王志輝，王金強(qiáng)，王 智，童巧珍，劉湘丹,3，周日寶,3，桂 玨

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室，湖南 長沙 410208；3.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

鎘是生物體的一種非必需的微量元素，因其生物毒性大又極易被植物吸收而成為環(huán)境污染中最危險(xiǎn)的五種物質(zhì)之一[1]。我國鎘污染超標(biāo)率高達(dá)7.0%。鎘是我國土壤污染中占重大比例的無機(jī)污染中最為嚴(yán)重的元素[2]，且鎘污染治理難度大。大量研究表明，鎘脅迫對植物種子的發(fā)芽率及生長發(fā)育存在明顯的影響，如影響植物體的光合作用[3-4]，影響植物對礦質(zhì)元素的吸收、分配，以及破壞植物葉片細(xì)胞膜、抑制細(xì)胞壁伸長[5-12]等。目前關(guān)于鎘脅迫對植物的影響大多集中蔬菜、水稻等糧食作物上，近年來有學(xué)者對全國中藥材中鎘超標(biāo)情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)鎘超標(biāo)普遍存在，超標(biāo)率達(dá)2.91%[11]。

決明又名草決明，豆科決明屬植物，以種子入藥，是一種藥食兩用的中藥。目前已知決明子藥效成分主要為大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、大黃酸等蒽醌類化合物[13-14]，有降血脂和抗動脈粥樣硬化、抑菌、保肝、護(hù)腎等作用。筆者在前期研究發(fā)現(xiàn)決明在鎘污染土壤中種植表現(xiàn)為鎘低積累類型，決明子在不同程度污染的土壤中鎘含量均未超標(biāo)[15]。為證明鎘污染地區(qū)決明種植的安全性和可適性，筆者通過測定不同鎘溶液濃度梯度下決明種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)、根長、芽長和苗高等指標(biāo)，考察決明種子對重金屬鎘的耐受性，并探究鎘脅迫對決明種子發(fā)芽的影響，為進(jìn)一步研究決明耐鎘機(jī)制和鎘污染地區(qū)決明的種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 GZX400型光照培養(yǎng)箱（泰斯特儀器有限公司）；UV1901PCS紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；氯化鎘，丙酮等均為分析純，培養(yǎng)皿，游標(biāo)卡尺，蒸餾水（自制）。

1.2 供試種子 3種決明種子分別來于河北安國市天澤農(nóng)業(yè)科技有限公司（A組）、天津市金科力峰種苗有限公司（B組）、廣西南至北綠化種業(yè)（C組）。

1.3 鎘溶液配置 重金屬Cd2+以溶液的形式加入，以CdCl2·2.5H2O配成4個(gè)濃度：2、5、10、15 mg/L（以鎘離子含量計(jì)）。

1.4 鎘脅迫決明種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 取飽滿的決明種子經(jīng)蒸餾水浸種24 h，選取大小基本一致的決明種子置于墊有棉花的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置20粒種子，標(biāo)識Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，其中Ⅱ～Ⅴ分別加入20 mL的鎘溶液2、5、10、15 mg/L，Ⅰ中加入20 mL的蒸餾水以作對照。然后將培養(yǎng)皿放入25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后測發(fā)芽勢，7 d后測發(fā)芽率（芽突破種皮1 cm算發(fā)芽）。每個(gè)處理重復(fù)3次。用40 ℃的溫水浸泡決明種子24 h，然后用次氯酸鈉消毒5 min，用自來水清洗種子數(shù)次，再用去離子水沖洗3次，備用。將消毒好的決明種子放于吸水紙上吸掉種子外部多余的水分,放于培養(yǎng)皿中,每皿種子30粒。分別稱量每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量并記錄，然后放入人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照12 h，黑暗12 h）。之后每天澆蒸餾水至恒重保持培養(yǎng)皿濕潤，每天09:00:00時(shí)觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)，以將種子放入人工培養(yǎng)箱為實(shí)驗(yàn)的第1天，以連續(xù)3 d種子發(fā)芽數(shù)不再增長作為實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诮Y(jié)束實(shí)驗(yàn)，結(jié)束當(dāng)天在每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選擇10個(gè)幼苗，用游標(biāo)卡尺測量根長（最長根）、苗長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，并統(tǒng)計(jì)計(jì)算各數(shù)據(jù)。

1.5 測定萌發(fā)指標(biāo) 當(dāng)種子萌動后，逐日記錄種子的發(fā)芽情況，并用下列公式計(jì)算種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。發(fā)芽勢=3 d正常萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%（式1）；發(fā)芽率=7 d正常萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%（式2）；發(fā)芽指數(shù)=ΣGt/Dt（Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為對應(yīng)的天數(shù)）（式3）；活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×苗高（苗高=平均芽長+平均根長）（式4）；抑制指數(shù)（%）=[（對照組-實(shí)驗(yàn)組）/對照組]×100%（式5）。

