劉明江，王惠文，趙 昕，孫雯葉，呂 卉，李金貴*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有60%的人不同程度地處于亞健康狀態(tài)[1-2]。國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了大量亞健康狀態(tài)中醫(yī)辨識(shí)證候研究，其中脾胃虛弱是亞健康重要原因之一[1,3-4]。盛夏時(shí)，機(jī)體長時(shí)間處于密閉的冷空調(diào)環(huán)境或頻繁經(jīng)受冷、熱應(yīng)激，使機(jī)體容易表現(xiàn)出發(fā)熱惡寒、鼻塞流涕、局部肌肉疼痛及食欲不振、腹瀉等“空調(diào)病”癥狀[5]，但“空調(diào)環(huán)境”對(duì)機(jī)體抵抗力的影響及與常見疾病的相關(guān)性的研究較少。本研究通過對(duì)小鼠實(shí)施冷應(yīng)激、冷/熱交替應(yīng)激及在番瀉葉誘導(dǎo)小鼠脾虛的基礎(chǔ)上結(jié)合冷應(yīng)激、冷/熱交替應(yīng)激的方式，觀察小鼠腹瀉指數(shù)、生理生化指標(biāo)及免疫相關(guān)指標(biāo)變化，評(píng)價(jià)冷熱應(yīng)激對(duì)番瀉葉誘導(dǎo)脾虛小鼠臨床癥狀及免疫力的影響，以期為脾虛型“空調(diào)病”小鼠模型的制備，或“空調(diào)病”的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雄性ICR小鼠，5周齡，體重21±2 g，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[(生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2017-0007；使用許可證：SYXK(蘇)2017-0044)]。于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜節(jié)律12 h/12 h，自由采食飲水，室溫25±1℃，濕度30%～40%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)過程中所有操作都符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，無違反動(dòng)物福利行為。

1.1.2 主要試劑 番瀉葉，中國江蘇省揚(yáng)州市大德生藥店產(chǎn)品；白介素-6(interleukin-6,IL-6)(RK00008)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(RK00375)試劑盒，中國武漢愛博泰克生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醛(10010018)、切片石蠟(69019361)，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 切片機(jī)(RM2125RTS)、生物顯微鏡(DM2500)，德國Leica公司產(chǎn)品；血液生化檢測儀(AU480)、智能培養(yǎng)箱(ZGX-300C)，美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Epoch)，美國博騰儀器有限公司產(chǎn)品；獸用電子體溫計(jì)(康寧D-10)，中國臨海醫(yī)療儀表廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 將60 g番瀉葉用1 L開水浸泡5 min，文火煎煮5 min后用紗布過濾2次，置于4℃保存。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模

1.2.2.1 動(dòng)物分組 將36只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為6個(gè)組，即空白對(duì)照組(Control,Con)、番瀉葉組(Senna leaf group,S)、冷應(yīng)激組(Cold stress group,C)、番瀉葉+冷應(yīng)激組(Senna leaf+cold stress group,SC)、冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組(Cold stress+heat stress group,CH)和番瀉葉+冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組(Senna leaf+Cold stress+heat stress group,SCH)。每組6只小鼠。

1.2.2.2 造模 Con組和S組小鼠始終置于室溫(25±1℃)飼養(yǎng)。其余各組小鼠特定時(shí)間置于溫度培養(yǎng)箱內(nèi)，剩余時(shí)間內(nèi)置于室溫(25±1℃)飼養(yǎng)。C組和CS組：每天10:00～17:00，T:(20±2)℃。CH組和SCH組：每天10:00～10:30、14:00～14:30，T:(35±2)℃；10:30～14:00、14:30～17:00，T:(20±2)℃，持續(xù)6周。試驗(yàn)期小鼠禁食禁水，非試驗(yàn)期自由采食飲水；Con組、C組和CH組飲用無菌水，S組、SC組和SCH組自由飲用番瀉葉水煎液。參考國家中醫(yī)藥管理局制定的《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》，小鼠脾虛模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)為：主癥：精神沉郁、倦怠懶動(dòng)；次癥：食少納呆、畏寒扎堆、腹脹、便溏、體瘦毛焦或體毛脫落，具備主癥1項(xiàng)及次癥2項(xiàng)以上者[6]。

