鄧啟亮 鄭歡歡

(1 吉安市中心人民醫(yī)院/消化內(nèi)科 江西 吉安 343000 2 吉安市中心人民醫(yī)院/內(nèi)分泌科 江西 吉安 343000)

CD24是一種與膜連接[1]的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白。CD24可以影響整合素β1的側(cè)向定位，并將整合素β1募集到脂筏中。Wnt/β-catenin是細(xì)胞-細(xì)胞粘附的胞質(zhì)組分，它與E-cadherin胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用，并通過(guò)α-catenin與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接。眾所周知，β-catenin是Wnt通路中的一個(gè)關(guān)鍵分子，當(dāng)Wnt通路被激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。β-catenin在Tcf/LEF位點(diǎn)與DNA結(jié)合，并通過(guò)與Tcf/LEF位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)下游基因靶點(diǎn)如cyclin D1[2]和c-myc[3]的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在以前的研究確定了CD24在結(jié)腸癌細(xì)胞粘附、增殖及轉(zhuǎn)移中的作用，但尚未闡明其潛在的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1抗體和化學(xué)藥品：使用以下抗體：抗cyclinD1、c-myc、GSK-3β、P-GSK-3β的抗體購(gòu)自CST(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司，Beverly，MA)?？功?catenin和抗β-actin購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz Biotechnology，CA)。TCF/LEF報(bào)告者TOP flash及其突變體控制物FOP flash是從美國(guó)北部(紐約市)購(gòu)買(mǎi)的

1.2免疫印跡分析：培養(yǎng)和收集的細(xì)胞在添加蛋白酶抑制劑的RIPA(Beyotime,shanghai,China)緩沖液中裂解。裂解物在4°C下離心30分鐘。為了確定β-catenin在細(xì)胞中的定位，用細(xì)胞分餾試劑盒(Keygen,南京，中國(guó))從細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)和核蛋白。等量蛋白質(zhì)樣品在分離凝膠中用SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素片上。在5%脫脂牛奶中阻斷2小時(shí)后與稀釋后的原抗體(cyclinD1 1:1000,c-myc 1:500,GSK-3β1:1000,P-GSK-3β1:1000,β-catenin 1:200,β-actin 1:1000)在4℃下孵育過(guò)夜。用TBS-T洗膜，并與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體(1：5000稀釋度)一起孵育，使用ECL檢測(cè)試劑盒(Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL)加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.3免疫熒光素：免疫熒光素使用以下一抗：小鼠抗β-catenin(1:400)。二次抗體為山羊抗小鼠FITC(1:1000)。染色切片用熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶試驗(yàn)：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)將細(xì)胞一式三份接種在24孔板中。用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告構(gòu)建體TOP flash或FOP flash和含有腎母熒光素酶的參考構(gòu)建體pRL-SV40(Promega，Madison，WI)。48小時(shí)后，在GloMax發(fā)光測(cè)量系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)中使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)試劑盒(Promega，Madison，WI)測(cè)量熒光素酶活性。以熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染SW480-CD24和SW480-V細(xì)胞或SW620-KD和SW620-NC,共轉(zhuǎn)染pRL-SV40報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照，將螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與腎母細(xì)胞熒光素酶活性進(jìn)行歸一化，并以平均±SD作圖。

2 結(jié)果

2.1 CD24的表達(dá)改變?chǔ)?catenin表達(dá)量并改變其定位

從SW480-CD24和SW480-V細(xì)胞中制備細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白，并對(duì)其進(jìn)行免疫印跡分析，以確定CD24是否調(diào)節(jié)β-catenin蛋白的表達(dá)。與SW480-V細(xì)胞相比，SW480-CD24克隆的胞漿β-catenin水平增加了40%以上，細(xì)胞核中的β-catenin水平增加了80%以上(圖.1C)。由于β-catenin在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能依賴于其胞質(zhì)/核定位，進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光分析了β-catenin蛋白的分布。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中染色增強(qiáng)(圖.1A)。結(jié)果表明，CD24的上調(diào)導(dǎo)致SW480細(xì)胞β-catenin表達(dá)量增加并使其從細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。

siRNA敲除CD24降低β-catenin表達(dá)并改變其定位，與過(guò)度表達(dá)CD24的SW480細(xì)胞相比，SW620-KD的細(xì)胞質(zhì)β-catenin水平比SW620-NC細(xì)胞下降了80%，細(xì)胞核下降了40%(圖.1D)。進(jìn)一步通過(guò)間接免疫熒光分析了β-catenin蛋白的分布。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中染色減弱(圖1.B)。結(jié)果表明，在SW620細(xì)胞中，CD24下調(diào)導(dǎo)致β-catenin表達(dá)量減少并使其從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。

