顏欣 韓為東

近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞(CAR-T)療法已經(jīng)成為多次標(biāo)準(zhǔn)治療失敗惡性血液系統(tǒng)腫瘤患者的新的挽救治療方法。到目前為止，CAR-T已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療包括B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)在內(nèi)的多種血液系統(tǒng)腫瘤。盡管CAR-T取得突破性進(jìn)展，但仍有部分患者對(duì)這種治療產(chǎn)生了原發(fā)或繼發(fā)抵抗[1-2]。除了腫瘤外部的因素包括T細(xì)胞耗竭、T細(xì)胞長期存活減少和免疫抑制腫瘤微環(huán)境等可導(dǎo)致CAR-T療法失敗之外，近期越來越多的學(xué)者開始關(guān)注腫瘤細(xì)胞對(duì)于CAR-T治療不敏感(腫瘤細(xì)胞固有抵抗)的原因。為此，我們總結(jié)了近年來CAR-T治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)的腫瘤細(xì)胞固有抵抗機(jī)制并討論相應(yīng)的挽救策略。

一、靶抗原的丟失

靶抗原丟失是目前研究最廣泛和明確的腫瘤細(xì)胞逃逸CAR-T治療的機(jī)制[3]。對(duì)于DLBCL,約有1/3復(fù)發(fā)患者可出現(xiàn)CD19丟失或下調(diào)[3-6]。目前已報(bào)道的解釋抗原陰性復(fù)發(fā)的機(jī)制包括預(yù)先存在的抗原陰性腫瘤細(xì)胞、突變或剪接變異、影響靶抗原表達(dá)的成熟/運(yùn)輸、表位掩蔽和譜系轉(zhuǎn)換等[7]。最近，Heard等[8]在細(xì)胞和小鼠水平發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞NHL(B-NHL)中高爾基體駐留的膜內(nèi)蛋白酶信號(hào)肽酶樣3(SPPL3)的表達(dá)是CAR-T治療抵抗的重要調(diào)節(jié)因子。SPPL3的缺失可導(dǎo)致CD19糖基化過度，直接抑制CAR-T抗腫瘤細(xì)胞毒性。同時(shí)，SPPL3的過表達(dá)可能由于CD19蛋白被扣留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能到達(dá)膜表面，從而出現(xiàn)抗原丟失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗CAR-T治療。

在CD19陰性或低表達(dá)復(fù)發(fā)的情況下，B-NHL細(xì)胞可以保留其他B細(xì)胞的標(biāo)志物，如CD22、CD20或CD70a。因此開發(fā)靶向兩種或多種抗原的CAR-T可用于預(yù)防和治療靶抗原陰性逃逸[9]。本項(xiàng)目組前期采用串聯(lián)結(jié)構(gòu)CD19-CD20雙靶點(diǎn)CAR-T治療87例復(fù)發(fā)難治性B-NHL，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示完全緩解(CR)率可達(dá)70%，同時(shí)中位無進(jìn)展生存期(PFS)達(dá)27.7個(gè)月，抗原陰性復(fù)發(fā)比例僅為5.7%(5/87)[10-11]。以不依賴抗原的方式殺死腫瘤細(xì)胞或提高靶抗原的表達(dá)也有助于解決抗原陰性復(fù)發(fā)。增加CD40L組成表達(dá)的CAR-T不僅可通過直接細(xì)胞毒性殺傷CD40+腫瘤細(xì)胞，還可與抗原提呈細(xì)胞的CD40結(jié)合，從而增加抗原呈遞作用，以招募更多的內(nèi)源性效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮非靶抗原依賴的T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用[12]。小分子γ分泌酶抑制劑和苔蘚蟲素1也在臨床前研究中被發(fā)現(xiàn)可提高癌細(xì)胞的靶抗原表達(dá)[13-14]。

