趙日雜，張英秀，王君軍，蘇學(xué)燕，張紹山，張志鋒

基于DNA條形碼鑒別緣毛紫菀及狹苞紫菀

趙日雜，張英秀，王君軍，蘇學(xué)燕，張紹山，張志鋒*

西南民族大學(xué)藥學(xué)院 四川省羌彝藥用資源保護與利用技術(shù)工程實驗室，四川 成都 610225

基于ITS2和rbcL序列對來自不同地理環(huán)境的緣毛紫菀及狹苞紫菀進行分子鑒定。以ITS2和rbcL的特異性引物，擴增緣毛紫菀及狹苞紫菀的ITS2和rbcL的序列并測定，運用MEGA7.0軟件進行多重比對分析和種間種內(nèi)遺傳距離分析，構(gòu)建鄰接法（neigbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。ITS2序列在緣毛紫菀及狹苞紫菀的變異位點較rbcL序列豐富，且種間與種內(nèi)的變異位點數(shù)無交叉；ITS2序列的NJ樹可將緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品進行有效區(qū)分，而rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹無法使緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品得到有效的區(qū)分；ITS2及rbcL序列的遺傳距離結(jié)果顯示緣毛紫菀之間的遺傳距離很近，而狹苞紫菀之間的遺傳距離較遠。ITS2較rbcL序列更適合用于不同產(chǎn)地的緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品的鑒定；狹苞紫菀的種內(nèi)差異較大。

緣毛紫菀；狹苞紫菀；ITS2序列；rbcL序列；分子鑒定

藏紫菀是藏族、維吾爾族、蒙古族等少數(shù)民族常用草藥，具有清熱解毒、鎮(zhèn)咳祛痰的功效。因藏紫菀特殊的生長環(huán)境，使其擁有獨特的藥理作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)及化學(xué)成分研究揭示藏紫菀具有多種成分及藥理活性，包括抗氧化及抗缺氧等作用[1-5]。目前作為藏紫菀使用的藥材為菊科紫菀屬植物中的緣毛紫菀Franch.，然而在藏醫(yī)經(jīng)典著作《晶珠本草》和《藏藥志》中，紫菀屬多種植物均能作為藏紫菀入藥，而狹苞紫菀W. W. Sm. et J. F. Jeffr.作為其中的一種，分布較廣，產(chǎn)量較大，在藏醫(yī)藥中較為常用，但緣毛紫菀及狹苞紫菀形態(tài)特征相近，利用傳統(tǒng)的基原鑒定和性狀鑒定難以準(zhǔn)確快速地進行鑒別，因此，需要建立一種快速、準(zhǔn)確鑒別緣毛紫菀及狹苞紫菀的新方法。

DNA條形碼技術(shù)因其簡單高效的特點已廣泛應(yīng)用于藥用植物的鑒別研究[6-10]，用于植物鑒定的DNA條形碼有ITS2、rbcL、Matk、psbA-trnH和ITS等序列，其中ITS2（internal transcribed spacers 2）及編碼核酮糖1,5-二磷酸羧化酶大亞基的rbcL序列，因具有良好的擴增成功率和物種水平的鑒定成功率，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物種與屬的鑒定[11-16]，而緣毛紫菀和狹苞紫菀的DNA條形碼尚未有相關(guān)研究，故本研究選擇rbcL及ITS2序列，綜合評估其對緣毛紫菀和狹苞紫菀的鑒別能力，建立緣毛紫菀及狹苞紫菀的DNA barcoding分子鑒定方法，為藏紫菀的品種整理和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

本實驗所收集的18份樣品均屬野外實地采集，并經(jīng)西南民族大學(xué)張志鋒教授鑒定為緣毛紫菀及狹苞紫菀，其中YM1～YM9為菊科紫菀屬植物緣毛紫菀Franch.，XB1～XB9為菊科紫菀屬植物狹苞紫菀W. W. Sm. et J. F. Jeffr.。藥材標(biāo)本保存于西南民族大學(xué)民族藥標(biāo)本館，樣品信息見表1。

1.2 試劑

引物（北京擎科生物科技有限公司）；植物基因組DNA試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）；2×T5PAGEmix（Tsingke）、TSINGKE 高純度低電滲瓊脂糖（Tsingke）、DL5000 Marker（Tsingke）。

1.3 儀器

Legend Micro17型離心機（Thermos公司，德國）；2720 thermal cycler型PCR儀（Applied Biosystems）；JY300C型電泳儀、JYDF型電泳槽、JY04S-3C型凝膠成像儀（北京君意東方公司）；DFD-700型水浴鍋（北京中興偉業(yè)公司）；L550型板式離心機（cence公司）；DFD-700型水浴鍋（北京中興偉業(yè)公司）。

