王曉溪，徐慧星，王 博，王 欣，李 強(qiáng)，蒙艷麗，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是由肺炎支原體(Mycoplsma pneumoniae, MP)引起的以肺間質(zhì)病變?yōu)橹鞯募毙苑尾垦装Y。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1是目前研究最為廣泛的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子之一，具有較多的生物學(xué)功能，包括激發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等[1]。肺炎支原體感染可導(dǎo)致TGF-β1高表達(dá)，與氣道炎癥和膠原蛋白在氣道的沉積關(guān)系密切，且與肺炎支原體嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。目前，臨床上主要使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療MPP，不良反應(yīng)大、副作用強(qiáng)，耐藥率高[3-4]。因此，開發(fā)能夠治療MPP的中藥研究顯得尤為重要。

紫菀是治療呼吸系統(tǒng)疾病常用藥，具有止咳化痰功效。據(jù)《本草綱目》記載，其花、根均可入藥，味辛、苦，性溫，歸肺經(jīng)。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，其主咳逆上氣，胸中寒熱結(jié)氣，去蠱毒痿蹶，安五臟。《名醫(yī)別錄》中也記載其“療咳唾膿血，止喘悸，五勞體虛，補(bǔ)不足，小兒驚癇”。紫菀具有潤(rùn)肺下氣、消痰止咳的作用。在臨床上，紫菀頻現(xiàn)于治療支氣管肺炎、小兒肺炎、咳嗽等方劑中[5]。有研究表明，紫菀具有抗MP的作用[6]，但其作用機(jī)制仍不明確。

本研究預(yù)通過觀察紫菀水提液對(duì)肺炎支原體感染小鼠肺組織病理變化、細(xì)胞凋亡及肺組織中子TGF-β1表達(dá)的調(diào)控作用，探討紫菀治療肺炎支原體肺炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 紫菀藥材購(gòu)自于哈爾濱市同仁堂，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定屬菊科植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根及根莖。紫菀水提液的制備：稱取紫菀211.5 g，浸泡30 min，加水煎煮2 次，每次1.5 h，過濾后合并濾液。在60 ℃恒溫條件下，濃縮至相對(duì)密度為1.35的浸膏，備用。阿奇霉素：石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：274180404。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只C57小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部購(gòu)買，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黑)2009-001。小鼠飼養(yǎng)于GLP實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 PPLO：美國(guó)BD公司，批號(hào)：7110677；胎牛血清：美國(guó)Hyclone公司，貨號(hào)：SH30070.03；RNA提取試劑盒：中國(guó)Tiangen公司，貨號(hào)：DP419；Real-time PCR試劑盒：美國(guó)Promega公司，貨號(hào)：A6020；PBS緩沖液：中國(guó)Solarbio公司，批號(hào)：P1010；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：G004-1；TGF-β1引物：上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 M200多功能酶標(biāo)儀：奧地利TECAN公司； FACSCalibur流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司；MYSPIN-12迷你離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司； ST-16R型低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Line Gene 9600 Real-Time PCR儀：中國(guó)杭州博日科技有限公司；BX41熒光顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.5 肺炎支原體培養(yǎng) 肺炎支原體(ATCC 15531)：美國(guó)American Type Culture Collection。于無(wú)菌操作臺(tái)配制肺炎支原體培養(yǎng)基，已滅活的PPLO基礎(chǔ)培養(yǎng)基140 mL，0.5 mL青霉素溶液，4 mL 50%葡萄糖注射液，20 mL酵母浸液，已滅活胎牛血清40 mL，均用微孔濾膜除菌后混合，4 ℃保存?zhèn)溆?。肺炎支原體的傳代培養(yǎng)方法參照楊志敏等[7]的實(shí)驗(yàn)方法。以1∶9的比例傳代菌液，待菌液顏色由紅色變?yōu)辄S色時(shí)，表明MP培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性，方可進(jìn)行小鼠滴鼻造模。

1.6 小鼠分組、造模及給藥 將C57小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、 模型對(duì)照組、 陽(yáng)性對(duì)照組和紫菀高、中、低劑量組。除正常組外，其余各組小鼠采用滴鼻法感染造模。予 20 μL (1×106CCU)肺炎支原體滴鼻，連續(xù)3 d。造模成功后，紫菀各劑量組給予紫菀水提液0.49、 0.98、 1.95 g/kg 灌胃，陽(yáng)性組予阿奇霉素32 mg/kg灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥 14 d； 正常對(duì)照組及模型對(duì)照組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 肺組織病理學(xué)觀察 末次給藥后禁食水12 h，戊巴比妥麻醉小鼠，脫頸椎處死，取肺組織，生理鹽水清洗后，置于10 %甲醛溶液中浸泡，24 h后，進(jìn)行石蠟包埋、切片，將組織切片浸泡于二甲苯溶液中，再浸泡于不同濃度乙醇溶液中，依次進(jìn)行蘇木素和伊紅染色，顯微鏡觀察病理情況改變。

