侯蕾 馬源婧 霍欣欣 史學(xué)麗

小分子RNA（microRNA，miRNA）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性短鏈RNA［1］。有研究表示，其可以通過(guò)種子序列與靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)域（3′UTR）的核苷酸互補(bǔ)配對(duì)，直接降解沉默靶mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)［2］。miR-221/222 是內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的微小RNA，均定位于人X 染色體中，兩者的轉(zhuǎn)錄本和種子序列相同，有高度的同源性［3］。目前，miR-221/222 已被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程密切相關(guān)，并可作為腫瘤治療的生物標(biāo)記物［4］。在乳腺癌中，miR-221/222 在侵襲性較低的雌激素受體-α（estrogenreceptor-α，ERα）陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-221 可以直接作用于ERα3′UTR區(qū)，與ERα 的表達(dá)相關(guān)。而ERα 是目前乳腺癌內(nèi)分泌治療的金標(biāo)準(zhǔn)，他莫昔芬（Tomaxifen，TAM）則是目前臨床中內(nèi)分泌治療的一線用藥，其也作為ERα的阻斷劑被廣泛應(yīng)用于臨床。有研究表示［5］，microRNA 可以通過(guò)藥物特定的方法影響乳腺癌細(xì)胞的化療過(guò)程中耐藥性，一些內(nèi)源性的microRNA 與TAM 的耐藥及細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡相關(guān)；而miR-221/222 的靶基因與抑癌基因p27Kip1，凋亡因子c-kit、Bmf 相關(guān)，其可通過(guò)調(diào)控抑癌基因及凋亡因子參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究擬探究miR-221/222 與乳腺癌ERα 表達(dá)與他莫昔芬敏感性關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例和標(biāo)本

分析2019年1月至2021年12月石家莊市婦幼保健院104 例經(jīng)乳腺癌切除術(shù)的患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均為女性；②首次接受乳腺癌切除術(shù)治療的患者；③臨床相關(guān)資料完成的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者。其中患者均為單側(cè)乳腺浸潤(rùn)性癌，平均年齡（49.33±8.65）歲，按美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)《AJCC 癌癥分期手冊(cè)》［6］進(jìn)行TNM 分期，其中Ⅰ期28 例、Ⅱ期64 例、Ⅲ期12例。癌組織標(biāo)本取自癌灶中央組織，癌旁組織取自距癌組織邊緣≥1 cm 的組織。

1.2 免疫組織分析

所有組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定、70%無(wú)水乙醇梯度脫水、石蠟包埋并切割成4 μm 的切片，對(duì)組織免疫組化染色，嚴(yán)格按照SP試劑盒的操作標(biāo)準(zhǔn)完成操作。

閱片時(shí)隨機(jī)選擇10 個(gè)視野觀察細(xì)胞的表達(dá)情況，由兩名資深閱片師，采用雙盲法獨(dú)立閱片（已知陽(yáng)性片）。采用強(qiáng)度和數(shù)量積分相乘的方法對(duì)組織表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中強(qiáng)度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［7］如下：陰性（-）計(jì)0分，淺棕色為弱陽(yáng)性（+）計(jì)1 分，棕色為中度陽(yáng)性（++）計(jì)2 分，深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）計(jì)3 分；其中和+為低表達(dá)，++和+++為高表達(dá)。量化評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)［8］如下：陰性計(jì)為0 分，＜25%計(jì)為1 分，5%（含）～50%計(jì)為2 分，50%（含）～75%計(jì)為3分，≥75%計(jì)為4 分。

1.3 RNA 提取

根據(jù)RNA 提取試劑盒的操作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)組織的總RNA 進(jìn)行提取。將組織標(biāo)本收集至EP 管中，加入1 mLTrizol 試劑，并使用組織研磨器進(jìn)行研磨裂解處理；將組織與試劑充分混合后加入200 μL 氯仿，震蕩30 s 后靜置5～10 min。在1 200 rpm（離心半徑為10 cm）離心后，取上清液，在加入500 μL 異丙醇沉淀離心，棄上清液，加入75%乙醇充分漂洗震蕩后，離心棄上清液；將RNA 充分干燥后，加入20 μL DEPC 水溶解。采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。

1.4 細(xì)增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率

將ERα 陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃、25%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中孵育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ERα 陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞，將其分為空白對(duì)照組、miR-221 抑制組、miR-222 抑制組、miR-221/222 抑制組，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染；在轉(zhuǎn)染后，給予2MLTAM 5 μg/mL。