1.2.3 取材 采樣前，禁食12 h，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)，待小鼠麻醉后，眼球采血；脫頸處死小鼠，采集脾臟、結(jié)腸。血液收集置EDTA抗凝血管，用于血常規(guī)與生化檢測；脾臟、結(jié)腸置于40 g/L多聚甲醛水溶液中固定，用于制作病理切片。

1.2.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.2.4.1 體溫、體質(zhì)量及采食量 造模期間，每天早上8點(diǎn)測量小鼠肛溫；測量肛溫后稱重；每天10點(diǎn)稱取X g鼠糧，次日上午稱取剩余鼠糧Y g，每日進(jìn)食量(g)=X-Y。

1.2.4.2 腹瀉指數(shù) 腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便級(jí)。每天早晨觀察小鼠糞便情況，記錄糞便總顆粒數(shù)和稀便顆粒(稀便率=稀便粒數(shù)/糞便總顆粒數(shù)×100%)。根據(jù)稀便在濾紙上的的污染面積劃分稀便等級(jí)：1級(jí)污染直徑<1 cm，2級(jí)污染直徑1.0 cm～1.9 cm，3級(jí)污染直徑2 cm～3 cm，4級(jí)污染直徑>3 cm。

1.2.4.3 臟器指數(shù) 采集小鼠脾臟并稱重，脾指數(shù)(%)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.4.4 外周血中IL-6和IgG含量和部分血液生化指標(biāo)檢測 采集的血液樣品室溫靜置30 min后，3 000 r/min，離心10 min，取上清。血液生化檢測儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino transference,AST)；ELISA法檢測IL-6和IgG。

1.2.4.5 脾臟、結(jié)腸組織病變 蘇木精-伊紅染色法(H.E)：采集的脾和結(jié)腸組織在4%多聚甲醛水溶液中固定24 h后，制作石蠟切片(厚度為4 μm)，石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化，經(jīng)蘇木素染色4 min、自來水沖洗3 min、1%鹽酸酒精分化3 s、氨水返藍(lán)1 min、伊紅染色45 s、自來水沖洗2 min后，干燥、封片，于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察記錄和照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠腹瀉指數(shù)

造模第2天，與Con組比較，S組、SC組、SCH組小鼠出現(xiàn)明顯腹瀉；第14天，S組、SC組、SCH組小鼠精神不振，蜷臥扎堆，食欲降低，便溏，體毛雜亂，肛門粘有糞便，個(gè)別小鼠出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象，說明脾虛泄瀉模型復(fù)制成功[6，7]。試驗(yàn)期間，C組、CH組小鼠除被毛雜亂外，未見明顯臨床癥狀。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與Con組比較，S組小鼠腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)，SC組和SCH組極顯著升高(P<0.01)；C組、CH組小鼠腹瀉指數(shù)無顯著變化(圖1)。

a.空白對(duì)照組；b.番瀉葉組；c.冷應(yīng)激組；d.番瀉葉+冷應(yīng)激組；e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組；f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組。數(shù)據(jù)是6個(gè)平行樣本的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；** P<0.01； *** P<0.001。

2.2 各組小鼠體溫、體質(zhì)量和飲食量變化

與Con組比較，各處理組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，采食量、體溫均有降低趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與Con組比較，S組小鼠體質(zhì)量和體溫顯著下降(P<0.05)，SC組和SCH組小鼠體溫、采食量和體質(zhì)量均顯著降低(P<0.01)。具體見圖2。

A.體質(zhì)量；B.采食量；C.體溫；a.空白對(duì)照組；b.番瀉葉組；c.冷應(yīng)激組；d.番瀉葉+冷應(yīng)激組；e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組；f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組；數(shù)據(jù)是6個(gè)平行樣本的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。

