周海銀，羅 蘭，陳艷瑛，劉萍萍，肖政輝，方思思

（湖南省兒童醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

膿毒癥是一種危及生命的綜合征，其病理過程涉及細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)及線粒體功能改變等，最終導(dǎo)致機(jī)體多器官的功能障礙，包括肝損傷[1]。內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種特有成分，位于細(xì)胞壁的最外層，常用來刺激肝細(xì)胞建立體外肝損傷炎癥模型[2-3]。研究表明，由細(xì)菌LPS引起的膿毒癥會導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[4]，同時此過程中細(xì)胞線粒體損傷是膿毒癥介導(dǎo)急性肝損傷的主要機(jī)制之一。羅漢果是藥食同源的植物，其主要成分羅漢果皂苷具有降血糖、降血脂、抗糖尿病、抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激和清除自由基等功效[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷能夠在LPS誘導(dǎo)的小鼠肺呼吸道損傷模型中發(fā)揮保護(hù)作用[7]；另外也有研究報道，羅漢果皂苷能夠促進(jìn)小鼠肝脂肪代謝發(fā)揮抗氧化作用[8]。前期體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷Ⅵ（mogroside Ⅵ，MⅥ）可以降低肝臟氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)肝臟細(xì)胞線粒體生物合成，從而改善小鼠膿毒癥所致的急性肝損傷[9]，但并未在細(xì)胞水平對其作用機(jī)制做出更進(jìn)一步探討。因此，本研究進(jìn)一步探討MⅥ對體外肝細(xì)胞急性損傷的影響及分子機(jī)制，全面完善MⅥ改善膿毒癥致急性肝損傷的分子機(jī)制，旨在為MⅥ的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株 人肝細(xì)胞系L02購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物和試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基（批號：11965092）、胎牛血清（批號：26010066）、青鏈霉素（批號：15140163）、0.25%胰酶（批號：25200072）均購自美國Thermo Fisher Science公司；LPS（批號：HY-D1056）、過氧化物酶增殖激活受體γ輔助激活物1α（PGC-1α）抑制劑SR-18292（批號：HY-101491）均購自美國Med Chem Express公司；羅漢果皂苷Ⅵ（純度≥98%，批號：20200404）購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（批號：C009-2-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（批號：C010-1-1）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：A003-1-2）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：A001-1-21）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號：A005-1-1）均購于南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液（批號：P0013B）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：P0010S1）、MTT試劑（批號：C0009S）、Mito-Tracker Green試劑盒（批號：C1048）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（批號：KGA101）購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RNA提取試劑盒（批號：9767）、實(shí)時熒光定量PCR試劑盒（批號：RR037Q）均購自日本TaKaRa公司；PGC-1α抗體（批號：ab191838）、核呼吸因子1（NRF-1）抗體（批號：ab55744）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）抗體（批號：ab176558）及GAPDH抗體（批號：ab181602）均購于美國Abcam公司；線粒體DNA（mtDNA）提取試劑盒（批號：151023）購自德國QIAGEN公司。

1.3 主要儀器 iMark酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；iBright凝膠成像儀（美國Thermo Fisher Science公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）；DM4B熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) L02細(xì)胞使用含有10%胎牛血清和青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2.2 MⅥ對L02細(xì)胞增殖活力的影響 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，調(diào)整其濃度至6×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，接種12 h后，待細(xì)胞完全貼壁，去掉原培養(yǎng)基，分別加入100 μL含有7.5、15、30、60、120 μmol/L MⅥ的培養(yǎng)基，同時設(shè)置空白對照孔，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用MTT試劑按照說明書操作，在490 nm波長處檢測吸光度值（OD），并計算細(xì)胞增殖活性，確定MⅥ最佳干預(yù)濃度。