1.7.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組小鼠新鮮肺組織50 mg置于無(wú)菌1.5 mL離心管中，手術(shù)剪刀剪碎后，加入1 mL PBS緩沖液，放入全自動(dòng)4 ℃低溫研磨機(jī)，充分研磨2 min，1 000 r/min 常溫離心3 min，離心半徑8 cm，去上清，再次加入1 mL PBS緩沖液輕輕重懸，過細(xì)胞篩，1 000 r/min常溫離心3 min，棄上清，每組加入500μL細(xì)胞凋亡結(jié)合液后，待用。正常對(duì)照組分為4管，1管不做處理；2管加入5 μL Annexin V混勻后，室溫避光孵育10 min；3管加入5 μL PI混勻后，室溫避光孵育10 min；4管分別加入5 μL Annexin V、5 μL PI混勻后，室溫避光孵育10 min；模型對(duì)照組、紫菀各劑量組及陽(yáng)性組均與正常組第4 管處理方式相同。正常組1、2、3管用于調(diào)試機(jī)器參數(shù)，第4管用于正式上樣，所有樣本處理完畢后，上機(jī)檢測(cè)。

1.7.3 Real-time PCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA表達(dá) 取各組小鼠肺組織剪碎后，加入Trizol試劑，用于的RNA提取。酶標(biāo)儀檢測(cè)各組RNA的濃度，將各組樣品的RNA濃度稀釋至100 mg/L。按照一步法 Real-time PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟檢測(cè)目的基因TGF-β1 mRNA表達(dá)水平。引物基因序列如下：TGF-β1-forward primers 5′-GCT GAG CGC TTT TCT GAT CCT-3′，reverse primer 5′-CGA GTG TGC TGC AGG TAG ACA-3′。采用2-ΔΔCt分析方法，計(jì)算TGF-β1的mRNA表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析方法分析各組間差異，相關(guān)數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理觀察結(jié)果 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果見圖1。正常對(duì)照組小鼠肺組織細(xì)胞形態(tài)完好，無(wú)病理改變。模型對(duì)照組小鼠肺組織可見支氣管間隙變窄，肺泡腔呈現(xiàn)不規(guī)則排列，肺血管內(nèi)充血，肺組織有炎癥變化。各給藥組小鼠肺組織病理形態(tài)變化并不明顯，僅存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE，×200)

2.2 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞凋亡圖四象限的左下(LL)區(qū)表示正常細(xì)胞數(shù)量，以早期凋亡(LR)、晚期凋亡(UR)及凋亡細(xì)胞(UL)總和在細(xì)胞總數(shù)中占百分比表示細(xì)胞的凋亡率，見圖2，表1。通過流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與模型對(duì)照組比較，給藥組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組小鼠肺組織單細(xì)胞懸液流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 各組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率比較

2.3 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 見表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較

3 討論

MPP的發(fā)病機(jī)制有3 種，一種是MP直接侵犯呼吸道，二是MP能夠緊密結(jié)合在呼吸道上皮細(xì)胞上，三是免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的間接免疫致病理?yè)p傷[8]。在肺炎支原體肺炎發(fā)病進(jìn)程中，TGF-β1是執(zhí)行免疫抑制的重要細(xì)胞因子[9]，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制初始T細(xì)胞分化、凋亡、遷移以及細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)、調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)定的作用 [10-11]。并且，在誘導(dǎo)肺泡上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積等方面具有極其重要的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)紫菀水提液通過降低TGF-β1的表達(dá)，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等方面上發(fā)揮作用。

紫菀含有的化學(xué)成分種類多，其中含有的活性成分也比較多。除具有鎮(zhèn)咳祛痰功效外，紫菀還具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、通便利尿等多種作用[13]。目前對(duì)其藥效學(xué)、藥理學(xué)研究尚不完善。本研究通過觀察結(jié)果顯示：紫菀水提液可修復(fù)感染MP小鼠肺組織的病理?yè)p傷、抑制小鼠肺組織細(xì)胞的凋亡以及降低小鼠肺組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)；說明紫菀能夠減輕MP造成的肺損傷，抑制MPP病理進(jìn)程。一方面，紫菀發(fā)揮其對(duì)MP的抑制作用，另一方面發(fā)揮其抗炎的作用。此研究為治療肺炎支原體肺炎的中藥新藥研發(fā)及臨床研究奠定了一定的基礎(chǔ)，并為紫菀藥材的開發(fā)利用提供依據(jù)。