在轉(zhuǎn)染后24、48 h 時(shí)取，采用MTT 法對(duì)各組吸光度（OD490）值進(jìn)行測(cè)定，將孔板染色，每孔加20 μL MTT（5 mg/mL）工作液，常規(guī)培養(yǎng)4 h 后，吸去MTT 后在每孔中加入150 μL DMSO 慢搖混勻，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD 值，重復(fù)測(cè)定3 次后取平均值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-處理組A/空白對(duì)照組A）×100%。

在轉(zhuǎn)染后24、48 h 時(shí)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞。接種培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)液后加入PBS 洗滌兩次，0.25%胰酶消化細(xì)胞后加完全培養(yǎng)基，離心棄上清，PBS 重懸計(jì)數(shù)，離心后棄去上清；在加入Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，依次加入V-FTTC5μL、PI 10 μL 染色液。在室溫下避光孵育5 min 以上后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 24.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（）表示，行t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-221/222 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平比較

miR-221/222 在乳腺癌中的表達(dá)水平為（4.32±0.88）、（3.46±0.85）明顯高于相應(yīng)癌旁乳腺組織（2.32±0.76）、（2.15±0.59），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-221/222 在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平比較Figure 1 Comparison of the expression levels of Mir-221/222 in breast cancer tissues and adjacent tissues

2.2 miR-221/222 與乳腺癌病理組織表達(dá)的相關(guān)性

miR- 221/222 的表達(dá)水平在ER-α 表達(dá)陰性、PR 表達(dá)陰性組均顯著高于陽(yáng)性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-221/222 的表達(dá)水平在Her-2 表達(dá)陽(yáng)性顯著高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在三陰性分子亞型中的表達(dá)顯著高于Her-2 過(guò)表達(dá)型、luminal A 及l(fā)uminal B1 型乳腺癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miR-221/222 的表達(dá)水平與患者的年齡、TNM 分期無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組織中miR-221/222 表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性（±s）Table 1 Expression level of Mir-221/222 in breast cancer tissues and clinicopathological indicators Correlation（±s）

表1 乳腺癌組織中miR-221/222 表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性（±s）Table 1 Expression level of Mir-221/222 in breast cancer tissues and clinicopathological indicators Correlation（±s）

n年齡F/t 值0.856 P 值0.394 F/t 值1.922 P 值0.057 TNM 分期2.586 0.080 1.939 0.149 ERα 表達(dá)4.936＜0.001 7.039＜0.001 PR 表達(dá)3.723＜0.001 5.357＜0.001 Her-2 表達(dá)3.414＜0.001 9.827＜0.001分子分型病理指標(biāo)≥50＜50Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性陽(yáng)性luminal A luminal B Her-2 過(guò)表達(dá)型三陰型38 66 16 58 30 32 72 44 60 58 44 13 44 30 17 miR-221 相對(duì)表達(dá)水平4.16±0.65 4.28±0.71 4.11±0.76 4.25±1.03 4.69±0.98 4.88±1.05 3.92±0.85 4.70±1.06 4.01±0.83 4.16±1.25 4.96±1.06 3.52±0.81 3.99±0.76 4.51±0.97 4.98±0.72 10.243＜0.001 miR-222 相對(duì)表達(dá)水平4.45±0.58 4.20±0.67 3.52±0.85 3.84±0.72 4.05±1.12 4.51±1.23 3.13±0.75 4.26±0.97 3.34±0.78 3.31±0.75 4.88±0.86 3.20±0.63 3.67±0.54 4.35±0.65 4.76±0.74 23.127＜0.001

2.3 各組細(xì)胞的增殖抑制率比較

在轉(zhuǎn)染24、48 h 的各組的細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-221 抑制組與對(duì)照組轉(zhuǎn)染后24、48 h細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于其余三組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞的增殖抑制率比較（±s）Table 2 Comparison of proliferation inhibition rates among all groups（±s）

表2 各組細(xì)胞的增殖抑制率比較（±s）Table 2 Comparison of proliferation inhibition rates among all groups（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與miR-221 抑制組比較，bP＜0.05；與miR-222 抑制組比較，cP＜0.05。

組別空白對(duì)照組miR-221 抑制組miR-222 抑制組miR-221/222 抑制組F 值P 值6 6 6 6轉(zhuǎn)染24 h 后3.62±0.79 3.81±0.84 3.75±0.80 6.88±1.03abc 19.736＜0.001轉(zhuǎn)染48 h 后22.86±2.33 23.06±2.95 24.82±3.50 45.07±7.13abc 36.091＜0.001

2.4 各組細(xì)胞凋亡率比較

轉(zhuǎn)染后24、48 h 各組的細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，miR-221 抑制組與對(duì)照組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞凋亡率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-222 抑制組與miR-221 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞凋亡率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-221/222 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h 細(xì)胞凋亡率高于其余三組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s）Table 3 Comparison of apoptosis rates in each group（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與miR-221 抑制組比較，bP＜0.05；與miR-222 抑制組比較，cP＜0.05。

