孔維歡 熊燊源 代蓉
摘要:為了研究Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)在綿羊胚胎附植期和發(fā)情周期子宮內(nèi)膜中mRNA的表達(dá)模式。采用半定量RT-PCR和實(shí)時熒光定量RT-PCR分別檢測妊娠21 d母羊全身組織和妊娠9、13、17、21、25 d 的母羊子宮內(nèi)膜組織TLR4基因的表達(dá)以及綿羊卵泡期與黃體期母羊子宮內(nèi)膜組織TLR4基因的表達(dá)。結(jié)果表明,TLR4基因在肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、肌肉及松果體等組織出現(xiàn)表達(dá),其中在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中表達(dá)量較高,在肝臟、小腸、肌肉中表達(dá)較弱,而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá)。從妊娠9 d開始,綿羊胚胎TLR4基因表達(dá)量呈逐漸下降趨勢;至胚胎附植點(diǎn)17 d,TLR4基因表達(dá)量最低,之后又呈現(xiàn)上升趨勢,到25 d達(dá)到峰值。不管是在細(xì)毛羊還是在湖羊子宮內(nèi)膜組織中檢測,TLR4基因黃體期的表達(dá)水平均顯著高于卵泡期(P<0.05)。說明TLR4的mRNA表達(dá)具有組織特異性,在胚胎附植期綿羊子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)先低后高的趨勢,以及其在綿羊發(fā)情周期中表達(dá)出現(xiàn)黃體期顯著高于卵泡期現(xiàn)象,也初步說明了TLR4可能在胚胎附植早期和發(fā)情周期中均發(fā)揮一定作用。
關(guān)鍵詞:TLR4基因;綿羊;胚胎附植期;發(fā)情周期;子宮內(nèi)膜
中圖分類號: S826.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2019)01-0035-05
Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR) 是一類典型的Ⅰ型模式識別受體(pattern recognition receptors,PRR)[1-3]。據(jù)調(diào)查,近些年來對動物繁殖相關(guān)的疾病(流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎等)與天然免疫受體TLRs的關(guān)聯(lián)性分析研究逐年增多。而其中TLR4受體基因是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究最為廣泛的,隨著國內(nèi)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高、人均壽命的增長,內(nèi)分泌性疾病發(fā)病率的不斷上升,子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病呈現(xiàn)逐漸年輕化的趨勢,子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病與體內(nèi)外多種因素有了密切的關(guān)聯(lián)[4],其中長期受到雌激素刺激和缺乏孕激素拮抗作用就是子宮內(nèi)膜發(fā)生癌變的主要外界因素。因而母-胎界面中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制也成了許多免疫學(xué)家一直的研究熱點(diǎn),并證實(shí)了TLR4在生殖免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。比如,Romero等認(rèn)為早產(chǎn)主要就是因?yàn)樯车赖母腥具M(jìn)而引發(fā)了炎癥所導(dǎo)致的[5]。母-胎界面作為妊娠時聯(lián)系母體和胎兒的重要屏障保護(hù)組織,其上各類促炎癥因子的表達(dá)情況被證明是與正常的妊娠和分娩相關(guān)的[6]。而哺乳動物妊娠建立的標(biāo)識則是胚胎的附植,它是胚胎與母體復(fù)雜的多基因雙向調(diào)控作用的結(jié)果。有研究表明,雌性動物生殖道內(nèi)有大量表達(dá)TLR1-6等免疫受體,在2004年,Pioli等的相關(guān)研究中,TLR4受體基因在人類的輸卵管、子宮內(nèi)膜、子宮頸等生殖器中呈現(xiàn)出差異性表達(dá)[7]。2007年,Nishimura等在人類的卵巢、輸卵管以及子宮中同樣檢測到了TLR1-10等受體基因的表達(dá)[8]。所以,推測TLR4與雌性動物生殖免疫的關(guān)聯(lián)性可能表現(xiàn)為其在雌性動物不同生理階段所發(fā)揮出的作用。
