楊志遠(yuǎn)，王存才，馬丹陽，王金泉，趙紅瓊，郝智慧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京海淀 100193)

寄生蟲病是當(dāng)前寵物疾病中最主要的一類疾病，現(xiàn)有大量的藥物應(yīng)用于寵物寄生蟲病的臨床治療[1]。主要驅(qū)蟲藥物有伊維菌素類、阿維菌素類、左旋咪唑、吡喹酮、莫西克汀[2-5]等，莫西克汀作為新興抗寄生蟲，具有廣譜、高效、低毒、對環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)[6]，目前我國已批準(zhǔn)了莫西克汀澆潑劑在奶牛方面的應(yīng)用[7]，還尚未有在寵物上作為澆潑劑應(yīng)用的研究。

市面上的驅(qū)蟲藥劑型有很多種，例如片劑、注射劑和滴劑等，但目前并沒有寵物方面的澆潑劑型，本試驗(yàn)根據(jù)寵物用藥的安全性高、透皮吸收迅速、對寵物皮毛無影響等要求，對莫西克汀澆潑劑進(jìn)行探究。通過對不同助劑篩選；通過高效液相色譜法測定莫西克汀的含量；通過進(jìn)行大鼠離體皮膚透皮吸收試驗(yàn)，并按照藥品穩(wěn)定性指導(dǎo)原則進(jìn)行初步穩(wěn)定性考察。為開發(fā)針對犬用高效、安全的澆潑劑產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性SD大鼠，質(zhì)量為(160±20)g，來源于斯貝福生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 莫西克汀(moxidectin)原料(>99%)，安徽新宇藥業(yè)公司惠贈；中鏈甘油三酸酯、棉籽油、石蠟油、大豆油，特丁基對苯二酚(tert-butyl hydroquinone，TBHQ)、叔丁基羥基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、肉豆蔻酸異丙酯、聚異丁烯(分子量1300)、聚異丁烯(分子量2400)，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；二乙二醇單乙醚，嘉法獅上海貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；氮酮、二甲基亞砜、合成蜂蠟、色譜級乙腈、色譜級甲醇、無水乙醇，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；油溶紫、靛藍(lán)胭脂紅、檸檬黃，均為遼寧庫克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 高效液相色譜儀(安捷倫1260)，美國安捷倫公司產(chǎn)品；磁力攪拌器(WH220-HT)，WIGGENS THE MAGIC MOTION公司產(chǎn)品；智能透皮擴(kuò)散儀(TP-6)，天津市精拓儀器科技有限公司產(chǎn)品；十萬分之一電子天平(BT 125D)，sartorius公司產(chǎn)品；千分之一天平(ME203)，METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)(NDJ-8S)，上海平軒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；綜合藥品穩(wěn)定試驗(yàn)箱(型號LHH-250GSP)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 溶劑的篩選 通過性狀、溶解性、安全性和穩(wěn)定性對溶劑進(jìn)行綜合篩選，測定溶劑對莫西克汀的溶解度，確定最終的溶劑。稱取等量且過量的莫西克汀分別加入到含10 mL中鏈甘油三酸酯、棉籽油、液體石蠟、大豆油的燒杯中，在300 r/min、25℃條件下溶解24 h后，通過HPLC檢測，得到莫西克汀在不同溶劑中的飽和溶解度[8]。

1.2.2 抗氧化劑的選擇 分別稱取等量的莫西克汀和3種不同抗氧化劑溶解到10 mL棉籽油中，在相同條件下攪拌至完全溶解。在第0、5、10天檢測溶液中莫西克汀的含量變化，篩選出最適抗氧化劑。參考賈善考[9]在艾普利諾菌素澆潑劑中抗氧化劑用量。分別將20 mg、30 mg和50 mg的抗氧化劑加入到澆潑劑中，并在第0、5、10天用HPLC檢測莫西克汀的含量變化，確定抗氧化劑的最佳劑量。

1.2.3 黏合劑的篩選 澆潑劑需要對動物的皮膚具有一定黏附作用，根據(jù)黏合劑的溶解性、穩(wěn)定性、黏附性等確定最終的黏合劑。分別使用不同分子質(zhì)量的聚異丁烯(1300、2400)、合成蜂蠟、空白棉籽油進(jìn)行澆潑劑制劑，最終選擇最適的黏合劑。