二、干擾素(IFN)-γ信號(hào)通路異常

已有相關(guān)報(bào)道缺失IFN-γ信號(hào)與黑色素瘤細(xì)胞抵抗免疫檢查點(diǎn)抑制劑有關(guān)[15]。本項(xiàng)目組通過全基因組CRISPR/Cas9文庫發(fā)現(xiàn)多種調(diào)控IFN-γ信號(hào)通路基因(包括JAK1、JAK2、STAT1、IFNGR1或IFNGR2)缺失的腫瘤細(xì)胞可逃逸CAR-T治療[16]。除此之外，其他多個(gè)團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號(hào)通路異?？捎绊慍AR-T療效。Larson等[17]通過全基因組CRISPR/Cas9文庫發(fā)現(xiàn)IFN-γ信號(hào)通路基因(包括IFNGR1、JAK1或JAK2)的缺失使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和其他實(shí)體腫瘤對(duì)CAR-T的殺傷更具抵抗性。Haynes等[18]發(fā)現(xiàn)與野生型CAR-T相比，IFN-γ缺陷型CAR-T對(duì)結(jié)腸癌小鼠移植瘤的腫瘤控制效果較差。Arenas等[19]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞JAK2的下調(diào)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向HER2的CAR-T產(chǎn)生繼發(fā)性抵抗。Jain等[20]發(fā)現(xiàn)在DLBCL腫瘤中IFN-γ信號(hào)與包括程序性死亡配體1(PD-L1)在內(nèi)的多個(gè)檢查點(diǎn)配體的表達(dá)相關(guān)，且腫瘤患者的IFN-γ信號(hào)較高與CAR-T擴(kuò)增下降相關(guān)。

增加CAR-T分泌IFN-γ可能有助于提高CAR-T療效，Avanzi等[21]設(shè)計(jì)了分泌IL-18的TRUCKs CAR-T，其既可增加IFN-γ的分泌，還可調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ信號(hào)通路，以增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤的免疫反應(yīng)。

三、凋亡信號(hào)異常

在CAR-T殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，腫瘤細(xì)胞自身執(zhí)行凋亡異?？蓪?dǎo)致CAR-T療法的失敗。CAR-T依賴3種途徑殺死靶細(xì)胞：一種是T細(xì)胞通過分泌顆粒酶和穿孔素來觸發(fā)線粒體參與的內(nèi)源性凋亡通路[22]；另一種是死亡受體啟動(dòng)的外源性凋亡通路，又稱為死亡受體凋亡通路；此外還有細(xì)胞因子依賴途徑[23]。

為了系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞抵抗CAR-T治療的腫瘤固有因素，近期本項(xiàng)目組通過全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)，以人B淋巴白血病細(xì)胞(Nalm6)為模型，進(jìn)行低效靶比、長時(shí)間的Nalm6細(xì)胞與CD19 CAR-T共培養(yǎng)，挖掘參與B-NHL抵抗CAR-T治療的關(guān)鍵功能基因[16]。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞NOXA基因缺失可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸CAR-T療法。NOXA蛋白被稱為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的增敏劑，是一種促細(xì)胞凋亡的B淋巴細(xì)胞瘤(BCL)-2家族蛋白[24]。本項(xiàng)目組在體內(nèi)和體外水平發(fā)現(xiàn)B-NHL中NOXA缺失可阻礙CAR-T誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗CAR-T治療[16]。回顧性分析結(jié)果提示，NOXA在約38%的NHL患者腫瘤中表達(dá)缺失或低下[免疫組織化學(xué)(IHC)評(píng)分<4分]，約70%NOXA低表達(dá)的NHL患者在6個(gè)月內(nèi)發(fā)生疾病進(jìn)展，而僅有15%NOXA高表達(dá)患者在6個(gè)月內(nèi)發(fā)生疾病進(jìn)展[16]。更重要的是，本項(xiàng)目組在細(xì)胞及動(dòng)物水平也發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑可上調(diào)腫瘤細(xì)胞NOXA的蛋白水平，從而逆轉(zhuǎn)患者對(duì)CAR-T治療的抵抗。這一研究成果提示NHL患者腫瘤樣本的NOXA表達(dá)可用于預(yù)測CAR-T療效并對(duì)患者分層治療，NOXA低表達(dá)患者可嘗試HDAC抑制劑聯(lián)合CAR-T療法。

