張 禹，張 弓，楊沈秋，黃秋思，李佳澤，邵忠林

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院·黑龍江 哈爾濱 150001)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程，也是多種肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段[1-2]。腸道菌群系統(tǒng)是人體最復(fù)雜的系統(tǒng)之一，腸道菌群可以從內(nèi)毒素血癥及腸-肝軸等多種途徑影響宿主的健康，菌群紊亂常發(fā)生在慢性肝病早期，及時(shí)調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，可有效緩解肝臟病變及并發(fā)癥的發(fā)生[3-4]。

肝纖維化在中醫(yī)學(xué)古籍中并沒有明確記載，但關(guān)于肝纖維化病因病機(jī)中肝脾關(guān)系及肝與大腸的關(guān)系確有跡可循，如《醫(yī)學(xué)入門》中提出“肝與大腸相通”。中醫(yī)的脾，主要包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的整個(gè)消化系統(tǒng)，故在臨證中既要重視治肝，更要重視對(duì)脾的治療，做到未病先防。腸道是脾實(shí)現(xiàn)功能的主要部位[5]，故腸道微生態(tài)一定程度上體現(xiàn)了中土思想[6]。

前期實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)軟肝散加味方可降低肝纖維化模型大鼠HIF-1α、VEGF、NF-κB及TGF-β的表達(dá)[7-11]。為進(jìn)一步探討軟肝散加味方對(duì)肝纖維化大鼠腸道菌群的影響，本次研究在“肝腸同治”的理論指導(dǎo)下使用軟肝散加味方進(jìn)行干預(yù)，觀察肝纖維化大鼠肝臟病理、腸道內(nèi)毒素含量、OTUs數(shù)量及alpha與beta多樣性的變化，探討軟肝散加味方治療肝纖維化的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 選擇健康清潔級(jí)雄性SD大鼠66 只，8～10 周齡，體質(zhì)量(200±30)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(黑)2018-004。自由飲食水，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 軟肝散加味方由丹參15 g、茯苓15 g、炙鱉甲20 g、生牡蠣30 g、黨參30 g、白芍15 g、炒白術(shù)12 g、炙甘草10 g、山藥30 g共9 味中藥組成。藥材由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院飲片藥房提供，且符合2020年版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定；上述所有飲片煎煮前浸泡1 h，先煎炙鱉甲與生牡蠣40 min，再加上述其余草藥共同煎煮，水煎液濃縮至5.175 g/mL，置4 ℃冰箱備用[12]。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 無菌豬血清：廣州鴻泉生物科技有限公司提供，批號(hào) 20200101；山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP、GAPDH、鼠單抗：天德悅生物科技有限公司提供；內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒：廈門鱟試劑生物科技股份有限公司。2135型切片機(jī)：德國(guó)萊卡；902-ULTS超低溫冰箱、scientific NANODROP 2000分光光度計(jì)：美國(guó)Therm公司；TECAN M200pro酶標(biāo)儀：由瑞士TECAN公司； Applied BiosystemsABI7500熒光定量PCR儀：由杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；Eclipse TE2000-E 倒置顯微鏡：尼康儀器有限公司。

2 方法

2.1 造模及分組給藥 選擇SD大鼠66只，其中正常對(duì)照組12只，剩余54只進(jìn)行造模。采用未滅活的豬血清腹腔注射，每次0.5 mL/只，每周2 次。固定時(shí)間為周二、周五上午9∶00，連續(xù)8周；正常對(duì)照組每只大鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水。造模結(jié)束后，隨機(jī)抽取6只造模大鼠及正常對(duì)照組大鼠6只取材做病理，證實(shí)模型制作成功。48只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、軟肝散加味方高劑量組、軟肝散加味方中劑量組、軟肝散加味方低劑量組4組，每組12只。低、中、高劑量組大鼠日給藥量分別為20.7、41.4、82.8 g/kg，正常組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

