張麗娟，楊金先，陳 強(qiáng)，李英英，葛均青

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

牛蛙(RanacatesbianaShaw)是一種可食用的大型蛙類，原產(chǎn)于北美，1958年引進(jìn)我國(guó)，20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始規(guī)?；B(yǎng)殖[1]。牛蛙的適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖迅速、生長(zhǎng)快，并且其肉白味美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，受到了廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，因此養(yǎng)殖牛蛙的產(chǎn)量也年年攀高，成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一[2]。隨著規(guī)?；⒓s化養(yǎng)殖形式的不斷增大，牛蛙的病害問(wèn)題也日益嚴(yán)重。

牛蛙的病害主要有細(xì)菌性疾病、寄生蟲(chóng)病、病毒性疾病等。細(xì)菌性疾病主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)等革蘭陰性菌引起的腹水病、紅腿病，鏈球菌(Streptococcus)引起的腐皮病[3-4]，遲鈍愛(ài)德華菌(Edwardsiellatarda)引起的牛蛙愛(ài)德華菌病[5]等。細(xì)菌性疾病暴發(fā)后，及時(shí)找到病因并對(duì)癥給藥能夠在很大程度上減少損失。寄生蟲(chóng)主要有體表的蚧螨、蛭、吸血蟲(chóng)等[6]，體內(nèi)消化道、呼吸道的嶺南隱彎吸蟲(chóng)[7]、中華擬后盤吸蟲(chóng)[8]等，牛蛙的寄生蟲(chóng)病可以通過(guò)改善蛙的生活環(huán)境及餌料衛(wèi)生來(lái)預(yù)防，可定期添加抗生素來(lái)驅(qū)除寄生蟲(chóng)。牛蛙的病毒性疾病主要為蛙虹彩病毒病，蛙虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)會(huì)跨物種感染不同的水生動(dòng)物，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了越來(lái)越多的關(guān)注[9]。

RGV屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)，蛙病毒屬(Ranavirus)，在我國(guó)是1996年從沼澤綠牛蛙中首次分離[10]。PCV是一類胞漿型雙鏈DNA病毒，平面呈六邊形，表面為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)[11]，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，可數(shù)月存活于土壤和水體中并保持感染性[12]。RGV是一種危害牛蛙的重要病原，具有很強(qiáng)的傳染性，可造成高達(dá)90%的死亡率，宿主感染后發(fā)病快，表現(xiàn)為食欲減退、行動(dòng)遲緩，四肢發(fā)紅出血，少數(shù)腹部鼓起等特征[13]。

本研究從發(fā)病牛蛙中分離培養(yǎng)出一株病毒，經(jīng)鑒定，確定該病毒為一株RGV，稱之為RGV-FJ；攻毒試驗(yàn)表明，RGV-FJ感染后牛蛙四肢及腹部發(fā)紅出血，內(nèi)臟出血明顯，癥狀與養(yǎng)殖場(chǎng)中患病牛蛙相一致;通過(guò)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)病牛蛙的皮膚、肝臟、腎臟及肺部均有病變產(chǎn)生，且在牛蛙的各組織器官中均檢測(cè)到了RGV-FJ。該病毒能引發(fā)牛蛙全身性感染，且對(duì)牛蛙的致死率高，在感染第4天的累積死亡率達(dá)到94.12%。這為進(jìn)一步開(kāi)展分離病毒的致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞鯉魚(yú)表皮瘤細(xì)胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line，EPC)由本實(shí)驗(yàn)室保存，在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的Leibovitz L-15培養(yǎng)液中27℃培養(yǎng)。

1.2 病毒的細(xì)胞分離2010年10月，福建省某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)傳染性疾病，取發(fā)病牛蛙的肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟器官，勻漿后，取上清液過(guò)濾除菌，接種EPC細(xì)胞，每天觀察和記錄細(xì)胞病變情況，收集上清繼續(xù)接種EPC細(xì)胞進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代3代后，細(xì)胞出現(xiàn)一致的典型病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，表明可能已分離培養(yǎng)出病毒，收集上清-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒粒子的電鏡觀察將收集的病毒培養(yǎng)上清接種到EPC細(xì)胞，待細(xì)胞病變超過(guò)50%，刮取細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，收集EPC細(xì)胞，2.5%戊二醛固定后，1% 鋨酸固定3 h，50%，70%，90%，100%酒精中梯度脫水，樹(shù)脂包埋，超薄切片，切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，在日立透射電鏡HT7700下觀察、拍照。