組別空白對(duì)照組miR-221 抑制組miR-222 抑制組miR-221/222 抑制組F 值P 值n6 6 6 6轉(zhuǎn)染24 h 后5.84±1.96 6.02±2.05 6.28±1.88 8.86±1.67abc 3.36 0.039轉(zhuǎn)染48 h 后46.65±7.62 48.36±8.32 47.86±8.47 74.33±6.90abc 17.46＜0.001

3 討論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，其發(fā)生于乳腺上皮組織，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康安全。乳腺癌作為雌激素依賴性的腫瘤，與雌激素水平密切相關(guān)，ERα 及PR 均為特殊功能蛋白，對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)發(fā)展有一定的調(diào)節(jié)作用［9］，測(cè)定ERα 和PR 的表達(dá)情況對(duì)于乳腺癌的進(jìn)展、治療等具有一定的意義。近年研究表示，miRNA 可以通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲等相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的過(guò)程；且miRNA 在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)存在一定差異，因此提示miRNA 與乳腺癌的發(fā)生個(gè)發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)［10］。

本研究結(jié)果表示，miR-221/222 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)癌旁乳腺組織。miRNA 可以下調(diào)凋亡程序性細(xì)胞死亡因子4 和Fas配體表達(dá)，抑制凋亡通路誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞過(guò)度增殖，致使腫瘤發(fā)生；同時(shí)還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境來(lái)影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，同時(shí)，其能上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）表達(dá)［11］，從而促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管生成，加快腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)展。外源性高表達(dá)的miR-221/222 可使影響細(xì)胞增殖分化的FOXO3 蛋白和使可以抑制G1/S 轉(zhuǎn)換的P27 的表達(dá)下降，從而使MCF-7 細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)變及細(xì)胞增殖。miRNA 表達(dá)作為乳腺癌發(fā)生的重要影響因素，miRNA 的表達(dá)異常與乳腺癌的病理學(xué)特征也有一定的關(guān)系。在本研究中miR-221/222 的表達(dá)水平在ERα 表達(dá)陰性、PR 表達(dá)陰性組均顯著高于陽(yáng)性表達(dá)組，miR-221/222 的表達(dá)水平在Her-2 表達(dá)陽(yáng)性顯著高于陰性組；在三陰型分子的表達(dá)顯著高于Her-2 過(guò)表達(dá)型、luminal A 及l(fā)uminal B1 型乳腺癌。ER 包含ERα 和ERβ 兩個(gè)亞型，乳腺癌細(xì)胞ERα 和ERβ 的表達(dá)水平均會(huì)對(duì)癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生一定的影響，ERβ 可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，ERα 則可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖［12］。miR-221/222的表達(dá)水平在ERα 表達(dá)陰性組明顯高于陽(yáng)性組，也提示miR-221/222 參與ERα 表達(dá)，對(duì)ER-α 表達(dá)有著負(fù)調(diào)節(jié)作用，影響著調(diào)節(jié)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。且miR-221/222 可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1 和周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B，從而加快癌細(xì)胞進(jìn)入S 期，并通過(guò)靶向磷酸酶和張力蛋白同源物/蛋白激酶B 通路使乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行自我更新，影響乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力，因此miR-221/222 在三陰型乳腺癌中表達(dá)較高。

乳腺癌作為雌激素依賴性腫瘤，乳腺癌的發(fā)生與ERα 密切相關(guān)［13］，且乳腺癌中miR-221/222過(guò)表達(dá)可降低ER-α 的表達(dá)，且下調(diào)miR-221/222可以部分恢復(fù)ER-α 的表達(dá)和對(duì)他莫昔芬的敏感性。本研究中，miR-221/222 抑制組轉(zhuǎn)染后24、48 h細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組、miR-221 抑制組、miR-222 抑制組；共抑制miR-221/222 可明顯降低細(xì)胞的增殖率和凋亡率，與方煜彤等研究結(jié)果一致［14］。也提示，抑制miR-221/222 可增加ER-α 陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)TAM 的敏感性，抑制miR-221/222 的表達(dá)可能會(huì)是影響臨床對(duì)于內(nèi)分泌耐藥治療靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-221/222 水平與腺癌患者的ERα 表達(dá)相關(guān)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)ERα 的表達(dá)水平影響乳腺癌的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，同時(shí)可影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM 的敏感性，miR-221/222 有望成為乳腺癌預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，但還需要大量樣本及數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步研究和證實(shí)。