性疾病及腫瘤性疾病。經(jīng)全面檢查排除上述3類(lèi)疾病，依據(jù)敏感性及特異性均較高的日本標(biāo)準(zhǔn)[10],主要標(biāo)準(zhǔn)符合：(1)發(fā)熱時(shí)體溫大于39 ℃并持續(xù)1周以上；(2)有關(guān)節(jié)痛持續(xù)2周以上；(3)有典型的皮疹；(4)WBC計(jì)數(shù)>10×109/L；次要標(biāo)準(zhǔn)符合(1)咽痛；(2)淋巴結(jié)腫大；(3)脾臟腫大；(4)肝功能異常；(5)類(lèi)風(fēng)濕因子和抗核抗體陰性。本例患者符合包括4條主要標(biāo)準(zhǔn)的9條標(biāo)準(zhǔn)，明確診斷為成人Still病。給予糖皮質(zhì)激素治療后，發(fā)熱及皮疹消退，肝功能恢復(fù)正常。

討 論

世界首例應(yīng)用mNGS方法診斷了一例14歲男孩患的神秘腦炎，病原是鉤端螺旋體，發(fā)表于2014年的新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，引起醫(yī)療界轟動(dòng)[11]。后mNGS逐漸應(yīng)用于感染性疾病的各個(gè)領(lǐng)域，顯示其在發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原體及罕見(jiàn)特殊病原體診斷方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[12]。且mNGS不依賴于培養(yǎng)，報(bào)告時(shí)間較培養(yǎng)方法明顯縮短，為臨床決策爭(zhēng)取了時(shí)間。為促進(jìn)該技術(shù)的規(guī)范和發(fā)展，中華醫(yī)學(xué)會(huì)組織檢驗(yàn)及臨床專(zhuān)家制定了2021版《宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》(后簡(jiǎn)稱2021版《共識(shí)》)[13]。

病例1以發(fā)熱黃疸為主要表現(xiàn)，按照黃疸待查的診療思路，排除了梗阻性黃疸及溶血性黃疸，考慮肝細(xì)胞性黃疸。患者為青年男性，急性發(fā)熱起病，既往無(wú)慢性肝腎病史，近期無(wú)酒精及藥物應(yīng)用史，迅速出現(xiàn)肝腎功能的嚴(yán)重?fù)p害，且WBC計(jì)數(shù)及降鈣素原水平明顯升高，臨床考慮嚴(yán)重血流感染引起膿毒癥的可能性大，但常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，通過(guò)血液mNGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鉤端螺旋體陽(yáng)性，進(jìn)一步通過(guò)抗體檢測(cè)陽(yáng)性驗(yàn)證，同時(shí)追問(wèn)到接觸鼠類(lèi)排泄物的流行病學(xué)史，進(jìn)而經(jīng)過(guò)目標(biāo)病原治療后，病情迅速好轉(zhuǎn)，證實(shí)診斷明確。2021版《共識(shí)》臨床適應(yīng)證中共識(shí)3建議各種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，建議常規(guī)檢測(cè)的同時(shí)，或在常規(guī)檢測(cè)基礎(chǔ)上，開(kāi)展mNGS。共識(shí)6建議高度疑似感染性疾病，但病原學(xué)診斷未明確且常規(guī)抗感染治療無(wú)效，建議同時(shí)進(jìn)行mNGS檢測(cè)。此患者病情危重，考慮感染可能，通過(guò)mNGS迅速鎖定目標(biāo)病原，并通過(guò)其他方法確診驗(yàn)證，結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及治療效果綜合分析、診斷明確。