在CAR-T接觸靶細(xì)胞后，CAR參與誘導(dǎo)Fas配體(FasL)和腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)表達(dá)的上調(diào)，使CAR-T能夠利用死亡受體途徑以抗原依賴性和非依賴性的方式殺死腫瘤細(xì)胞。Upadhyay等[25]在細(xì)胞及動(dòng)物水平發(fā)現(xiàn)使用抗FasL抗體或Fas缺陷靶細(xì)胞來破壞死亡受體途徑后可導(dǎo)致CAR-T引發(fā)的腫瘤細(xì)胞抗原依賴性凋亡和非抗原依賴性的旁觀者凋亡減少；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在ZUMA-1臨床試驗(yàn)中，腫瘤樣本Fas高表達(dá)的NHL患者在輸注CAR-T后經(jīng)歷了更持久的臨床應(yīng)答和更長的生存時(shí)間；更重要的是，他們發(fā)現(xiàn)凋亡抑制因子(IAP)和抗凋亡髓系細(xì)胞白血病1(MCL1)蛋白的抑制劑可提高靶細(xì)胞和旁觀者腫瘤細(xì)胞對(duì)CAR-T介導(dǎo)的Fas依賴性殺傷的敏感性，可作為聯(lián)合CAR-T療法的候選藥物。

Singh等[26]通過CRISPR文庫篩選發(fā)現(xiàn)死亡受體凋亡通路受損是B-ALL患者原發(fā)抵抗CAR-T療法的新機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除腫瘤細(xì)胞促凋亡基因FADD、BID、CASP8和TNFRSF10B后，腫瘤細(xì)胞可抵抗CAR-T殺傷。相反，敲除抗凋亡基因(如CFLAR、TRAF2和BIRC2)可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)CAR-T殺傷的敏感性。他們發(fā)現(xiàn)在靶抗原持續(xù)存在時(shí)，死亡受體信號(hào)受損的腫瘤細(xì)胞可導(dǎo)致CAR-T發(fā)生進(jìn)展性功能障礙。通過對(duì)兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)中CAR-T治療B-ALL患者骨髓標(biāo)本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，死亡受體信號(hào)評(píng)分下降患者體內(nèi)CAR-T擴(kuò)增減少，輸注CAR-T后總生存期(OS)縮短。Dufva等[27]通過對(duì)高通量藥物篩選和全基因組CRISPR文庫篩選也發(fā)現(xiàn)FADD和TNFRSF10B缺失可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗CAR-T療法，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)IAP抑制劑(birinapant，AT-406和LCL-161)可顯著增強(qiáng)CAR-T毒性。

TP53基因改變是復(fù)發(fā)難治性侵襲性B-NHL患者預(yù)后不佳的因素之一[28]。Shouval等[29]通過對(duì)輸注CAR-T患者的腫瘤組織進(jìn)行靶向二代測序，發(fā)現(xiàn)37%的B-NHL患者可發(fā)生TP53異常[突變和(或)拷貝數(shù)改變]，同時(shí)TP53異常與較低的CR、OS率相關(guān)。TP53異常患者1年OS率為44%，遠(yuǎn)低于野生型患者(76%)。TP53異常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗CAR-T治療機(jī)制可能與IFN-γ信號(hào)和凋亡信號(hào)通路受損及浸潤的CAR-T減少有關(guān)。最近，Wei等[30]研究發(fā)現(xiàn)抗CD19和抗CD22 CAR(CAR19/22) T細(xì)胞雞尾酒療法對(duì)于TP53異常復(fù)發(fā)難治性B-NHL有效，同時(shí)將CAR-T治療與自體干細(xì)胞移植相結(jié)合可進(jìn)一步改善這些患者的長期預(yù)后，最佳客觀緩解率(ORR)可達(dá)92.9%，2年P(guān)FS和OS率分別為77.5%和89.3%。

四、黏附分子表達(dá)異常

最近，本項(xiàng)目組通過全基因組CRISPR/Cas9文庫篩選發(fā)現(xiàn)B-NHL細(xì)胞CD81和CD58的缺失可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃逸CAR-T治療[31]。CD81的缺失可阻止CD19成熟和運(yùn)輸至細(xì)胞膜上，已被證實(shí)是抵抗靶向CD19治療的機(jī)制之一[32]。CD58是人類T細(xì)胞CD2分子的配體，在天然細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL細(xì)胞)中，CD58與CD2的相互作用可促進(jìn)T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞之間形成免疫突觸，增強(qiáng)TCR與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原肽的結(jié)合，為T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和激活提供了必要的共刺激信號(hào)[33]。