1.6 綜合評價(jià)方法 采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法分析評價(jià)3個(gè)決明品種種子的耐鎘性，參照陳露等（2019）的方法計(jì)算3個(gè)決明品種種子各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值X(μ)和綜合隸屬函數(shù)值∑X（μ）。X（μ）=（xi-xmin）/（xmax-xmin）（i=1，2，3·n）式中，xi表示第i個(gè)綜合指標(biāo)，xmin表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的最小值，xmax表示第i個(gè)綜合指標(biāo)的最大值。綜合隸屬函數(shù)值越大，耐性越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel、SPSS 23.0軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對3種決明種子在不同濃度的鎘溶液下的各項(xiàng)指標(biāo)使用Dunnett多重比較和方差齊性檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鎘脅迫濃度下決明種子萌發(fā)各指標(biāo)差異分析 A組決明種子經(jīng)2、5mg/L鎘溶液處理，其活力指數(shù)明顯降低（P＜0.05），而其他萌發(fā)指標(biāo)與對照比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明低濃度鎘脅迫對A組決明種子的萌發(fā)影響較小。A組決明種子經(jīng)10、15 mg/L鎘溶液處理，其活力指數(shù)和發(fā)芽勢明顯降低（P＜0.05），表明鎘濃度＞10 mg/L時(shí)對A組決明種子的萌發(fā)有抑制作用，且濃度越大，抑制作用越明顯。（見表1）

表1 A 組決明種子在鎘脅迫下的種子萌發(fā)指標(biāo)（）

表1 A 組決明種子在鎘脅迫下的種子萌發(fā)指標(biāo)（）

B組決明種子經(jīng)2 mg/L鎘溶液處理，其活力指數(shù)明顯升高（P＜0.05），表明鎘濃度＜2 mg/L時(shí)，對B組決明種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。B組決明種子經(jīng)5 mg/L鎘溶液處理，其活力指數(shù)雖有所降低，但仍高于對照，且發(fā)芽率明顯高于對照（P＜0.05），說明鎘濃度達(dá)到5 mg/L時(shí)，仍可提高B組決明種子的發(fā)芽率。B組決明種子經(jīng)10 mg/L鎘溶液處理，各指標(biāo)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明B組種子最大耐鎘濃度≥10 mg/L。B組決明種子經(jīng)15 mg/L鎘溶液處理，其各萌發(fā)指標(biāo)均明顯降低（P＜0.05），表明鎘濃度為15 mg/L時(shí)，對B組決明種子萌發(fā)有抑制作用。（見表2）

表2 B 組決明種子鎘脅迫下的種子萌發(fā)指標(biāo)（）

表2 B 組決明種子鎘脅迫下的種子萌發(fā)指標(biāo)（）

鎘濃度≥2 mg/L時(shí)，C組決明種子各萌發(fā)指標(biāo)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明低濃度鎘脅迫即可影響C組決明種子萌發(fā)。（見表3）

表3 C 組決明種子鎘脅迫下的種子萌發(fā)指標(biāo)（）

表3 C 組決明種子鎘脅迫下的種子萌發(fā)指標(biāo)（）

由此可知，不同產(chǎn)地的決明種子耐鎘能力存在差異，A、B組決明種子有較強(qiáng)的耐鎘性，C組決明種子對鎘脅迫敏感。

對3組決明種子在同一鎘濃度下各萌發(fā)指標(biāo)進(jìn)行差異性分析可知，在對照條件下，B組決明種子的發(fā)芽指數(shù)與A、C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而其他萌發(fā)指標(biāo)差異均不明顯，說明在無鎘脅迫下，A、C組決明種子的活力優(yōu)于B組。當(dāng)鎘濃度為2 mg/L時(shí)，C組決明種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽勢和發(fā)芽率與A、B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而A組與B組決明種子的各萌發(fā)指標(biāo)差異均不明顯。當(dāng)鎘濃度為5 mg/L時(shí)，C組決明種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽勢和發(fā)芽率與A、B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而A組決明種子僅活力指數(shù)與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明低濃度鎘脅迫對C組種子影響更大。當(dāng)鎘濃度＞10 mg/L時(shí)，3組決明種子間各萌發(fā)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明鎘濃度超過10 mg/L時(shí)，對3組決明種子萌發(fā)的抑制程度是一致的。由此可知，3組決明種子耐鎘能力存在差異，C組種子最高耐鎘濃度不超過2 mg/L，A、B組決明種子最高耐鎘濃度不超過10 mg/L。（見表4）