鑒于TLR4基因在綿羊胚胎附植期及發(fā)情周期對子宮和孕體分子調(diào)控模式的研究鮮有報道,本試驗(yàn)選擇該受體作為綿羊不同生理階段表達(dá)調(diào)控的目的基因,試圖通過組織表達(dá)譜檢測分析、半定量RT-PCR和實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù),探究其在胚胎附植期和發(fā)情周期的不同階段子宮內(nèi)膜中的差異表達(dá),初步揭示TLR4受體在哺乳動物繁殖免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮的重要作用,也為了解該受體的免疫功能機(jī)制提供了一定的理論數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)動物:來自新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧研究所的試驗(yàn)種羊場。其中中國美利奴細(xì)毛羊30只、湖羊10只。選擇的首要標(biāo)準(zhǔn)是3胎以內(nèi)的成年羊,體質(zhì)量為35~45 kg,個頭適中、體型良好、膘情中上、哺乳性好,無生殖免疫系統(tǒng)等方面的疾病。其次是飼養(yǎng)環(huán)境及各品種綿羊個體之間等無明顯差異。
試驗(yàn)藥劑:孕酮海綿栓(澳大利亞 Intervet Pty.Ltd.,500 mg/支),孕馬血清促性腺激素(PMSG)(浙江寧波第二激素廠,1 000 IU/支),Trizol 試劑(Invitrogen公司),瓊脂糖(Biowest公司),三氯甲烷、異丙醇(北京化工廠),反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ddH2O(北京全式金公司),dNTP、Taq 酶、10×Buffer、DNA Marker(TaKaRa公司),480 SYBR GreenⅠMaster(Roche公司)。
試驗(yàn)儀器:高速冷凍離心機(jī)、可調(diào)式微量移液槍、-80 ℃冰箱(Thermo公司),4 ℃冰箱、微波爐(美的公司),電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),制冰機(jī)(Grant公司),電子分析天平(美國丹佛公司),超凈工作臺(上海博訊公司),電泳儀、紫外分光光度計(Bio-Rad公司),UV凝膠成像系統(tǒng)(Uvitec Cambridge公司),PCR擴(kuò)增儀(Heraeus 公司),圓周振蕩器(IKA公司),高壓滅菌鍋(Sanyo公司),LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche公司)。
1.2 試驗(yàn)方案
首先隨機(jī)把細(xì)毛羊分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 5 組(每組3只),利用孕酮海綿栓與PMSG結(jié)合的方法將綿羊進(jìn)行同期發(fā)情處理,發(fā)情母羊間隔12 h左右采用人工授精,重復(fù)2~3次。其次,再把細(xì)毛羊和湖羊2種綿羊各自隨機(jī)分為 A、B 2組,3只/組,同樣的方法經(jīng)過同期發(fā)情處理。
人工授精后9、13、17、21、25 d,采集細(xì)毛羊妊娠母羊的子宮內(nèi)膜組織以及細(xì)毛羊、湖羊卵泡期和黃體期的子宮內(nèi)膜組織,迅速置于液氮保存?zhèn)溆?并對妊娠21 d 的3只細(xì)毛羊進(jìn)行屠宰,采集其心臟、肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、松果體、垂體以及肌肉、脂肪等12 種組織,迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 試驗(yàn)設(shè)計
試驗(yàn)于2017年5—7月在新疆農(nóng)墾科學(xué)院新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
1.3.1 總RNA的提取和單鏈cDNA的轉(zhuǎn)錄合成 各組織樣品均取100 mg,放入液氮中進(jìn)行研磨處理,然后按照Trizol試劑說明書的步驟分別提取所需綿羊組織的總RNA。利用紫外分光光度計測定出RNA的D值(D260 nm/D280 nm)和濃度,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。所提總RNA的D值在1.8~2.0之間,且沒有蛋白和基因組污染,符合試驗(yàn)要求。單鏈cDNA的轉(zhuǎn)錄合成按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書結(jié)合試驗(yàn)所需進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