本項(xiàng)目組觀察到兩種B-NHL細(xì)胞系的CD58缺失對(duì)多種CAR-T治療產(chǎn)生抵抗。此外，我們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中CD58缺失導(dǎo)致其與CAR-T接觸不良，形成受損的免疫突觸，CAR信號(hào)激活減弱，從而導(dǎo)致CAR-T功能障礙，主要表現(xiàn)為CAR-T增殖減慢、脫顆粒減少、細(xì)胞因子分泌減少、細(xì)胞不良反應(yīng)降低及CAR-T死亡增多等。最近，Romain等[34]和Majzner等[35]均發(fā)現(xiàn)在接受CD19 CAR-T治療的復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者中，治療前腫瘤樣本中CD58高表達(dá)患者顯示出對(duì)CAR-T治療的高CR率和高生存率。B-NHL患者CD58的基因突變具有種族差異影響，在西方國家的B-NHL患者中，CD58基因的遺傳缺失率約為20%，蛋白表達(dá)下降的發(fā)生率約為67%[36]；然而我國B-NHL患者CD58基因突變率僅約5%～10%[37-38]，遠(yuǎn)低于西方人群。

Majzner等[35]提出CD58-CD2相互作用的受損可通過整合CD2共刺激結(jié)構(gòu)域的二代CAR-T進(jìn)行挽救，然而這種新型CAR-T僅在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出增強(qiáng)的療效，尚未在患者中測試。CD58的表達(dá)可受遺傳和表觀調(diào)控[36]，選擇合適的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑提高CD58的表達(dá)可能有助于逆轉(zhuǎn)CAR-T治療抵抗。

五、抑制性配體的表達(dá)

抑制性配體PD-L1和PD-L2可由腫瘤細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞表達(dá)，這些配體在與其受體[即程序性死亡受體1(PD-1)]結(jié)合時(shí)可阻止CAR-T活化，從而導(dǎo)致免疫逃逸。Neelapu等[39]發(fā)現(xiàn)在ZUMA-1試驗(yàn)中，Axi-Cel治療后21例B-NHL患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，其中13例表達(dá)PD-L1，提示B-NHL患者PD-L1高表達(dá)可作為CAR-T療效差的預(yù)測標(biāo)志物。近期，本項(xiàng)目組分析了5例復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者在CAR-T輸注后復(fù)發(fā)或進(jìn)展后給予抗PD-1治療，其中3例出現(xiàn)應(yīng)答[2例CR,1例部分緩解(PR)],2例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展。腫瘤標(biāo)本免疫組織化學(xué)檢測顯示，PD-1/PD-L1在抗PD-1治療有應(yīng)答反應(yīng)患者中的表達(dá)水平高于無應(yīng)答反應(yīng)患者。因此，本項(xiàng)目組提出，對(duì)于CAR-T治療失敗后復(fù)發(fā)難治性B-NHL患者，如果腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1，腫瘤浸潤性T細(xì)胞中PD-1水平較高，則釋放對(duì)免疫檢查點(diǎn)的抑制可能有助于增效CAR-T治療[40]。

六、總結(jié)

發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞抵抗CAR-T治療的機(jī)制對(duì)于開發(fā)提高CAR-T療效的策略具有關(guān)鍵的指導(dǎo)意義。靶抗原的丟失是研究最廣泛的CAR-T治療抵抗機(jī)制，現(xiàn)在已開發(fā)包括多靶點(diǎn)抗原的CAR-T來克服和預(yù)防由于靶抗原的丟失帶來的治療抵抗問題。最近，腫瘤細(xì)胞逃逸CAR-T殺傷的其他機(jī)制，如IFN-γ信號(hào)通路異常、凋亡信號(hào)的異常、黏附分子的缺失及抑制性配體的表達(dá)增高也逐漸被發(fā)現(xiàn)，盡管針對(duì)這些新發(fā)現(xiàn)的抵抗機(jī)制都有相應(yīng)的策略進(jìn)行規(guī)避，但這些策略大多數(shù)都處于臨床前階段，仍需要應(yīng)用于更多的患者并進(jìn)行評(píng)價(jià)。最后，隨著CAR-T廣泛的商品化應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)患者對(duì)于CAR-T的抵抗機(jī)制有助于精準(zhǔn)預(yù)測CAR-T療效并設(shè)計(jì)合適的產(chǎn)品提高其療效。