常曉冉,林 倩，錢明珠，胡俊英，李 欣，古麗巴哈爾·圖爾蓀,王新平，3*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450；3.吉林大學(xué) 人獸共患病研究所 教育部人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

腸道病毒(enterovirus,EV)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員，是引起人類與動(dòng)物臨床上以消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為特征疾病的病原體[1-3]。腸道病毒目前分為12個(gè)腸道病毒種和3個(gè)鼻病毒種，其中E種腸道病毒(EV-E)和F種腸道病毒(EV-F)統(tǒng)稱為牛腸道病毒(BEV)，主要感染牛只[4-6]。作為小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員之一，BEV為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，具有典型的二十面體立體對(duì)稱的球形結(jié)構(gòu)。病毒粒子大小為 25～30 nm，基因組全長為7 300～7 500 bp?；蚪M中僅有1個(gè)開放閱讀框(ORF)，可直接作為mRNA翻譯出1個(gè)前體多聚蛋白，該蛋白經(jīng)過一系列降解，形成4種結(jié)構(gòu)蛋白( VP1、VP2、VP3 和VP4) 和7種非結(jié)構(gòu)蛋白( 2A、2B、2C、 3A、3B、3C和3D)[7-8]。在腸道病毒的4種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1、VP2和VP3位于病毒粒子表面，病毒主要抗原表位位于其上，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體[9]。而7種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯等過程中發(fā)揮重要作用。

BEV的分類經(jīng)歷了多次變動(dòng)。目前，依據(jù)病毒基因組序列的差異，國際病毒分類委員會(huì)將BEV分為EV-E和EV-F 2個(gè)種，前者包括EV-E1～EV-E5共5種基因型，后者包括EV-F1～EV-F7共7種基因型。在腸道病毒中，VP1蛋白是病毒基因組編碼的衣殼蛋白，暴露在病毒粒子最外部，該蛋白可構(gòu)成2個(gè)重要結(jié)構(gòu)“峽谷”和“口袋結(jié)構(gòu)”。二十面體五重軸周圍的凹陷稱為“峽谷”[10]；而疏水性“口袋結(jié)構(gòu)”主要暴露在峽谷的表面，可以穩(wěn)定病毒粒子。腸道病毒通過VP1與特異性受體(如SCARB2)結(jié)合感染細(xì)胞，導(dǎo)致疏水“口袋結(jié)構(gòu)”從“峽谷”底部排除，進(jìn)而引起病毒不穩(wěn)定,這種不穩(wěn)定可能是基因組釋放的前提[11]。VP1含有6個(gè)表面環(huán)(BC、DE、BE/aB、GF、GH和HI)，主要位于二十面體五重軸周圍，暴露在病毒粒子表面，是病毒的主要可變區(qū)域[12]。VP1蛋白富集多個(gè)中和表位區(qū)，因而被認(rèn)為是中和抗體的主要靶標(biāo)，具有最多的型特異性中和位點(diǎn)。由于VP1蛋白編碼基因序列與病毒血清型具有較高的相關(guān)性，通過擴(kuò)增全長VP1序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹與對(duì)比VP1區(qū)核苷酸同源性進(jìn)而判斷所分離病毒的血清型[13]。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)河南省牛群BEV感染進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)河南省不同地區(qū)的牛群存在BEV感染。為了進(jìn)一步確定河南省不同地區(qū)感染的BEV毒株的遺傳變異與分子差異，本研究應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增了不同BEV毒株的VP1基因，并進(jìn)行了序列測定與比對(duì)分析，確定出BEV毒株的分子差異，為河南省BEV的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理待檢糞便樣品如參考文獻(xiàn)[14]所示，采集于河南省5個(gè)地區(qū)(編號(hào)為RZ、ZM、JX、SQ、XX) 的5個(gè)奶牛場有腹瀉癥狀的病牛群，其處理方法參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器DMEM購自Gibco (美國) 公司;胎牛血清(FBS)購自?？寺∩锕?Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒、Premix Taq 酶，均購自 TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pGM-T載體試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀，購自杭州博日科技有限公司;電泳儀，購自上海天能科技有限公司;顯微鏡，購自上海立光精密儀器有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)基因文庫收錄的部分EV-E和EV-F腸道病毒的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)合成1對(duì) EV-E和EV-F的特異性引物，用于擴(kuò)增BEV的VP1基因序列。EV-E引物序列為EV-E-S:5′-CGAGACCGGTGCAACATCCA-3′,EV-E-AS:5′-CGGGGGCCCTTCGGTATC-3′;EV-F引物序列為EV-F-S:5′-TGGCGGAATTGGTAGGTGGATAGT-3′,EV-E-AS:5′-AGGTGTTTGGGCTTCGCATAGA-3′。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4 病毒分離及培養(yǎng)將病料以PBS按照1∶5(W/V)比例稀釋后，8 000 r/min離心10 min,上清液用0.45 μm濾器過濾，然后將濾液接種于生長密度為70%的單層Vero細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中感作2 h后棄掉接種物，以 Hank’s 液洗滌細(xì)胞2次后，加入含有2% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每4～6 h 觀察細(xì)胞1次。細(xì)胞接種病料48 h 后，將其反復(fù)凍融3次，收集病毒液，置于-80℃保存。將收獲的病毒液連續(xù)傳至第5代，-80℃ 保存。