1.2.4 指示劑的篩選 通過著色能力、耐熱性能和脂溶性、穩(wěn)定性對指示劑進(jìn)行篩選。

1.2.5 正交設(shè)計(jì)工藝優(yōu)化 選用L9(34)正交試驗(yàn)法確定處方的最佳工藝。每個(gè)因素3個(gè)水平，工藝溫度為(A)、攪拌速度為(B)、溶劑使用量為(C)3個(gè)因素(因素水平見表1)。以含量變化和粘度為考察指標(biāo)進(jìn)行評分[10]。最終得到的最佳處方工藝。

1.2.6 檢測條件 色譜柱：島津InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm)；柱溫：35℃：進(jìn)樣量10 μL；檢測波長：242 nm；流動相：C為乙腈，D為乙酸銨，用乙酸調(diào)pH至4.2；總時(shí)長20 min；流速：2 mL/min(參照農(nóng)業(yè)部公告2168號公告)。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取500 mg莫西克汀到100 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得5000 μg/mL濃度的母液。吸取適量的母液配制成5、25、50、100、150、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用HPLC檢測。

1.2.8 透皮吸收試驗(yàn) 采用簡單擴(kuò)散小室法進(jìn)行透皮吸收試驗(yàn)。選擇肉豆蔻酸異丙酯為促透劑[11]，分別制備含5%(批次1)、8%(批次2)、15%(批次3)、30%(批次4)肉豆蔻酸異丙酯的Moxidectin澆潑劑，檢測不同批次制劑的透皮滲透性。準(zhǔn)確吸取1 mL澆潑劑放入供給池，以10 mL的乙醇：生理鹽水(4∶6)作為接收液放入接收池。分別在2、4、6、8、10、12、24 h從接收池取樣2 mL，取樣后立即補(bǔ)充等量接收液，將樣品放于-20℃中保存，直到進(jìn)行HPLC檢測。用 HPLC 法測定Moxidectin澆潑劑的累積滲透量，并繪制24 h累計(jì)滲透量的滲透曲線，選擇出最適的透皮吸收劑用量。滲透量公式如(1)所示：

(1)式中，Qn.t時(shí)間內(nèi)藥物的單位面積累積透過量(μg/cm2)；A.滲透面積(2.80 cm2)；Cn.t時(shí)間濃度測量值；Ci.t時(shí)間以前濃度測量值；V.接受液總體積(6.5 mL)；Vo.每次取樣體積(22.0 mL)。

1.2.9 穩(wěn)定性考察 取自制本品4批，在(40±2)℃，相對濕度(75±5)%的條件下放置6個(gè)月，分別于0、1、2、3和6個(gè)月取樣，按中國獸藥典規(guī)定的加速試驗(yàn)考察項(xiàng)目檢測[12]。

1.2.10 數(shù)據(jù)的處理與分析 使用GraphPad Prism 8.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組差異性。正交試驗(yàn)助手V3.1對正交結(jié)果進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 助劑的確定

2.1.1 溶劑的確定 結(jié)果如圖1所示，莫西克汀在不同溶劑中溶解度大小為中鏈甘油三酸酯>棉籽油>大豆油>液體石蠟。因?yàn)橹墟湼视腿狨ヅc染料油溶紫互不相溶，棉籽油比大豆油和液體石蠟溶解度更大，因此選擇溶解度較高的棉籽油作為溶劑。

圖1 莫西克汀在不同溶劑中的溶解度

2.1.2 抗氧化劑及劑量的確定 結(jié)果見圖2，A為抗氧化劑的選擇，B為抗氧化劑用量對比。圖A顯示在第0天時(shí)，空白組與試驗(yàn)組之間無顯著性差異(P<0.05)；在第5天和第10天時(shí)，空白組與試驗(yàn)組出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.001)。且在第10天時(shí)，特丁基對苯二酚與叔丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，表明特丁基對苯二酚比其他抗氧化劑抗氧化性更強(qiáng)。

圖2 抗氧化劑及其劑量篩選

圖B顯示在第0天時(shí)，空白組與各試驗(yàn)組之間無顯著性差異；而在第5天和第10天時(shí)，出現(xiàn)了極顯著性差異(P<0.001)。在第5天與第10天時(shí)，3 mg/mL組和5 mg/mL組與2 mg/mL組之間均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，而3 mg/mL與5 mg/mL組之間無顯著性差異(P<0.05)，因此選擇3 mg/mL作為抗氧化劑的使用量。

2.1.3 黏合劑的確定 圖3顯示了3種黏合劑的不同黏度：聚異丁烯(1300)>聚異丁烯(2400)>合成蜂蠟>空白組。其中聚異丁烯與合成蜂蠟黏度差異較大，聚異丁烯(1300)比聚異丁烯(2400)更穩(wěn)定，因此選擇了聚異丁烯(1300)作為黏合劑。