表1 緣毛紫菀及狹苞紫菀的采集信息

Table 1 Collecting information of A. souliei and . farreri

種名編號采集地經(jīng)度 (E)緯度 (N)海拔/m 緣毛紫菀YM1四川康定機場101°45′04.62″30°08′04.62″4 290.60 YM2四川康定曾差101°38′16.89″30°09′41.89″3 667.50 YM3西藏芒康拉妥鄉(xiāng)98°41′29.22″29°13′59.20″3 999.80 YM4四川康定瓦澤鄉(xiāng)101°40′10.99″30°10′26.20″3 751.90 YM5四川德格縣海子山99°37′45.84″31°42′26.81″4 079.40 YM6西藏貢覺縣曲貢村99°02′01.90″32°01′06.05″4 095.60 YM7西藏貢覺列青95°28′54.33″32°51′12.18″4 183.60 YM8四川紅原安曲98°10′08.43″31°09′07.69″3 511.00 YM9四川茂縣雅都鄉(xiāng)98°30′37.81″30°30′33.06″3 012.30 狹苞紫菀XB1四川松潘川主寺103°30′48.82″32°54′07.89″4 010.90 XB2四川紅原縣壤口村102°26′40.66″32°19′51.42″3 894.70 XB3青海夏河縣完墾尕瑪102°39′10.60″34°56′42.10″3 272.40 XB4四川紅原縣查真梁子102°36′53.01″32°20′12.10″3 814.70 XB5四川白玉縣阿察鎮(zhèn)99°35′11.46″31°01′30.22″3 910.70 XB6四川理塘查克日100°15′29.37″30°14′55.84″4 050.40 XB7四川紅原縣壤口村102°26′40.66″32°19′51.42″3 894.70 XB8四川紅原縣加當(dāng)村102°34′50.52″32°03′39.78″3 353.70 XB9四川鄉(xiāng)城香巴拉鎮(zhèn)99°45′34.26″28°57′10.16″3 919.70

2 方法

2.1 樣品DNA的提取、PCR擴增及測序

分別取緣毛紫菀及狹苞紫菀的干燥組織約20 mg，加液氮充分研磨，研磨后置于1.5 mL離心管中，然后用植物基因組DNA試劑盒（北京擎科生物科技有限公司）進行總DNA的提取，用2%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop檢測DNA的提取結(jié)果。ITS2、rbcL序列擴增所用引物及PCR反應(yīng)條件見表2。所用PCR反應(yīng)試劑為北京擎科生物科技有限公司所生產(chǎn)的2×I5Mix，總反應(yīng)體系為30 μL：2×I5Mix 15 μL；DNA模板1 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；ddH2O 12 μL。擴增產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)觀察并采集圖片，將電泳條帶單一、清晰、明亮的 PCR 擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

表2 PCR擴增引物與擴增程序

Table 2 PCR amplification primers and amplification procedures

條形碼序列引物名稱堿基序列 (5’→3’)擴增條件 ITS22RGACGCTTCTCCAGACTACAAT98 ℃變性3 min；98 ℃變性10 s；56 ℃，退火20 s，72 ℃延伸20 s（38個循環(huán)）；72 ℃延伸5 min 2FATGCGATACTTGGTGTGAAT rbcLRCTTTTAGTAAAAGATTGGGCCGAG98 ℃變性3 min；98 ℃變性10 s；58 ℃，退火20 s；72 ℃延伸20 s（38個循環(huán)）；72 ℃延伸5 min FATGTCACCACAAACAGARACTAAAGC

2.2 數(shù)據(jù)分析

運用MEGA 7.0軟件[17]對緣毛紫菀及狹苞紫菀的ITS2及rbcL序列做ClustalW多序列比對，并計算種內(nèi)和種間的Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離、分析變異位點及構(gòu)建（neighbor joining，NJ）樹，以評價ITS2及rbcL序列的鑒別能力。

3 結(jié)果與分析

3.1 緣毛紫菀及狹苞紫菀的PCR擴增

利用ITS2及rbcL序列對18份緣毛紫菀及苞紫菀樣本進行PCR擴增，并采用凝膠電泳對序列進行檢驗，結(jié)果見圖1，其表明2對引物均能夠成功擴增出目標(biāo)條帶，條帶擴增效果良好，條帶清晰，無拖尾；緣毛紫菀和狹苞紫菀的ITS2序列和rbcL序列的平均長度為411 bp和906 bp，這些樣品的ITS2序列和rbcL序列在G＋C含量方面具有一定差異，結(jié)果見表3。