1.5 病毒分離株抗原交叉的檢測采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)進(jìn)行[14]。將分離病毒株接種單層Vero細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)30%左右的病變后，以甲醇于-20℃固定15～20 min。以兔源抗HY12病毒 VP1多克隆抗體和兔源抗SD-S67 毒株VP1多克隆抗體為一抗[15-16]，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗，經(jīng)顯色后置于顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。同時(shí)設(shè)置陰性血清對(duì)照和未接毒細(xì)胞對(duì)照。

1.6 病毒RNA的提取及VP1基因序列的擴(kuò)增應(yīng)用天根生化科技有限公司的TRIzol 試劑盒提取BEV陽性樣品或細(xì)胞分離毒株的RNA，然后以Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒進(jìn)行病毒cDNA的合成。應(yīng)用PCR方法，以上述合成的cDNA為模板，擴(kuò)增VP1基因。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

1.7 PCR產(chǎn)物或陽性克隆的序列測序?qū)CR產(chǎn)物直接進(jìn)行序列測定或?qū)CR擴(kuò)增的目的DNA片段連接到T載體上，酶切鑒定得到的陽性質(zhì)粒送至上海生工有限公司測序。

1.8 序列比對(duì)分析采用文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行。應(yīng)用Lasergene DNAStar和MEGA 7.0軟件將測序獲得的樣本序列與GenBank中BEV代表毒株的VP1序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析，確定獲得序列之間的同源性及差異性。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離及其致細(xì)胞病變特征單層Vero細(xì)胞接種處理樣品后，一般于12～24 h后開始出現(xiàn)細(xì)胞皺縮變圓、聚集、透光性增強(qiáng)，之后細(xì)胞逐漸脫落死亡等病變現(xiàn)象(圖1A～C)。少數(shù)樣品盲傳2～5代才能觀察到明顯的細(xì)胞病理變化。病毒分離結(jié)果如圖1所示。

A～C.代表毒株接種Vero細(xì)胞引起的細(xì)胞病變；D.正常細(xì)胞對(duì)照

2.2 分離毒株間免疫學(xué)交叉反應(yīng)以IPMA檢測分離毒株感染的細(xì)胞，確定分離毒株與EV-E和EV-F參考毒株間是否存在交叉反應(yīng)。結(jié)果如圖2所示，應(yīng)用抗HY12-VP1和SD-S67-VP1的多克隆抗體，檢測分離的EV-F及EV-E代表毒株。與未接毒的細(xì)胞相比(圖2G，H)，在接毒細(xì)胞的胞漿中觀察到大量的、信號(hào)非常強(qiáng)或比較強(qiáng)的染色(圖2A，B,D,E)。同時(shí)，應(yīng)用EV-E和EV-F抗血清檢測正常細(xì)胞(圖2G,H)以及兔陰性血清檢測EV-E和EV-F接毒細(xì)胞及正常細(xì)胞(圖2C,F,I)時(shí)，均未觀察到信號(hào)。上述結(jié)果說明分離毒株與EV-E和EV-F參考毒株之間存在著免疫學(xué)交叉反應(yīng)。