1.3.2 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank中綿羊TLR4基因mRNA序列(XM_012111214.1),應(yīng)用軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(表1),引物跨內(nèi)含子并處在基因的高保守區(qū)域,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.3.3 TLR4基因克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 μL,反應(yīng)體系:10× buffer 2.5 μL,dNTP 2.0 μL,TLR4上下游引物F/R各 0.5 μL,Taq酶0.5 μL,ddH2O 16.0 μL,cDNA模板3.0 μL。PCR 反應(yīng)優(yōu)化條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,DNA測序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成,經(jīng)鑒定所得序列正確。
1.3.4 組織表達(dá)譜分析 按照上述方法分別提取妊娠 21 d 母羊心臟、肝臟、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮、小腸、膀胱、松果體、垂體、肌肉、脂肪等12種組織的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA單鏈。再根據(jù)所設(shè)計的TLR4上下游引物F/R對其單鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以綿羊GAPDH基因作為內(nèi)參基因,根據(jù)該持家基因指數(shù)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物的灰度調(diào)整各組織初始模板的濃度,并與TLR4目的基因指數(shù)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物的灰度進(jìn)行比值,進(jìn)而利用半定量法分析出TLR4基因在所選的12種組織中的相對表達(dá)水平。
1.3.5 實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測 采集2種不同生理狀態(tài)下的細(xì)毛羊和湖羊的各個不同時期不同階段的子宮內(nèi)膜組織,分別提取它們的總RNA,同樣反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA單鏈,然后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。根據(jù)所設(shè)計的TLR4上下游引物F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同樣以綿羊GAPDH基因作為內(nèi)參基因,進(jìn)行同樣條件下的定量擴(kuò)增和檢測。反應(yīng)體系 20.0 μL,包括2×SYBR premix EX Taq TM 10.0 μL,上下游引物F/R各0.4 μL,ddH2O 7.2μL,模板cDNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s,60 ℃ 復(fù)性 15 s,72 ℃延伸20 s,共45 個循環(huán)。擴(kuò)增完成后,進(jìn)行熔解曲線的分析,并判斷擴(kuò)增過程及產(chǎn)物的特異性。每個檢測樣品設(shè)置3個重復(fù),定量分析結(jié)果由LightCyeler 480分析軟件自動分析。
1.4 統(tǒng)計分析
通過實(shí)時熒光定量PCR獲得目的基因和持家基因的CT值,采用2-ΔΔCT法計算TLR4基因的相對表達(dá)量。利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,結(jié)果以柱狀圖顯示各時期不同階段的基因差異表達(dá)。
2 結(jié)果與分析
2.1 綿羊TLR4基因的克隆
利用GenBank中綿羊TLR4基因mRNA序列(XM_012111214.1),以綿羊子宮內(nèi)膜組織cDNA 第一鏈為模板,經(jīng)擴(kuò)增和測序,獲得一條長度為165 bp的目的片段(圖1)及長度為149 bp的GAPDH內(nèi)參基因片段(圖2)。PCR產(chǎn)物送測序公司測序,是所設(shè)計的目的基因片段。
2.2 綿羊TLR4基因的組織表達(dá)譜分析
運(yùn)用半定量RT-PCR檢測方法,以綿羊GAPDH作為內(nèi)參基因,檢測了TLR4目的基因在妊娠21 d母羊不同組織中的差異表達(dá)情況。由圖3、圖4可知,TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體中出現(xiàn)高表達(dá),在肝臟、小腸、肌肉中出現(xiàn)低表達(dá),而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá)。
2.3 綿羊TLR4目的基因和GAPDH內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線和熔解曲線分析