1.4 病毒的PCR鑒定根據(jù)蛙病毒屬代表種FV3(frog virus 3)主衣殼蛋白基因(major capsid protein，MCP)(GenBank序列號(hào)：AY548484.1)序列設(shè)計(jì)引物MCPF：5′-GAATTCATGTCTTCTGTAACTGG-3′與MCPR：5′-AAGCTTGATTGGGAATCCCATC-3′。用Pure-LinkTMDNA/RNA virus Mini Kit(生工生物工程(上海)股份有限公司)試劑盒提取分離病毒的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)，抽提質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 病毒的滴度測(cè)定將病毒培養(yǎng)上清接種EPC細(xì)胞，第4天細(xì)胞病變超過(guò)80%時(shí)收集病毒培養(yǎng)物，凍融后收集上清，進(jìn)行10倍比稀釋，再接種到96孔培養(yǎng)的EPC細(xì)胞，每個(gè)稀釋度4孔，設(shè)3次重復(fù)，27℃培養(yǎng)至第5天，觀察并記錄細(xì)胞產(chǎn)生CPE的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度TCID50。

1.6 病毒的攻毒試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)牛蛙購(gòu)自福建福州某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為75～100 g/只。將牛蛙隨機(jī)分為2組，每組20只，一組腹腔注射0.2 mL的RGV-FJ病毒(3.2×107TCID50/mL)，作為攻毒組；另一組注射0.2 mL正常EPC細(xì)胞的培養(yǎng)上清，作為對(duì)照組。攻毒后在室溫24～26℃條件下常規(guī)飼養(yǎng)，每天觀察牛蛙的健康狀況，記錄牛蛙的死亡數(shù)量及發(fā)病牛蛙的外觀癥狀。

1.7 牛蛙組織的病理學(xué)觀察分別取攻毒組和對(duì)照組牛蛙的皮膚、肝臟、脾臟、腎臟、肺組織，經(jīng)Bouin氏固定液固定后制成石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H.E)染色后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 牛蛙組織中病毒的電鏡觀察及PCR檢測(cè)取攻毒牛蛙的肺部組織，固定后按上述電鏡觀察方法觀察組織中的病毒粒子。取攻毒組牛蛙的皮膚、腸道、肺、腿部肌肉、肝臟、脾臟、腎臟組織，試劑盒提取病毒DNA，根據(jù)上述獲得的MCP序列，設(shè)計(jì)特異性引物RGV-F(5′-CAGTCGTCTCCCTCCCTACA-3′)和RGV-R(5′-AGGTGTAATTGGAGCCGA-CG-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.9 病毒的重新分離與鑒定取攻毒組牛蛙的肝臟、脾臟、腎臟及肺等組織，經(jīng)勻漿、過(guò)濾后接種EPC細(xì)胞，進(jìn)行RGV-FJ的分離培養(yǎng)，觀察和記錄細(xì)胞病變情況。取病毒感染細(xì)胞，提取病毒DNA，以RGV的特異性引物RGV-F和RGV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 牛蛙病毒的細(xì)胞分離鋪滿單層的EPC細(xì)胞接種病蛙組織勻漿液后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞從第2天開(kāi)始出現(xiàn)圓縮、脫落，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，脫落細(xì)胞增多，到第4天有80%的細(xì)胞發(fā)生病變；隨著病變細(xì)胞增多，鋪滿培養(yǎng)瓶的單層細(xì)胞形成了網(wǎng)狀(圖1A)；而對(duì)照細(xì)胞排列緊密，貼壁嚴(yán)實(shí)，細(xì)胞形態(tài)飽滿(圖1B)。

A.感染病毒的EPC細(xì)胞；B.對(duì)照EPC細(xì)胞

2.2 病毒的電鏡觀察收集感染病毒的EPC細(xì)胞，在透射電鏡下觀察，在細(xì)胞內(nèi)觀察到呈晶格狀排列的病毒粒子，病毒粒子具囊膜，直徑約150 nm(圖2)。這與虹彩病毒粒子的特征是一致的，推測(cè)其可能是一株虹彩病毒。

圖2 病毒粒子的電鏡觀察

2.3 病毒的PCR鑒定根據(jù)蛙病毒屬代表種FV3 MCP基因設(shè)計(jì)特異性引物，提取分離病毒的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1條與預(yù)期大小一致的條帶(圖3A)。將該片段連接至pMD19-T載體后，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切驗(yàn)證(圖3B)，陽(yáng)性克隆測(cè)序后獲得1條1 392 bp的核苷酸序列，序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，該序列與多株蛙虹彩病毒的同源性超過(guò)98%。將該序列與GenBank中虹彩病毒科各屬代表種的同源序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)，結(jié)果表明，該病毒株隸屬于蛙病毒屬，將其稱之為RGV-FJ。