2.3 各組小鼠血清中ALT和AST含量變化

與Con組比較，SCH組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶含量顯著升高(P<0.05)，其余組的2種酶含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

a.空白對(duì)照組；b.番瀉葉組；c.冷應(yīng)激組；d.番瀉葉+冷應(yīng)激組；e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組；f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組。數(shù)據(jù)是6個(gè)平行樣本的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與空白對(duì)照組比較，* P<0.05。

2.4 各組小鼠脾臟臟器指數(shù)和病理組織學(xué)變化

與Con組比較，SCH組小鼠脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05),其余組小鼠脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Con組比較，SCH組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)不整齊，界限模糊，淋巴小結(jié)細(xì)胞稀疏伴有炎性細(xì)胞浸潤；S組和SC組脾臟組織紅髓區(qū)大量紅細(xì)胞滲出；C組和CH組小鼠脾臟組織未見明顯異常。具體見圖4、圖5。

a.空白對(duì)照組，b.番瀉葉組，c.冷應(yīng)激組，d.番瀉葉+冷應(yīng)激組，e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組，f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組。數(shù)據(jù)是6個(gè)平行樣本的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。

a.空白對(duì)照組，b.番瀉葉組，c.冷應(yīng)激組，d.番瀉葉+冷應(yīng)激組，e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組，f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組；虛箭頭.紅細(xì)胞滲出；實(shí)箭頭.炎性細(xì)胞浸潤。

2.5 各組小鼠血清中IL-6和IgG含量變化

與空白組比較，SC組和SCH組小鼠血清中IL-6含量極顯著增多(P<0.01)；S組、C組、CH組小鼠血清中IL-6含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SCH組小鼠血清中IgG含量顯著降低(P<0.05)，其余組小鼠血清中IgG含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體見圖6。

a.空白對(duì)照組，b.番瀉葉組，c.冷應(yīng)激組，d.番瀉葉+冷應(yīng)激組，e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組，f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組。數(shù)據(jù)是6個(gè)平行樣本的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與空白對(duì)照組比較，* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。

2.6 小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)變化

與Con組比較，SCH組小鼠結(jié)腸黏膜層有炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下層充血明顯，杯狀細(xì)胞明顯增多；S組和SC組黏膜下層輕度充血；C組和CH組小鼠結(jié)腸黏膜未見明顯異常。具體見圖7。

a.空白對(duì)照組；b.番瀉葉組；c.冷應(yīng)激組；d.番瀉葉+冷應(yīng)激組；e.冷應(yīng)激+熱應(yīng)激組；f.番瀉葉+熱應(yīng)激+冷應(yīng)激組。虛箭頭.炎性細(xì)胞浸潤；實(shí)箭頭.杯狀細(xì)胞增多。

3 討論

應(yīng)激是機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境中各種異常刺激的非特異性反應(yīng)，冷、熱應(yīng)激均會(huì)引起機(jī)體各器官和免疫系統(tǒng)的功能異常或損傷，并誘發(fā)多種疾病[8，9]。番瀉葉常用于治療熱結(jié)積滯，便秘腹痛或水腫脹滿，是目前應(yīng)用最廣泛的導(dǎo)瀉劑，是復(fù)制脾虛泄瀉動(dòng)物模型的常用藥物[10，11]。

3.1 冷熱應(yīng)激加重脾虛小鼠臨床癥狀

經(jīng)相應(yīng)處理1周后，S組、SC組和SCH組小鼠出現(xiàn)喜聚堆、被毛稀疏臟亂、肛周糞便黏著的現(xiàn)象；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3組小鼠腹瀉指數(shù)顯著高于Con組(P<0.05)，其中SCH組腹瀉指數(shù)最高，肛周污染程度最為嚴(yán)重；而C組和CH組小鼠試驗(yàn)期間未出現(xiàn)腹瀉癥狀(圖1)。另外，S組、SC組和SCH組小鼠體溫、體質(zhì)量和采食量均顯著低于Con組(P<0.05)，而C組和CH組小鼠體溫、體質(zhì)量及采食量較Con組均無顯著差異(圖2)。SCH組小鼠的ALT、AST指標(biāo)顯著升高(P<0.05)(圖3)，說明小鼠的肝臟有一定的損傷；其他生化指標(biāo)未見異常(數(shù)據(jù)未顯示)。以上結(jié)果表明，脾虛狀態(tài)下的小鼠對(duì)外界環(huán)境變化的調(diào)節(jié)能力明顯下降。