由圖5、圖6可知,實(shí)時熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線顯示,擴(kuò)增產(chǎn)物的“S”形曲線都很清晰,檢測到的熒光信號峰值較高,TLR4目的基因和GAPDH內(nèi)參基因的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺期也很明顯,線性范圍也很廣。TLR4基因從22~34個循環(huán)可檢測出,GAPDH從19~31個循環(huán)可檢測出,表現(xiàn)出較為完整的擴(kuò)增曲線。熔解曲線分析表明,熔解曲線呈現(xiàn)單峰,說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一,其熒光強(qiáng)度均來源于特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物,而沒有產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和引物二聚體,說明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好,結(jié)果具有很好的代表性。
2.4 綿羊TLR4基因在不同品種綿羊卵泡期和黃體期母羊子宮內(nèi)膜的表達(dá)分析
本試驗(yàn)旨在研究TLR4基因在綿羊胚胎附植期和發(fā)情周期子宮內(nèi)膜中mRNA表達(dá)情況,采用了實(shí)時熒光定量 RT-PCR 方法,以綿羊GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)ε咛ジ街财诤桶l(fā)情周期各不同階段的子宮內(nèi)膜TLR4基因表達(dá)水平進(jìn)行了跟蹤檢測。由圖7可知,TLR4基因在附植期不同階段懷孕母羊子宮內(nèi)膜組織中,17 d表達(dá)水平最低,25 d表達(dá)水平最高;9~25 d TLR4基因表達(dá)呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢,胚胎附植期不同階段的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。
由圖8、圖9可知,無論是細(xì)毛羊還是湖羊,TLR4基因在其子宮組織中的表達(dá)水平均是黃體期>卵泡期,且差異顯著(P<0.05),但不同品種綿羊之間的表達(dá)差異并不明顯。
3 討論
關(guān)于人和小鼠的TLR4的研究報道比較多,表明了其在免疫、疾病和感染等方面發(fā)揮著重要的作用[9-11],但在有關(guān)綿羊繁殖方面的研究較少,而且對TLR4免疫分子機(jī)制研究也相對較少。
本試驗(yàn)首次采用半定量RT-PCR方法對妊娠21 d母羊全身組織進(jìn)行表達(dá)譜分析研究,結(jié)果顯示TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體等與繁殖和免疫相關(guān)的組織器官中呈現(xiàn)高表達(dá),在肝臟、小腸、肌肉中呈現(xiàn)低表達(dá),而在心臟、垂體、脂肪等組織中不表達(dá)。2011年聶奎等在文獻(xiàn)報道中稱在兔的胸腺、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟等組織中均檢測到TLR4 mRNA的表達(dá)[12]。周作勇等研究發(fā)現(xiàn),TLR4 mRNA在雛雞胸腺、腸道、肌肉和脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性的差異[13]。而2006年Higgs等在文章中報道,TLR4主要在雞的骨髓中表達(dá),而在脾臟、肝臟、小腸、法氏囊和盲腸等組織中表達(dá)水平低或者不表達(dá)[14]。同樣,Alvarez等在豬的組織器官中研究發(fā)現(xiàn),TLR4 mRNA在其胸腺和淋巴結(jié)中表達(dá)量較高,在其他組織中表達(dá)量較低[15]。Nishimura等針對胎兒和成人的組織以及細(xì)胞樣品進(jìn)行了采集研究,結(jié)果表明TLR4 mRNA在脾臟表達(dá)量最高[16]。綜上結(jié)果,不僅說明了TLR4 mRNA表達(dá)具有組織特異性,而且在繁殖和免疫器官中TLR4的高表達(dá)也暗示了該受體可能與繁殖及免疫機(jī)制存在某種關(guān)聯(lián)。