A.MCP基因的PCR擴(kuò)增；B.pMD19-T-MCP雙酶切驗(yàn)證

圖4 基于MCP核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 病毒感染牛蛙的患病癥狀通過(guò)腹腔注射方式攻毒研究分離病毒的致病性，結(jié)果顯示，攻毒組牛蛙在第2天開(kāi)始出現(xiàn)四肢及腹部發(fā)紅出血，尤其是后肢出血癥狀更為明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，出血癥狀越來(lái)越明顯，到第4天發(fā)病牛蛙通體泛紅，顏色變深(圖5A),而對(duì)照組未見(jiàn)明顯發(fā)病癥狀(圖5B)。解剖后，攻毒組牛蛙的肝臟失血變白，腫脹(圖6A)，對(duì)照組牛蛙肝臟顏色鮮紅，邊緣銳利(圖6B)；攻毒組牛蛙肺部出血明顯(圖6C)，對(duì)照組未見(jiàn)明顯出血癥狀(圖6D)；攻毒組牛蛙的腎臟出血，顏色較深(圖6E)，對(duì)照組腎臟顏色較淺，未見(jiàn)明顯出血癥狀(圖6F)。

A.攻毒組牛蛙；B.對(duì)照組牛蛙

A.攻毒組肝臟；B.對(duì)照組肝臟；C.攻毒組肺；D.對(duì)照組肺；E.攻毒組腎臟；F.對(duì)照組腎臟

2.5 病毒感染牛蛙的組織病理學(xué)觀察組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，攻毒組牛蛙皮膚的黏液層細(xì)胞腫脹、排列紊亂，細(xì)胞間紅細(xì)胞浸潤(rùn)，顆粒腺內(nèi)蓄積大量不規(guī)則黏液顆粒，上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性和壞死(圖7A)，而對(duì)照組皮膚黏液層細(xì)胞較平整，細(xì)胞間未見(jiàn)明顯紅細(xì)胞浸潤(rùn)，顆粒腺內(nèi)未見(jiàn)不規(guī)則黏液顆粒(圖7B)。攻毒組牛蛙肝臟細(xì)胞腫脹或萎縮，空泡變性、壞死，排列紊亂；門靜脈與肝組織剝離，紅細(xì)胞滲出且腫脹成不規(guī)則形態(tài)(圖7C)；對(duì)照組肝臟細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)完整(圖7D)。攻毒組牛蛙的腎小管管腔變窄，上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，細(xì)胞界限模糊，大量紅細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7E)；對(duì)照組腎臟的腎小管管腔圓滿，界限清晰(圖7F)。攻毒組牛蛙的肺部囊泡細(xì)胞排列紊亂，有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)、淤積(圖7G)；對(duì)照組肺部的囊泡細(xì)胞排列較整齊(圖7H)；攻毒組脾臟局部細(xì)胞空泡變性(圖7I)；對(duì)照組脾臟排列緊密，結(jié)構(gòu)完整(圖7J)。

A.攻毒組皮膚；B.對(duì)照組皮膚；C.攻毒組肝臟；D.對(duì)照組肝臟；E.攻毒組腎臟；F.對(duì)照組腎臟；G.攻毒組肺；H.對(duì)照組肺；I.攻毒組脾臟；J.對(duì)照組脾臟

2.6 病毒感染牛蛙組織中病毒的電鏡觀察及PCR鑒定取攻毒組牛蛙的病變組織，切片后透射電鏡觀察，從肺部切片中發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞內(nèi)形態(tài)特征一致的單個(gè)病毒粒子，直徑大小約150 nm(圖8)。

圖8 RGV-FJ感染牛蛙肺中病毒粒子的電鏡觀察

利用PCR檢測(cè)攻毒組牛蛙各組織中的病毒感染情況，結(jié)果顯示，肝臟、脾臟、腎臟、腸道、肌肉、皮膚和肺中均檢測(cè)到RGV-FJ(圖9A)，而對(duì)照組牛蛙的相對(duì)應(yīng)組織中均未檢測(cè)到RGV-FJ(圖9B)。這表明，腹腔注射RGV-FJ引起了牛蛙全身性系統(tǒng)感染。