圖3 不同黏合劑的粘度對比

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2中的R值可知，澆潑劑工藝影響因素大小依次為聚異丁烯用量>工藝溫度>攪拌速度。表3結(jié)果顯示，聚異丁烯(1300)的使用量對于澆潑劑的影響有顯著性影響，攪拌速度對澆潑劑影響不明顯。因此，澆潑劑的最佳工藝為聚異丁烯10%、溫度30℃、攪拌速度400 r/min。

表1 正交篩選工藝優(yōu)化

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.3 莫西克汀含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4為莫西克汀含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為y=12.407x+26.027 (R2=0.999 4)，說明莫西克汀在5 μg/mL～200 μg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖4 莫西克汀含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 透皮吸收劑的確定

圖5表明，不同比例的肉豆蔻酸異丙酯對莫西克汀體外經(jīng)皮透過性具有不同的效果。其中批次4與批次3釋放速率過快，批次1釋放速率較慢，批次2釋放速率適中且滲透性良好，因此，8 %肉豆蔻酸異丙酯為最佳用量。

圖5 澆潑劑滲透曲線圖

2.5 穩(wěn)定性考察

表4為加速試驗(yàn)結(jié)果，不同批次的樣品經(jīng)加速試驗(yàn)(6個(gè)月)后，其外觀與表征等均無明顯變化，莫西克汀的含量變化均在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定范圍內(nèi)，表明本制劑穩(wěn)定性良好。

表4 加速試驗(yàn)

3 討論

莫西克汀作為一種新的抗寄生蟲藥，具有低毒、高效等優(yōu)點(diǎn)，尚未發(fā)現(xiàn)其耐藥性方面的報(bào)道[13]。與固體制劑相比，莫西克汀液體制劑擁有更高的生物利用度[14]。本試驗(yàn)的主要目的是制備一種寵物專用的莫西克汀澆潑劑，對莫西克汀的制劑進(jìn)行創(chuàng)新，以解決寵物澆潑劑的制備問題。如何選擇莫西克汀澆潑劑的輔料，是本試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。由于莫西克汀是高脂溶性(logP為5.3～5.67)低水溶性(0.005 2 mg/kg)藥物，根據(jù)相似相溶原理，選擇對皮膚無刺激且具有一定增黏作用的棉籽油作為溶劑[15]。此外，棉籽油本身含有高濃度的維生素E和脂肪酸，可進(jìn)一步增加藥物的通透性和抗氧化能力[16]。

因?yàn)樵囼?yàn)中的使用的抗氧化劑特丁基對苯二酚(TBHQ)具有一定的耐高溫與抗菌作用，并且有文獻(xiàn)證明其在植物油中添加0.01%～0.03%的量，其效果比叔丁基羥基茴香醚(BHA)和二丁基羥基甲苯(BHT)效果更優(yōu)[17]，抗氧化能力更強(qiáng)，所以選擇效果更好的抗氧化劑特丁基對苯二酚。試驗(yàn)中的聚異丁烯不但具有粘附作用，而且對藥物有一定的緩釋作用[18]，故現(xiàn)擇其作為澆潑劑的黏合劑。肉豆蔻酸異丙酯作為親脂性滲透促進(jìn)劑[19]，它的安全性和有效性[20]可促進(jìn)多種皮膚滲透或多種皮膚滲透活性化合物[21]；最終通過大鼠透皮試驗(yàn)證明了其具有良好的透皮吸收性。油溶紫作為著色劑其不溶于水，著色能力強(qiáng)，耐熱性能較好；油溶紫在一定濃度的酸堿中可實(shí)現(xiàn)可逆變色，經(jīng)處理過的油溶紫在一定溫度下可實(shí)現(xiàn)可逆變色。與普通結(jié)晶紫內(nèi)酯相比,具有優(yōu)良的油溶性，因其具有一定指示性，同時(shí)也不會影響寵物的毛色，故選擇其作為著色劑[22]。

本試驗(yàn)制備成功篩選出澆潑劑所需的各種輔料，并完成了莫西克汀澆潑劑的制備，加速試驗(yàn)證明其制劑穩(wěn)定，完成了寵物澆潑劑工藝的初步探究。為未來從事澆潑劑研究的工作者們提供試驗(yàn)與理論根據(jù)，為莫西克汀澆潑劑在寵物方向的制備應(yīng)用開辟了新的前景。