胚胎和子宮內(nèi)膜在時空上互相辨認(rèn)、容受并產(chǎn)生黏附性關(guān)聯(lián),是哺乳動物胚胎附植成功與否的重要環(huán)節(jié),在此過程當(dāng)中涉及到了相互之間的復(fù)雜分子調(diào)控進(jìn)程。在反芻動物的胚胎附植過程當(dāng)中,囊胚在附植期會出現(xiàn)顯著性的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變。通常情況下,綿羊囊胚在配種發(fā)育8 d后從透明帶中孵出,呈直徑約200 μm球形,11 d起由球形變成管形;發(fā)育14 d時變成纖絲狀,到17 d時達(dá)到25 cm以上[17]。同時,囊胚的伸長也是附植開始的顯著性標(biāo)志,滋養(yǎng)層細(xì)胞的快速伸長對維持妊娠非常重要,它可以使孕體盡快與子宮內(nèi)膜產(chǎn)生黏附且抑制前列腺素的分泌。綿羊妊娠14 d胚胎滋養(yǎng)層絨毛與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞開始接觸,并在妊娠16~18 d產(chǎn)生黏附,絨毛不停伸長而呈現(xiàn)出血管,妊娠30 d時與子宮阜的組織構(gòu)成“母包子型”胎盤[18]。
本試驗(yàn)針對細(xì)毛羊胚胎附植期5 個不同階段的母羊子宮內(nèi)膜進(jìn)行了熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)妊娠9~17 d母羊子宮內(nèi)膜TLR4基因的表達(dá)水平逐漸下降,且在17 d胚胎附植點(diǎn)的表達(dá)量最低。在此過程中,雌激素的致敏和孕激素的生理作用是子宮產(chǎn)生生理變化的主要因素。孕激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體的分泌;雌激素除促使子宮內(nèi)膜增生外,還促進(jìn)了子宮釋放蛋白水解酶,繼而促使透明帶溶解和滋養(yǎng)層細(xì)胞增生,滋養(yǎng)層漸漸浸入子宮上皮和基質(zhì)層,進(jìn)而引起胚胎的附植。TLR4信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子NF-κB被證實(shí)可調(diào)節(jié)妊娠相關(guān)組織中促炎癥因子(IL-1β、TNF-α等)以及前列腺素的產(chǎn)量,繼而通過IL-1β來促進(jìn)子宮頸的成熟與擴(kuò)張,通過前列腺素、E2來刺激分娩[19]。所以,TLR4受體mRNA表達(dá)在附植點(diǎn)17 d降低之后,至25 d mRNA的表達(dá)量又逐漸升高,且表現(xiàn)出顯著性差異。
在動物發(fā)情周期中,隨著動物生殖器官(如卵巢和子宮內(nèi)膜)的生理變化以及損傷再修復(fù)過程,TLR4的表達(dá)量會有顯著變化[20]。因?yàn)樾约に夭粌H可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)和組織形態(tài),而且還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的匯集和分布。例如,人類子宮中發(fā)現(xiàn)大量的NK細(xì)胞,并且隨著發(fā)情周期變化NK細(xì)胞以不斷增加的趨勢分布于子宮內(nèi)膜[21-22]。已證實(shí)在發(fā)情周期TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9和TLR10基因在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)變化[23]。雌激素水平在生殖期相對于分泌期較高,同時孕酮水平在分泌期相對于生殖期要高。這表明,在雌性哺乳動物生殖系統(tǒng)特別是在子宮內(nèi)膜中,雌激素對TLRs的表達(dá)起抑制作用,而孕酮對TLRs表達(dá)起促進(jìn)作用,Jorgenson等發(fā)現(xiàn)了TLR3在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)有周期依賴性[24]。
本試驗(yàn)對細(xì)毛羊和湖羊的卵泡期和黃體期研究發(fā)現(xiàn),TLR4基因在其子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平均出現(xiàn)黃體期>卵泡期。這與Jorgenson等的研究結(jié)果[24]一致。在卵泡期雌激素水平逐漸升高至最大,促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚,子宮頸上皮生長、增高呈高柱狀,增強(qiáng)深層腺體分泌活動,黏液分泌量也逐漸增多,子宮肌收縮活動也逐漸增強(qiáng),卵泡逐漸發(fā)育增大。而在黃體期,大量的孕激素分泌,作用于子宮,內(nèi)膜血管增生,子宮變粗,腺體分泌活動性加強(qiáng),子宮肌收縮受到抑制。所以,這一研究結(jié)果也得到了理論知識的支撐。
綜上試驗(yàn),本研究得出TLR4基因在輸卵管、卵巢、子宮、膀胱、脾臟及松果體等免疫組織器官中呈現(xiàn)出高表達(dá)水平,說明了該受體基因在組織中的表達(dá)特異性。其mRNA在綿羊不同生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)呈現(xiàn)動態(tài)時空特征,初步揭示TLR4受體在哺乳動物繁殖免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。
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