3.2 冷熱應(yīng)激降低脾虛小鼠免疫力

IgG是血液中的主要抗體，約占外周血免疫球蛋白總量的75%，主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成，是評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫水平的常用指標(biāo)[12]。脾臟結(jié)構(gòu)或功能受損，會(huì)使機(jī)體長期處于免疫抑制狀態(tài)，使機(jī)體的易感性增加。IL-6是一種促進(jìn)炎癥和免疫調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，是調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞分化和B淋巴細(xì)胞向分泌型漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要因子，對(duì)高親和性IgG的合成、分泌具有重要的調(diào)控作用[13]。本試驗(yàn)中，SCH組小鼠的脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)(圖4)、組織結(jié)構(gòu)不清晰且有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖5)；血清中IL-6含量極顯著升高(P<0.001)，IgG含量顯著降低(P<0.05)(圖6)，表明該組小鼠的免疫功能受到影響。另外，S組和SC組小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)無明顯變化；SC組小鼠IL-6含量極顯著升高(P<0.01)，IgG含量差異不顯著，而CH組IL-6、IgG含量與Con組比較均未見顯著變化，說明番瀉葉復(fù)合冷、熱交替應(yīng)激的造模方法對(duì)小鼠機(jī)體免疫力的影響更加明顯，而相同時(shí)間內(nèi)的冷、熱應(yīng)激對(duì)正常機(jī)體的免疫力影響不大。

3.3 冷熱應(yīng)激加重脾虛小鼠結(jié)腸損傷

研究表明，長時(shí)間口服番瀉葉可誘發(fā)脾虛證，導(dǎo)致腸道菌群紊亂及腸酶活性的改變[14]。腸道微生物群可為機(jī)體提供或幫助機(jī)體合成營養(yǎng)物質(zhì)及能量，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持；腸道菌群的紊亂將降低機(jī)體的免疫力并導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，尤其是消化系統(tǒng)疾病[15,16]。杯狀細(xì)胞是腸道上皮細(xì)胞中的一種分泌型細(xì)胞，其分泌的黏液可有效維持腸道上皮細(xì)胞的完整性和功能，并在抵抗腸道細(xì)菌侵襲的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究表明，在腸道疾病發(fā)生時(shí)，均伴隨著杯狀細(xì)胞的增多及分泌產(chǎn)物的增加；另外，當(dāng)腸道黏膜屏障受損時(shí)，一部分杯狀細(xì)胞可作為第二道防線阻止已成功進(jìn)入黏液層的細(xì)菌侵入，而作為代價(jià)的是杯狀細(xì)胞的不斷消耗[17,18]。如圖7所示，連續(xù)口服番瀉葉引起結(jié)腸組織黏膜下層充血、水腫及炎性細(xì)胞的浸潤，其中SCH組病變最為嚴(yán)重，且腸黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞顯著增多，而C組、CH組結(jié)腸組織未見明顯變化。以上結(jié)果表明，在連續(xù)口服番瀉葉基礎(chǔ)上，冷、熱應(yīng)激更易對(duì)小鼠的腸道組織造成損害，但其作用機(jī)制(腸道菌群、黏膜屏障)有待進(jìn)一步研究。

本研究得出，連續(xù)6周冷應(yīng)激或冷、熱應(yīng)激對(duì)正常小鼠機(jī)體狀態(tài)無顯著影響；而在番瀉葉誘導(dǎo)的“脾虛”基礎(chǔ)上，該刺激可明顯加重脾虛小鼠的臨床癥狀、結(jié)腸黏膜損傷程度，并顯著降低小鼠機(jī)體免疫力，說明動(dòng)物機(jī)體在抵抗力較差時(shí)更易受到外界環(huán)境的影響。