3.2 種內(nèi)、種間的遺傳距離分析

運用MEGA 7.0軟件基于K2P遺傳距離模型計算18個緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品的ITS2和rbcL序列的種間和種內(nèi)遺傳距離，計算結(jié)果見圖2。對于ITS2序列，不同產(chǎn)地的緣毛紫菀樣品間的遺傳距離為0～0.01，種內(nèi)親緣關(guān)系很近，不同產(chǎn)地狹苞紫菀之間的遺傳距離為0.84，其中XB1、XB2、XB4、XB5、XB6、XB8狹苞紫菀樣品與緣毛紫菀樣品間的遺傳距離為023～0.24，XB3、XB7、XB9狹苞紫菀樣品與緣毛紫菀樣品間的遺傳距離為1.45～1.46，說明XB3、XB7、XB9與緣毛紫菀樣品親緣關(guān)系最遠；對于rbcL序列，緣毛紫菀之間的遺傳距離為0，XB4、XB6與9個緣毛紫菀樣品間的遺傳距離為0.01，XB1、XB2、XB3、XB5、XB7、XB8、XB9與9個緣毛紫菀樣品的遺傳距離為1.06～1.07，說明XB1、XB2、XB3、XB5、XB7、XB8、XB9與9個緣毛紫菀樣品的種間差異較大。

1～9-YM1—YM9 10～18-XB1—XB9

表3 緣毛紫菀及狹苞紫菀的ITS2和rbcL的序列特征

Table 3 Length and base pair frequency in ITS2 andrbcLsequences from A. souliei and A. farreri

編號ITS2序列rbcL序列 長度/ bp(G＋C)/%長度/ bp(G＋C)/% YM141754.691143.6 YM241754.691043.5 YM341754.691043.5 YM441754.680943.7 YM541754.691043.5 YM641754.680943.7 YM741755.291043.5 YM841754.691043.5 YM941655.091043.5 XB141052.792543.1 XB241052.792543.2 XB340149.692543.1 XB441052.792543.2 XB541052.792543.1 XB641052.792543.1 XB740149.692543.1 XB840852.792543.1 XB939949.692543.1

3.3 種內(nèi)及種間變異分析

對18個樣品的ITS2序列進行分析，發(fā)現(xiàn) ITS2 序列存在247個變異位點，XB3、XB7、XB9與9個不同產(chǎn)地的緣毛紫菀樣品間主要存在的堿基互換有“C”＞“T”“G”＞“T”、“A”＞“G”“C”＞“G”“T”＞“A”“C”＞“A”，XB1、XB2、XB4、XB5、XB6、XB8和9個不同產(chǎn)地的緣毛紫菀樣品間主要存在的堿基互換為“A”＞“G”“T”＞“G”“T”＞“A”、“C”＞“A”“C”＞“T”“G”＞“C”；YM5、YM6、YM8與剩余的其他緣毛紫菀樣品間主要存在“A”＞“T”堿基互換（圖3），說明狹苞紫菀與緣毛紫菀之間存在的變異性較大。對18個樣品的rbcL序列進行分析，發(fā)現(xiàn)rbcL序列存在511個變異位點，XB4、XB6與9個緣毛紫菀樣品間主要存在的堿基互換為“A”＞“G”；XB1～XB3、XB5、XB7～XB9和9個緣毛紫菀樣間主要存在“T”＞“C”“A”＞“T”“A”＞“C”“G”＞“A”“G”＞“C”堿基互換；YM2、YM4和其他緣毛紫菀樣品之間主要存在“C”＞“T”堿基互換（圖4），說明XB4、XB6與緣毛紫菀樣品間存在的變異性不大，而其他狹苞紫菀與緣毛紫菀差異性較大。

1-YM1～YM4、YM6、YM8、YM9 2-XB3、XB7、XB9 3-XB1、XB2、XB4、XB5、XB6、XB8 4-YM7—YM1～YM6、YM8、YM9 5-YM5～YM7、YM9 6-XB1、XB2、XB4、XB6、XB8—YM1～YM4、YM6～YM9 7-XB1、XB2、XB4、XB6、XB8—YM5 8-XB3、XB7、XB9—XB1、XB2、XB4、 XB5、XB6、XB8 9-XB3、XB7、XB9—YM1、YM3、YM4 10-XB3、XB7、XB9—YM7 11-XB3、XB7、XB9—YM2、YM5、YM6、YM8、YM9 12-YM1～YM9 13-XB4、XB6 14- XB1、XB2、XB3、XB8 15-XB4、XB6—YM1—YM9 16-XB7、XB8、XB9—YM1～YM9 17-XB1、XB2、XB3、XB5—YM1、YM3、YM5～YM9 18-XB1、XB2、XB3、XB5—YM2、YM4