2.2 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束后，每組大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛3.8 mL/kg腹腔注射，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，4 ℃，3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm, 取上清，4 ℃保存。迅速解剖取出肝臟，觀察肝臟的顏色、質(zhì)地，沿肝臟長(zhǎng)軸切取約2 mm厚的肝組織放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)制備肝組織切片；再分別取肝臟組織100 g于液氮中速凍，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。取盲腸部位內(nèi)容物于無菌凍存管中，液氮速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱中，干冰送檢。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 HE染色觀察病理學(xué)變化 肝組織按順序包埋成塊，切片厚4 μm，經(jīng)蘇木素染色5 min，自來水及酒精沖洗；90%伊紅醇溶液中5 min；無水酒精、二甲苯及兩次各5 min；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.3.2 鱟試劑法檢測(cè)腸道內(nèi)毒素的含量 取糞便約1 g，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水1 mL，3 000 g離心10 min收集上清液，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算樣品中內(nèi)毒素濃度。

2.3.3 腸道菌群多樣性分析 提取各組大鼠糞便樣品總DNA，通過PCR擴(kuò)增16SrRNA基因的V3-V4區(qū)(98 ℃持續(xù)30 s，然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，分別是98 ℃持續(xù)10 s，54 ℃持續(xù)30 s，72 ℃持續(xù)45 s，72 ℃持續(xù)10 min，4 ℃)，純化PCR產(chǎn)物。采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果進(jìn)行OTU劃分及Venn圖分析；Alpha多樣性法比較組間菌群豐度及多樣性差異；分類學(xué)組成分析組間不同水平菌群差異；β多樣性分析組間菌群的相似性及差異。

3 結(jié)果

3.1 軟肝散加味方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理變化的影響 HE染色顯示，正常組肝細(xì)胞板排列規(guī)整。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍有較多纖維組織增生，說明造模成功。各給藥組肝組織病理改變有不同程度的改善，其中以高劑量組改善最為明顯，表現(xiàn)為炎細(xì)胞明顯減少，胞質(zhì)融合減輕，低劑量組改善較差。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理變化(HE，×200)

3.2 軟肝散加味方對(duì)肝纖維化大鼠腸道內(nèi)毒素含量的影響 見表1。

表1 各組大鼠腸道內(nèi)毒素含量比較

3.3 軟肝散加味方對(duì)肝纖維化大鼠腸道菌群的影響

3.3.1 OTU劃分及Venn圖分析 見圖2。與模型組比較，軟肝散加味方給藥組大鼠的門、綱、目、科、屬、種6類OTUs地位豐度明顯回調(diào)。

3.3.2 腸道菌群α多樣性分析α多樣性 主要通過Chao1、Observed species、shannon、Simpson等指數(shù)反映豐富度和均勻性。Chao1、Observed species指數(shù)主要反映物種豐富度；Simpson、Shannon主要體現(xiàn)物種豐富度和均勻度。與模型組比較，軟肝散加味方組大鼠腸道菌群豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)顯著回調(diào)(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腸道菌群α多樣性的比較

3.3.3 腸道菌群β多樣性分析 采用主成分分析(PCA)考察大鼠腸道菌群β多樣性的差異。與正常組比較，模型組大鼠菌群明顯分開，兩組菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異。高、中劑量組均趨向于正常組，兩者存在一定親緣關(guān)系。見圖3。

圖3 各組大鼠腸道菌群的PCA及PCoA分析

3.3.4 腸道菌群與結(jié)構(gòu)分析 腸道菌群在菌門水平上，與正常組比較，模型組大鼠腸道菌群具有顯著性差異的菌門有11 個(gè)(P<0.05、0.01)，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Tenericutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、Elusimicrobia下調(diào)，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、大腸桿菌門(Epsilonbacteraeota)上調(diào)，軟肝散加味方各給藥組可著性回調(diào)這11個(gè)菌門(P<0.05、0.01)。

腸道菌群在菌屬水平上，與空白組比較，模型組大鼠腸道菌群具有顯著性差異的菌屬有14 個(gè)(P<0.05、0.01)，Alloprevotella、Roseburia、coccaceae_UCG-005、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Parasutterella下調(diào)，Prevotellaceae_Ga6A1_group、擬桿菌屬(Bacteroides)、 Clostridium_sensu_stricto_1、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Romboutsia、Escherichia-Shigella、Veillonella、Parabacteroides、乳桿菌屬(Lactobacillus)上調(diào)，軟肝散加味方各給藥組可著性回調(diào)這14個(gè)菌屬(P<0.05、0.01)。