A.D,G.HY12毒株高免血清檢測分離的EV-E、EV-F和正常細(xì)胞對(duì)照結(jié)果；B,E,H.SD-S67高免血清檢測分離的EV-E、EV-F和正常細(xì)胞對(duì)照結(jié)果；C,F,I.兔陰性血清檢測分離的EV-E、EV-F和正常細(xì)胞對(duì)照結(jié)果(40×)

2.3 PCR擴(kuò)增分離毒株VP1基因的結(jié)果應(yīng)用EV-E和EV-F特異性引物，進(jìn)行VP1基因的PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3所示，獲到了預(yù)期大小的目的條帶。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.EV-E樣品；9～11.EV-F檢測樣品；N.陰性對(duì)照

2.4 河南省牛群存在EV-E和EV-F病毒感染將擴(kuò)增出VP1基因片段進(jìn)行序列測定與比對(duì)分析，結(jié)果如圖4所示。河南省不同地區(qū)分離毒株HeN-A2、HeN-A3、HeN-B72、HeN-B78、HeN-B81、HeN-B83、HeN-B84、HeN-C4之間的同源性為70.2%～98.6%，與國內(nèi)首株E種腸道病毒HY12毒株VP1序列的同源性為69.3%～80.3%。其中分離株HeN-C4和HeN-A3與HY12的同源性比較低，只有69.3%和69.5%，而HeN-A2與HY12同源性最高，其同源性為80.3%；與國外BEV病毒株比較，結(jié)果HeN-B84與BEV-K2577的同源性最高，僅為78.1%(紅色方框所示)。與此同時(shí)，上述8株病毒與EV-F同源性只有50.3%～58.4%(綠色方框所示)，依據(jù)腸道病毒種的分類標(biāo)準(zhǔn)，上述8株病毒應(yīng)分類為EV-E毒株。

BEV分離株HeN-A12、HeN-B62和HeN-YR91與EV-F代表株具有較高的同源性，其中HeN-A12與國內(nèi)首株EV-F毒株BHM26的同源性為68.6%，而與SD-S67的同源性最高，為88.8%，其次與Alpaca-KC748420的同源性比較高，為82.2%；HeN-YR91分離株與BHM26毒株的同源性為70.8%，與SD-S67毒株的同源性為73.7%；而HeN-B62與其他EV-F腸道病毒的同源性相比于HeN-A12和HeN-YR91毒株來說比較低，同源性為54%～76.9%(黃色方框所示)。同時(shí)，與EV-E病毒株相比，3株分離株與其同源性為53.6%～58.7%(藍(lán)色方框所示)，表明3株分離株分類為EV-F毒株。所述結(jié)果表明，河南省牛群中同時(shí)存在著EV-E和EV-F的混合感染。