A.攻毒組組織；B.對(duì)照組組織。1～7.分別為肝臟、脾臟、腎臟、腸道、肌肉、皮膚和肺；8.陰性對(duì)照；9.陽(yáng)性對(duì)照

2.7 RGV-FJ對(duì)牛蛙的致死作用牛蛙腹腔注射RGV-FJ后第2天出現(xiàn)發(fā)病癥狀并開(kāi)始發(fā)生死亡，攻毒第4天后死亡率為94.12%，對(duì)照組牛蛙在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，存活率為100%(圖10)。

圖10 RGV-FJ感染后牛蛙的存活情況

2.8 RGV-FJ的重新分離與鑒定取攻毒組牛蛙的肝臟、脾臟、腎臟及肺等內(nèi)臟組織，勻漿后接種EPC細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示，EPC細(xì)胞出現(xiàn)了病毒感染的CPE，細(xì)胞圓縮脫落，形成漁網(wǎng)狀(圖11A)，對(duì)照組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞貼壁嚴(yán)實(shí)(圖11B)。利用RGV-FJ的特異性引物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的單一條帶(圖12)。這表明，從腹腔注射RGV-FJ的牛蛙主要內(nèi)臟器官中重新分離出RGV-FJ。

A.感染病毒的EPC細(xì)胞；B.對(duì)照EPC細(xì)胞。

M.DL600 Marker;1.攻毒組；2.對(duì)照組

3 討論

虹彩病毒是一類可以對(duì)魚(yú)類、兩棲類、爬行類等宿主造成多器官感染，且致死率極高的病毒。該病毒呈六邊形，直徑大小為120～300 nm[14]。根據(jù)致病癥狀及宿主等差異，虹彩病毒科可分為6個(gè)屬，分別是虹彩病毒屬(Iridovirus)、綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、腫大虹彩病毒屬(Megalocytivirus)、蛙病毒屬(Ranavirus)[11]和十足目虹彩病毒屬(Decapodiridovirus)[15]。蛙病毒屬可感染魚(yú)類、兩棲類和爬行類，其代表株蛙病毒3型(frog virus 3，F(xiàn)V3)于1962年從蛙腫瘤勻漿中分離得到[16]。張奇亞等[17]分析了3株從牛蛙分離到的病毒RGV-9506、RGV-9807、RGV-9808，其MCP基因序列相同，且與FV3非常相似。劉曉東等[13]從牛蛙分離到一株虹彩病毒FJ049，其MCP與RGV-9808的MCP同源率達(dá)到99.8%。本研究中，我們分離的RGV-FJ與FV3的同源性超過(guò)97%，確定該病毒隸屬于蛙病毒屬。

幼蛙感染RGV后，出現(xiàn)腿部紅腫，腹部出血，肝腫大等癥狀[18]，這與本研究中患病牛蛙的體表特征及病理癥狀一致。BRAND等[19]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)V3病毒在25℃時(shí)對(duì)兩棲動(dòng)物的致病性相較于在10℃時(shí)顯著，在25℃條件下林蛙感染病毒后第4天開(kāi)始死亡，而在10℃條件下感染死亡率極低。MIAUD等[20]從患病林蛙中分離到一株病毒(Common midwife toad virus,CMTV)對(duì)成年林蛙造成了100%的致死作用，林蛙的死亡是在感染后第10天開(kāi)始，到第15天累積死亡率為100%。本研究中分離的RGV-FJ毒株在室溫(24～26℃)對(duì)牛蛙的致病性強(qiáng)，感染牛蛙第2天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，到第4天累計(jì)死亡率達(dá)到94.12%，這與養(yǎng)殖場(chǎng)中牛蛙快速暴發(fā)病癥并造成大規(guī)模死亡相一致，這可能與病毒的毒力較強(qiáng)有關(guān)，其致病機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

目前，開(kāi)展的蛙虹彩病毒病研究包括虹彩病毒檢測(cè)新方法的建立[21-23]及滅活疫苗的研制[24-25]等。明確養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的致病病原是實(shí)現(xiàn)疾病有效防控的基礎(chǔ)，本研究從患病牛蛙中分離病毒，經(jīng)電鏡觀察、細(xì)胞分離培養(yǎng)及對(duì)MCP基因序列的測(cè)序并比對(duì)，確定其屬于蛙病毒屬，對(duì)該病毒進(jìn)行致病性研究，這為進(jìn)一步研究蛙虹彩病毒病的防治措施奠定基礎(chǔ)。