圖3 18個緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品的ITS2序列多重比對結(jié)果

圖4 18個緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品的rbcL序列多重比對結(jié)果

3.4 聚類分析

運用MEGA7.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。如圖5所示，基于ITS2序列用鄰接法構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹將18個樣品大致可以分為3個分支。不同產(chǎn)地的9個緣毛紫菀樣品聚為一支；而不同產(chǎn)地的狹苞紫菀聚為2支，分別是XB1、XB2、XB4、XB5、XB6、XB8和XB3、XB7、XB9。如圖5所示，用所得的rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可將18個緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品聚為2支，不同產(chǎn)地緣毛紫菀樣品及XB4、XB6聚為一支，其他的狹苞紫菀樣品聚則為另一支。結(jié)果表明，ITS2序列可將緣毛紫菀與狹苞紫菀有效區(qū)分，而rbcL序列中，因XB4、XB6與緣毛紫菀之間遺傳距離較近，無法與9個緣毛紫菀樣品明顯區(qū)分。

圖5 基于ITS2 (A) 和rbcL (B) 序列構(gòu)建緣毛紫菀及狹苞紫菀的NJ系統(tǒng)聚類樹

4 討論

目前，藏紫菀雖然有相關(guān)的經(jīng)典鑒定方法，如性狀鑒別、薄層鑒別、顯微鑒別[18-19]，但因這些鑒別方法易受個體形態(tài)、大小等特征和完整性的影響，難以實現(xiàn)對中藥材飲片、粉末等材料來源的準(zhǔn)確鑒定，故本研究從分子鑒定方法入手，彌補經(jīng)典鑒定方法的不足，并建立一種快速鑒定緣毛紫菀及狹苞紫菀紫菀的方法。

本研究將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于緣毛紫菀及狹苞紫菀的分子鑒定研究，從基因角度來鑒定不同區(qū)域的18個緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品，根據(jù)遺傳距離、種內(nèi)種間變異及NJ系統(tǒng)聚類樹分析結(jié)果顯示，ITS2序列能使不同產(chǎn)地的緣毛紫菀樣品和狹苞紫菀樣品實現(xiàn)有效區(qū)分，而rbcL序列因XB4、XB6與緣毛紫菀樣品間的遺傳距離很小，以100%的支持率與緣毛紫菀聚為一支，無法使緣毛紫菀及狹苞紫菀樣品達到有效分離，故ITS2序列較rbcL序列更適合用于不同產(chǎn)地緣毛紫菀及狹苞紫菀的鑒別。

由分析結(jié)果可知不同產(chǎn)地的緣毛紫菀相對較保守，親緣性變化很小，基本保持一致，而狹苞紫菀種內(nèi)存在相當(dāng)高的遺傳分化，且部分狹苞紫菀樣品與緣毛紫菀樣品親緣性較為接近，在一定程度上可能是由紫菀屬植物種間基因交流導(dǎo)致的，具體機制還有待深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofandbased on DNA barcode

ZHAO Ri-za, ZHANG Ying-xiu, WANG Jun-jun, SU Xue-yan, ZHANG Shao-shan, ZHANG Zhi-feng

Sichuan Provincial Qiang-Yi Medicinal Resources Protection and Utilization Technology Engineering Laboratory, School of Pharmacy,Southwest Minzu University, Chengdu 610225, China

Based on the ITS2 and rbcLsequences to do molecular identification ofandsamples from different geographical sources.ITS2 and rbcL sequences ofandwere amplified and sequenced with specific primers of ITS2 and rbcL, MEGA7.0 software was used for multiple comparison analysis and intraspecific genetic distance analysis to construct neigbor-joining (NJ) phylogenetic tree.The variation sites of ITS2 sequences inandsamples were richer than those of rbcL sequences, and there was no cross between interspecific and intraspecific. The NJ tree of ITS2 sequence can effectively distinguish the samples ofand, while the phylogenetic tree constructed by rbcL sequence cannot effectively distinguish the samples ofand. The genetic distance of ITS2 and rbcL sequences showed that the genetic distance amongsamples were very close, while the genetic distance amongsamples were far.ITS2 sequence is more suitable for the identification ofandsamples from different habitats than rbcL sequence. And the intraspecies ofsamplesare quite different.

Franch.;W. W. Sm.; ITS2 sequence; rbcL sequence; molecular identification

R286.12

A

0253 - 2670(2022)19 - 6167 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.022

2022-03-06

國家自然科學(xué)基金項目（31870314）；四川省科技廳區(qū)域創(chuàng)新合作項目（2020YFQ0007）；西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項基金項目（2021NYYXS19）

趙日雜（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥鑒定學(xué)。Tel: 13699013572 E-mail: 2490271485@qq.com

張志鋒，博士，研究員，主要從事中藥資源品質(zhì)評價相關(guān)研究。E-mail: zfzhang@swun.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]