圖4 BEV河南分離株與國內(nèi)外BEV代表毒株VP1核苷酸序列同源性比較

2.5 河南省BEV毒株的遺傳多樣性與基因型差異應(yīng)用MEGA 7.0 軟件將分離毒株的序列比對(duì)分析后，采用臨近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖5所示。河南省不同地區(qū)分離株可以分為4個(gè)不同的分支，其中HeN-A2、HeN-A3、HeN-B72、HeN-B78、HeN-B81、HeN-B83、HeN-B84、HeN-C4這8株分離株與EV-E毒株同屬于一個(gè)大分支，表明上述8株分離株均屬于EV-E。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)河南省牛群中EV-E存在2種不同的基因型，分離株HeN-A2與HY12和國外分離得到的毒株D-14-3-96同屬于一個(gè)分支，且同源性最高，為EV-E3；HeN-B81、HeN-B72、HeN-B83、HeN-B78、HeN-B84、HeN-A3和HeN-C4與國外分離到的K2577、SL305、PS42和PS83毒株同屬于一個(gè)分支，表明這7株河南分離毒株為EV-E2分離株HeN-A12、HeN-B62和HeN-YR91與EV-F同屬于一個(gè)大分支。進(jìn)一步分析顯示，3株病毒株存在著2種不同的基因型。其中HeN-A12和HeN-YR91分離株與本實(shí)驗(yàn)室分離得到的F種羊源腸道病毒SD-S67同屬于一個(gè)分支，為EV-F1；而HeN-B62與毒株EV-F4血清型的代表毒株BEV-Enterovirus-W1同源性最高，同屬于一個(gè)分支，為EV-F4。

▲.BEV新分離株序列；○.2012年及2018年實(shí)驗(yàn)室分離的EV-E和EV-F毒株

3 討論

BEV感染可引起一種臨床上以嚴(yán)重消化道、呼吸道癥狀為特征的傳染病，母牛感染后引起繁育障礙如不孕或流產(chǎn)等，某些牛只呈現(xiàn)隱性感染。本病最早于1959年由MOLL等[2]首次報(bào)道，之后國外許多國家也報(bào)道有本病的發(fā)生與流行。國內(nèi)LI等[6]于2008年從內(nèi)蒙古腹瀉犢牛體內(nèi)分離出我國第一株F種腸道病毒。之后邢澤黎等[15]于2012年從吉林省某發(fā)病牛群中分離出國內(nèi)首株E種腸道病毒 HY12毒株，并對(duì)其分子特性以及遺傳變異等情況進(jìn)行研究。對(duì)吉林省不同地區(qū)分離的BEV毒株的遺傳變異進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，BEV毒株的同源性存在明顯差異[18]。BEV屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬的成員，為單股正鏈RNA病毒。根據(jù)病毒基因組非結(jié)構(gòu)蛋白和5’UTR序列的差異，可將其分為EV-E和EV-F 2個(gè)種。 而同一腸道病毒種依據(jù)VP1結(jié)構(gòu)蛋白序列的差異又可進(jìn)一步分為不同的基因型。截止目前，EV-E分為5個(gè)基因型(EV-E1～EV-E5)，EV-F分為7個(gè)基因型(EV-F1～EV-F7)。河南省為國內(nèi)牛羊養(yǎng)殖大省，有關(guān)BEV感染及其病毒株的差異缺乏研究。本研究應(yīng)用前期制備的抗HY12-VP1和SD-S67-VP1多克隆抗體，對(duì)從河南省分離的11株BEV進(jìn)行IPMA試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離毒株分別與HY12毒株(EV-E)和SD-S67毒株(EV-F)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。同時(shí)比較分析不同毒株的序列差異，發(fā)現(xiàn)河南省牛群中同時(shí)存在著E種和F種腸道病毒感染[19]。其中，HeN-A2、HeN-A3、HeN-B72、HeN-B78、HeN-B81、HeN-B83、HeN-B84和HeN-C4這8株病毒株為E種腸道病毒；分離毒株HeN-A12、HeN-B62和HeN-YR91為EV-F。對(duì)不同毒株VP1基因進(jìn)行了擴(kuò)增、序列測定與分析，分離的8株E種腸道病毒可進(jìn)一步分類為EV-E2和EV-E3，而HeN-A12及HeN-YR91與羊源F種腸道病毒SD-S67同屬于EV-F1， HeN-B62與EV-F4血清型代表毒株BEV-Enterovirus-W1屬于EV-F4。本研究揭示出河南省分離BEV的遺傳變異及毒株的分子差異，發(fā)現(xiàn)牛群中同時(shí)存在著EV-E和EV-F毒株的混合感染，確定了分離毒株的基因型，上述結(jié)果為今后河南省BEV的預(yù)防及深入研究奠定了基礎(chǔ)。