病例2是一個(gè)有結(jié)核密切接觸史的患者，出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽等肺部炎癥表現(xiàn)，常規(guī)抗感染治療無(wú)效，且PPD陽(yáng)性，高度懷疑結(jié)核感染，但常規(guī)結(jié)核菌檢查結(jié)果為陰性。結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，且生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)條件苛刻，培養(yǎng)陽(yáng)性率很低，mNGS在結(jié)核桿菌診斷方面表現(xiàn)出了特殊的優(yōu)勢(shì)。此例患者我們通過(guò)mNGS檢測(cè)肺泡灌洗液顯示結(jié)核桿菌復(fù)合群陽(yáng)性，雖然只有9個(gè)特異性序列，依據(jù)2021版《共識(shí)》共識(shí)30，mNGS檢測(cè)報(bào)告中，建議結(jié)合不同標(biāo)本類(lèi)型與檢出病原微生物的種類(lèi)進(jìn)行解讀，呼吸道標(biāo)本檢出結(jié)核分枝桿菌，應(yīng)認(rèn)為是致病微生物。Zhou等[14]對(duì)123例懷疑結(jié)核感染患者同時(shí)進(jìn)行mNGS及常規(guī)診斷結(jié)核的方法進(jìn)行檢測(cè)，顯示聯(lián)合mNGS和Xpert可明顯提高結(jié)核桿菌及其他病原體的檢出率。

病例3是一個(gè)發(fā)熱待查的患者，發(fā)熱待查的病因中仍以感染性疾病最常見(jiàn)，此患者前期抗感染治療有效，且無(wú)風(fēng)濕免疫性疾病及腫瘤性疾病的證據(jù)，仍考慮感染性疾病可能性大。我們采用mNGS在該患者腦脊液中檢測(cè)到了極其罕見(jiàn)的Q熱的病原體貝氏柯克斯體，但沒(méi)有追蹤到Q熱相關(guān)的流行病學(xué)史及典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)有效藥物治療無(wú)效，且特異性抗體檢測(cè)陰性，應(yīng)考慮假陽(yáng)性可能。進(jìn)一步檢查后發(fā)現(xiàn)心臟瓣膜的贅生物，診斷為感染性心內(nèi)膜炎，經(jīng)有效抗感染聯(lián)合手術(shù)治療，患者痊愈。mNGS十分敏感，可檢測(cè)到微量的基因產(chǎn)物，但也不排除檢測(cè)過(guò)程中的痕量污染。所以在臨床診治過(guò)程中，應(yīng)該聯(lián)合常規(guī)檢測(cè)方法，結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及治療反應(yīng)綜合判斷，甄別假陽(yáng)性可能。美國(guó)學(xué)者Graff等[15]收集了13個(gè)關(guān)于mNGS在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病中的臨床應(yīng)用研究進(jìn)行分析，結(jié)果提示mNGS結(jié)果必須依據(jù)患者的臨床背景進(jìn)行詳細(xì)解讀，mNGS的無(wú)偏倚性和高敏感性使其可檢測(cè)到未被懷疑的病原體，而結(jié)合臨床表現(xiàn)，這些病原體并不一定與臨床相關(guān)。

病例4是一個(gè)青年女性，以發(fā)熱皮疹為主要表現(xiàn)，臨床符合成人Still病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但需要排除感染性疾病、風(fēng)濕免疫性疾病及腫瘤性疾病。此例患者我們結(jié)合傳統(tǒng)檢測(cè)方法及mNGS，排除上述疾病。由于常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)方法的陽(yáng)性率較低，即使陰性也不能完全排除感染，所以臨床上往往需要廣譜抗生素的足療程治療無(wú)效來(lái)排除感染，導(dǎo)致抗生素濫用、耐藥菌及繼發(fā)感染的發(fā)生。mNGS由于其高度敏感，對(duì)幾乎所有病原微生物可無(wú)差別檢測(cè)，所以其結(jié)果陰性對(duì)于排除感染常具有較高的陰性預(yù)測(cè)值[13]。Gan等[16]在一項(xiàng)關(guān)于mNGS在HIV陰性患者隱球菌性腦膜炎診斷的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，其陰性預(yù)測(cè)值達(dá)到98%。

正確的診斷源于科學(xué)的思維[17]。感染性疾病的病原學(xué)診斷采用傳統(tǒng)的涂片、培養(yǎng)等方法陽(yáng)性率較低，而mNGS等一些新興技術(shù)發(fā)展迅速，敏感性明顯提高，但對(duì)于檢測(cè)結(jié)果，我們必須依據(jù)患者實(shí)際情況進(jìn)行辯證分析，結(jié)合流行病學(xué)史、臨床資料等綜合評(píng)估，并通過(guò)有效的治療進(jìn)一步驗(yàn)證我們的判斷是否正確。mNGS是傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充，我們應(yīng)該在臨床應(yīng)用中逐漸完善，并期望能更好地為臨床服務(wù)。