表4 不同品種發(fā)芽指標(biāo)差異性分析

2.2 鎘脅迫對決明種子根長、芽長和苗高的影響 在不同鎘溶液處理下，A、C組決明種子的根長呈下降的趨勢，而B組的根長呈先上升后下降的趨勢。A組決明種子在鎘濃度為10 mg/L時(shí)，根長明顯短于對照（P＜0.05），根長抑制指數(shù)為54.46%；在鎘濃度為15 mg/L時(shí)，根長抑制指數(shù)為71.79，說明鎘濃度＞10 mg/L時(shí)，對A組決明種子的根長有明顯的抑制作用。B組決明種子在鎘濃度為2 mg/L時(shí)，根長明顯長于對照，根長抑制指數(shù)為-38.75%，說明2 mg/L的鎘溶液對B組種子的根長有促進(jìn)作用，在鎘濃度為5、15 mg/L時(shí)，根長明顯短于對照（P＜0.05），說明鎘濃度＞5 mg/L時(shí)，對B組決明種子的根長有抑制作用。C組決明種子在鎘濃度5、10、15 mg/L時(shí)，其根長均短于對照（P＜0.05），并且在鎘濃度為10 mg/L時(shí)根長降幅最大，根長抑制指數(shù)為51.10%，說明鎘濃度＞5 mg/L時(shí)，對C組種子的根長有明顯抑制作用。C組決明種子在鎘濃度為15 mg/L時(shí)，其芽長明顯短于對照（P＜0.05），其他各組芽長在不同鎘溶液處理下與對照比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可知，鎘脅迫主要抑制決明種子胚根的生長，對胚芽的影響較小。（見表5）

表5 鎘脅迫下決明種子根長、芽長、苗高及抑制指數(shù)

此外，在實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，在鎘濃度為5 mg/L時(shí)，3組決明中有部分植株根系出現(xiàn)了較淺的褐變；在鎘濃度為10、15 mg/L時(shí)，3組決明的根系均出現(xiàn)較深褐變，甚至有部分根系腐爛、壞死，而對照組未出現(xiàn)褐變腐爛現(xiàn)象，說明鎘脅迫對決明根系有不同程度的損傷。（見圖1）

圖1 決明種子根部腐爛情況

2.3 不同品種耐鎘性比較 利用種子萌發(fā)過程中發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的隸屬函數(shù)值和綜合隸屬函數(shù)值可綜合分析3種決明種子在萌發(fā)期的耐鎘性。由表6可知，B組種子耐鎘性最強(qiáng)，A組次之，C組最弱。

表6 鎘脅迫下決明種子萌發(fā)各指標(biāo)隸屬函數(shù)值

3 討論

通過對3個(gè)品種決明種子的種子萌發(fā)耐鎘性的研究發(fā)現(xiàn)，鎘濃度低于5 mg/L時(shí)，A組決明種子各項(xiàng)指標(biāo)變化較小，B組決明種子各項(xiàng)指標(biāo)均有升高；而在鎘濃度高于2 mg/L時(shí)C組決明種子萌發(fā)就會受到較大的抑制作用。結(jié)合綜合隸屬函數(shù)值可知，3種決明種子的耐鎘能力為B＞A＞C。綜上可見，A、B組決明種子都具有較強(qiáng)的耐鎘性，適合在中、輕度鎘污染地區(qū)種植，C組決明種子不適合在鎘污染地區(qū)種植。

不同鎘濃度脅迫下，A、B組決明種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)的大致趨勢都是先上升后下降，這與劉笑蓉等[16]認(rèn)為低重金屬濃度對植物有積極的“刺激作用”，但這種刺激受到濃度限制的說法一致。僅C組決明種子的發(fā)芽勢在鎘濃度為2 mg/L時(shí)就呈現(xiàn)出下降趨勢，且與對照組有明顯差異，說明C組決明種子對鎘脅迫更敏感。

鎘脅迫主要抑制決明種子胚根的生長，對胚芽的影響較小，不同鎘濃度對不同品種決明根長的影響存在差異，B組表現(xiàn)出來是低鎘濃度對決明有積極的“刺激作用”，但在超過一定濃度范圍后，則受到抑制作用，這符合上述的結(jié)論。A、C組表現(xiàn)出隨著鎘濃度的升高而出現(xiàn)下降的趨勢，該結(jié)果與鄭本川等[17]在甘藍(lán)型油菜種子中，低濃度鎘處理狀態(tài)下，隨著鎘濃度的增大，幼苗的根長和苗長的抑制率均呈上升趨勢的研究結(jié)果一致。這種現(xiàn)象的原因還尚不清楚，可能與品種之間的耐鎘性有一定差異有關(guān)。

3組決明根系發(fā)生褐變甚至腐爛壞死現(xiàn)象的具體原因需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討，造成這種現(xiàn)象的可能原因是在較高鎘濃度下（5 mg/L以上），決明植株內(nèi)部的蛋白質(zhì)合成受到了抑制，植物的保護(hù)酶受到破壞，打破了細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡，導(dǎo)致植物根部表現(xiàn)出毒害癥狀或死亡[18-20]。