2.3 LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化損傷模型的建立 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，調(diào)整其濃度至6×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，接種12 h后，待細(xì)胞完全貼壁，去掉原培養(yǎng)基，分別加入含有10、20、40、80、160 μg/mL LPS的培養(yǎng)基，同時設(shè)置空白對照孔，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)MTT試劑盒說明書操作檢測各組細(xì)胞在490 nm波長處的吸光度值（OD），并計算細(xì)胞增殖活性，確定LPS的最佳濃度。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 確定MⅥ和LPS最佳干預(yù)濃度后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞分為以下6組。（1）對照組：L02細(xì)胞不做任何處理；（2）LPS損傷組（LPS組）：采用40 μg/mL LPS處理L02細(xì)胞24 h；（3）低劑量MⅥ干預(yù)組（MⅥ-L）：采用40 μg/mL LPS+7.5 μmol/L MⅥ處理L02細(xì)胞24 h；（4）中劑量MⅥ干預(yù)組（MⅥ-M）：采用40 μg/mL LPS+15 μmol/L MⅥ處理L02細(xì)胞24 h；（5）高劑量MⅥ干預(yù)組（MⅥ-H）：采用40 μg/mL LPS+30 μmol/L MⅥ處理L02細(xì)胞24 h；（6）高劑量MⅥ+SR-18292干預(yù)組（MⅥ-H+SR-18292）：采用40 μg/mL LPS+30 μmol/L MⅥ+4 mmol/L SR-18292處理L02細(xì)胞24 h。

2.5 MTT檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞，調(diào)整其濃度至6×104個/mL，每孔100 μL接種于96孔板，接種12 h后，待細(xì)胞完全貼壁，去掉原培養(yǎng)基，按照“2.4”分組處理。提前4 h向每孔中加入20 μL MTT溶液，避光孵育4 h，去掉培養(yǎng)液，每孔中加入150 μL DMSO，置于搖床上低速震蕩10 min，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度值（OD），計算細(xì)胞增殖活性。

2.6 比色法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT和AST水平 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀測定505 nm波長處各組吸光度值（OD），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)上清中ALT和AST水平。

2.7 比色法檢測細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性及MDA水平 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理。收集各組細(xì)胞，冰上進(jìn)行裂解并收集細(xì)胞裂解液，按照SOD、GSH-Px及MDA試劑盒操作說明書分別加入相應(yīng)試劑，孵育后測各樣品OD值，計算SOD和GSH-Px活性及MDA水平。

2.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理。胰酶消化收集各組細(xì)胞，根據(jù)FITC AnnexinV/PI雙染試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑孵育后，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡水平。

2.9 Mito-Tracker Green染色法觀察細(xì)胞線粒體分裂 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理。根據(jù)Mito-Tracker Green試劑盒說明書，將試劑加入到處理細(xì)胞中孵育30 min后進(jìn)行熒光顯微鏡拍照，觀察各組細(xì)胞中線粒體的變化。

2.10 qRT-PCR檢測線粒體生物合成相關(guān)基因的表達(dá)情況 取對數(shù)期L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取各樣本的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件及引物序列信息參考前期研究[9]。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算PGC-1α mRNA、NRF-1 mRNA、TFAM mRNA相對表達(dá)量。

2.11 qRT-PCR檢測mtDNA拷貝數(shù) 取對數(shù)生長期的L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理，根據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞mtDNA，mtDNA拷貝數(shù)以線粒體編碼基因細(xì)胞色素b的拷貝數(shù)為代表。PCR擴(kuò)增條件及引物序列信息參考前期研究[9]。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算mtDNA相對表達(dá)量。

2.12 Western blotting檢測線粒體生物合成相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 取對數(shù)期L02細(xì)胞接種于6孔板，按照“2.4”分組處理，收集各組細(xì)胞沉淀，嚴(yán)格按照RIPA試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總蛋白，并通過BCA試劑盒測定各組蛋白濃度。取35 μg蛋白沸水浴變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌3次，分別加入PGC-1α、NRF-1、TFAM、GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，滴加ECL顯色，凝膠成像儀顯像。采用Image 6.0軟件計算各泳道蛋白灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算各蛋白相對表達(dá)量。