4 討論

腸道菌群是指寄居胃腸道中的各種微生物的總稱，人類腸道有多達(dá)400～1 000種不同的微生物[13]。穩(wěn)定的微生物群是健康的標(biāo)志，而菌群失調(diào)和多種疾病有關(guān)，例如本課題組重點(diǎn)研究的肝臟纖維化[14-15]。來自小腸和大腸的靜脈血通過門靜脈匯入肝臟，使肝臟容易受到來自腸道內(nèi)各種抗原的刺激[9]，當(dāng)腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)發(fā)生后，腸道菌群過度生長(zhǎng)，增加致病菌的比例，或腸道防御屏障減弱，增加腸道黏膜對(duì)內(nèi)毒素的通透性，造成LPS異位[16-17]。內(nèi)毒素在進(jìn)入肝臟后可以和肝細(xì)胞上的模式識(shí)別受體TLR4結(jié)合[18]，啟動(dòng)LPS/TLR4途徑[19-20]，使髓樣分化因子88(MyD88)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步激活NF-κB 和AP-1，引起IFN-α、IL-1 等炎性因子的分泌，導(dǎo)致肝臟纖維化的發(fā)生。

肝纖維化在中醫(yī)學(xué)常歸納為“脅痛”“肝著”“黃疸”等疾病范疇[21]。基本病機(jī)可概括為肝脾功能失調(diào)，肝郁乘脾，脾失健運(yùn)，肝郁脾虛日久而致痰阻血瘀；病位當(dāng)以肝、脾二臟為主。臨床上以疏肝健脾活血為主要原則進(jìn)行治療，在疏肝的同時(shí)，更要注重對(duì)脾胃腸的調(diào)補(bǔ)，中氣得健，肝氣得疏，血瘀之證自除。軟肝散加味方以“肝腸同治”理論為基礎(chǔ)，方中以丹參、鱉甲、牡蠣為君藥，三藥合用活血祛瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之效尤佳；臣以補(bǔ)氣健脾之四君子湯，補(bǔ)氣健脾，調(diào)節(jié)腸道功能；四味臣藥合用體現(xiàn)出對(duì)調(diào)養(yǎng)脾胃及腸道功能的重視，防止疾病進(jìn)一步傳變，佐以山藥、白芍柔肝健脾，在協(xié)助君藥活血散結(jié)的同時(shí)，又可顧護(hù)脾胃及腸道的功能。

為明確基于“肝腸同治”理論的軟肝散加味方調(diào)控腸道菌群治療肝纖維化的作用機(jī)制，本課題組通過研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各給藥組肝組織病理改變有不同程度的改善，其中以高劑量組改善最為明顯，低劑量組改善較差。與模型組比較，軟肝散加味方給藥各組大鼠的門、綱、目、科、屬、種六類OTUs地位豐度明顯恢復(fù)；對(duì)腸道菌群的豐富度、多樣性指數(shù)明顯回調(diào)，且高、中劑量組改善明顯，說明療效上具有一定劑量相關(guān)性。從菌門與菌屬結(jié)構(gòu)分析，軟肝散加味方各給藥組可使擬桿菌門、厚壁菌門等7個(gè)菌門下調(diào)，變形菌門、放線菌門等4個(gè)菌門上調(diào)；使異普氏桿菌屬等5個(gè)菌屬下調(diào)，雙歧桿菌屬等9個(gè)菌屬上調(diào)，腸道菌群的豐富度、多樣性指數(shù)與腸道菌門、菌屬的分布結(jié)構(gòu)具有一定相關(guān)性。

綜上所述，基于“肝腸同治”理論的軟肝散加味方可通過調(diào)節(jié)腸道菌群有效改善模型大鼠纖維化病理程度，減少腸道內(nèi)毒素生成，抑制LPS/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo)，改善肝纖維化模型大鼠OTUs數(shù)量及α與β多樣性的失調(diào)，恢復(fù)菌群生物豐富度、多樣性指數(shù)與菌門、菌屬的分布結(jié)構(gòu)，達(dá)到防治肝纖維化的發(fā)生。今后本課題組還將進(jìn)一步研究軟肝散加味方調(diào)控腸道菌群治療肝纖維化的機(jī)制，為“肝腸同治”理論在肝纖維化中的應(yīng)用提供更多科學(xué)依據(jù)。