圖1 CD24的表達(dá)改變?chǔ)?catenin表達(dá)量并改變其定位

2.2 CD24可調(diào)控β-catenin/TCF/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)錄活性

CD24過(guò)表達(dá)可激活β-catenin/TCF/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。CD24表達(dá)上調(diào)增加了SW480細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中β-catenin的表達(dá)，并導(dǎo)致β-catenin從細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)的重新定位。使用TOP flash和FOP flash檢測(cè)了SW480-CD24和SW480-V的β-catenin/TCF/LEF信號(hào)。如(圖2.A)所示，SW480-CD24細(xì)胞的β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性比SW480-V細(xì)胞提高了4～6倍。

沉默CD24可抑制β-catenin/TCF/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。SW620-KD細(xì)胞中β-catenin/TCF/LEF信號(hào)通路如(圖2.B)所示，SW620-KD細(xì)胞的β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性比SW620-NC細(xì)胞降低了3～4倍。

圖2 CD24可調(diào)控β-catenin/TCF/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)錄活性

2.3 CD24通過(guò)GSK3-β磷酸化調(diào)節(jié)cyclinD1、c-myc的表達(dá)。

為了解CD24是否影響TCF/LEF的下游信號(hào)通路，隨后檢測(cè)了GSK3-β和GSK3-β的磷酸化水平，數(shù)據(jù)表明(圖3.A)過(guò)表達(dá)CD24可以誘導(dǎo)GSK3-β的磷酸化。與β-catenin/TCF/LEF活性表達(dá)一致，在SW480-CD24中c-myc和cyclinD1的表達(dá)量隨CD24的增加而升高，而在SW620-KD中GSK3-β的磷酸化水平下降，c-myc和cyclinD1的表達(dá)量隨之減少(圖3.B)。

圖3 CD24通過(guò)GSK3-β磷酸化調(diào)節(jié)cyclinD1、c-myc的表達(dá)

3 討論

以前的研究表明，在MTLyCD24mut中CD24的重新表達(dá)可以通過(guò)激活整合素促進(jìn)與細(xì)胞外基質(zhì)成分的結(jié)合[4]。β-catenin表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是多種惡性腫瘤尤其是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要因素。研究中發(fā)現(xiàn)SW480-CD24細(xì)胞胞質(zhì)和核β-catenin蛋白水平明顯升高，CD24的過(guò)度表達(dá)使β-catenin從細(xì)胞膜向胞質(zhì)和細(xì)胞核易位導(dǎo)致β-catenin/TCF/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。而沉默CD24可使β-catenin從細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核向細(xì)胞膜易位導(dǎo)致β-catenin/TCF/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱。

我們進(jìn)一步研究了β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性所反映的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是否與β-catenin表達(dá)增加和定位改變有關(guān)。Tcf/LEF熒光素酶報(bào)告構(gòu)建是檢測(cè)β-catenin/Tcf/LEF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活的有效方法[5],通過(guò)計(jì)算結(jié)腸癌細(xì)胞中TOPflash與FOPflash熒光素酶活性的比值，證實(shí)了結(jié)腸癌細(xì)胞中β-catenin/Tcf/LEF轉(zhuǎn)錄活性與CD24的表達(dá)相關(guān)。

本研究所研究的Wnt途徑的另一個(gè)重要成分是GSK-3β，通常胞質(zhì)β-catenin庫(kù)是由GSK-3β和其他破壞復(fù)合物的成分維持的，GSK-3β的磷酸化可以破壞泛素-蛋白體系統(tǒng)，導(dǎo)致胞質(zhì)β-catenin庫(kù)和核庫(kù)的增加[6,7]，我們發(fā)現(xiàn)CD24可以誘導(dǎo)GSK3-β的磷酸化。以往研究還發(fā)現(xiàn)CD24能激活intergrinβ1，整合素[8]能激活多種蛋白酪氨酸激酶，包括粘著斑激酶(FAK)、Src家族激酶，而GTPase Cdc42 GTPase Cdc42通過(guò)激活PI3K/AKT使GSK3-β磷酸化，從而抑制GSK3-β的表達(dá)，推測(cè)intergrinβ1與GSK3-β可能通過(guò)GTPase Cdc42存在一定的關(guān)系。

總之，我們的數(shù)據(jù)表明CD24可調(diào)控Wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，使β-catenin表達(dá)量改變并在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中易位。CD24為結(jié)腸癌的治療提供了可能的策略。