2.13 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度MⅥ對L02細(xì)胞增殖活性的影響 采用不同濃度（0、7.5、15、30、60、120 μmol/L）MⅥ處理L02細(xì)胞24 h。MTT檢測結(jié)果顯示，隨著MⅥ濃度的升高，L02細(xì)胞增殖活性逐漸降低。當(dāng)MⅥ濃度＞30 μmol/L時，L02細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）。因此，選擇7.5、15、30 μmol/L作為后續(xù)MⅥ干預(yù)濃度。（見圖1）

圖1 不同濃度MⅥ對L02 細(xì)胞增殖活性的影響（，n=3）

3.2 LPS誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷模型的建立 為探索合適的LPS建模濃度，采用不同濃度（0、10、20、40、80、160 μg/mL）LPS處理L02細(xì)胞24 h。MTT檢測結(jié)果顯示，隨著LPS處理濃度的增加，L02細(xì)胞增殖活性逐漸降低，并呈劑量依賴性。當(dāng)LPS處理濃度＞20 μg/mL時，L02細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇40 μg/mL作為LPS的建模濃度。（見圖2）

圖2 不同濃度LPS 對L02 細(xì)胞增殖活性的影響（，n=3）

3.3 MⅥ對LPS誘導(dǎo)損傷的L02細(xì)胞增殖活性的影響 與對照組比較，LPS組L02細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）；與LPS組比較，不同劑量MⅥ干預(yù)后，L02細(xì)胞增殖活性逐漸增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05）。（見圖3）

圖3 MⅥ對LPS 誘導(dǎo)損傷L02 細(xì)胞增殖活性的影響（，n=3）

3.4 MⅥ對LPS損傷L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST和ALT水平的影響與對照組比較，LPS組L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT和AST水平均明顯升高（P＜0.05）；與LPS組比較，隨著MⅥ干預(yù)劑量的升高，L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT和AST水平逐漸降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT和AST水平明顯升高（P＜0.05）。（見圖4）

圖4 各組L02 細(xì)胞培養(yǎng)上清中AST 和ALT 水平（，n=3）

3.5 MⅥ對LPS損傷L02細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響 與對照組比較，LPS組L02細(xì)胞中MDA含量明顯升高（P＜0.05），而GSH-Px和SOD活性均明顯降低（P＜0.05）；與LPS組比較，不同劑量MⅥ干預(yù)后，MDA含量明顯降低（P＜0.05），而GSH-Px和SOD活性均明顯升高（P＜0.05）；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞中MDA含量明顯升高（P＜0.05），而GSH-Px和SOD活性均明顯降低（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組L02 細(xì)胞中SOD、GSH-Px 活性及MDA含量比較（，n=3）

3.6 MⅥ對LPS損傷L02細(xì)胞凋亡水平的影響 與對照組比較，LPS組L02細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與LPS組比較，不同劑量MⅥ干預(yù)后，L02細(xì)胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組L02 細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

圖7 各組細(xì)胞凋亡水平比較（，n=3）

3.7 MⅥ對LPS損傷L02細(xì)胞中線粒體分裂及mtDNA拷貝數(shù)的影響 對照組L02細(xì)胞線粒體分布于胞漿中，呈致密的網(wǎng)狀，綠色熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，線粒體分裂正常；LPS組L02細(xì)胞線粒體呈分散小顆粒狀改變，綠色熒光強(qiáng)度較弱，線粒體分裂異常；不同劑量MⅥ干預(yù)后，L02細(xì)胞線粒體逐漸由分散小顆粒狀變成致密的網(wǎng)狀，綠色熒光逐漸變強(qiáng)，線粒體裂變增多；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)分散小顆粒狀改變，綠色熒光強(qiáng)度減弱，線粒體分裂異常。（見圖8）

圖8 Mito-Tracker Green 染色觀察各組細(xì)胞線粒體分裂情況（×400）

與對照組比較，LPS組L02細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與LPS組比較，不同劑量MⅥ干預(yù)后，L02細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)均明顯升高（P＜0.05）；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)明顯降低（P＜0.05）。（見圖9）

圖9 各組細(xì)胞mtDNA 拷貝數(shù)比較（，n=3）

3.8 MⅥ對LPS損傷L02細(xì)胞中線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響 與對照組比較，LPS組L02細(xì)胞中PGC-1α、NRF-1和TFAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）；與LPS組比較，不同劑量MⅥ干預(yù)后，L02細(xì)胞中PGC-1α、NRF-1、TFAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均逐漸升高（P＜0.05）；與MⅥ-H組比較，MⅥ-H+SR-18292組L02細(xì)胞中PGC-1α、NRF-1、TFAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。（見圖10～12）

圖10 各組L02 細(xì)胞中PGC-1α mRNA、NRF-1 mRNA 和TFAM mRNA 水平比較（，n=3）

圖11 各組L02 細(xì)胞中PGC-1α、NRF-1 和TFAM 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖12 各組L02 細(xì)胞中PGC-1α、NRF-1 和TFAM 蛋白表達(dá)水平比較（，n=3）

4 討論

膿毒癥是引起急性肝損傷的原因之一，盡管對于急性肝損傷的治療取得了很大的進(jìn)步，但是急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制還未完全明確。近些年來，由膿毒癥引起的肝細(xì)胞損傷正成為研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，其中對線粒體功能損害的研究也日益增多[10]。

羅漢果皂苷具有許多藥理活性，如抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病、抗炎和抗癌等功效[11]。本研究采用LPS處理肝細(xì)胞建立體外膿毒癥急性肝損傷模型，MⅥ干預(yù)能夠明顯降低肝細(xì)胞損傷標(biāo)志性指標(biāo)（AST和ALT）[12]，同時流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也揭示肝細(xì)胞凋亡水平降低，說明MⅥ能夠?qū)Ω渭?xì)胞損傷起保護(hù)作用。研究[13]表明，GSH-Px、SOD和MDA是細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的經(jīng)典標(biāo)志物。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激能夠明顯降低肝細(xì)胞GSH-Px、SOD活性，升高M(jìn)DA含量，而高劑量的MⅥ處理則能夠明顯升高GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量。MⅥ能夠參與細(xì)胞氧化應(yīng)激過程，并且通過降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用，抑制LPS誘導(dǎo)的膿毒癥引起肝細(xì)胞損傷，這些發(fā)現(xiàn)與之前研究報道一致[9]。

膿毒癥的發(fā)生會引起線粒體過度的氧化應(yīng)激和功能受損[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，LPS刺激能夠明顯降低mtDNA的拷貝數(shù)，并且線粒體熒光探針處理后，熒光強(qiáng)度也明顯降低。然而，在MⅥ干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)mtDNA的拷貝數(shù)和線粒體熒光強(qiáng)度，這一現(xiàn)象提示MⅥ具有保護(hù)細(xì)胞線粒體的作用。線粒體的生物合成過程由多種蛋白調(diào)控，其中PGC-1α是最重要的蛋白之一，當(dāng)PGC-1α被磷酸化或去乙?；?，PGC-1α能夠激活NRF1和NRF2，然后激活TFAM，合成線粒體DNA和蛋白產(chǎn)生新的線粒體。因此，激活信號通路PGC-1α/NRF/TFAM是合成線粒體不可或缺的途徑[15]。LPS組線粒體拷貝數(shù)和線粒體熒光強(qiáng)度均明顯低于對照組，線粒體合成相關(guān)分子PGC-1α、NRF和TFAM的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說明LPS誘導(dǎo)的膿毒癥肝細(xì)胞損傷模型能破壞線粒體功能影響線粒體的合成。MⅥ干預(yù)后，PGC-1α、NRF和TFAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，說明MⅥ能夠通過分子水平發(fā)揮保護(hù)線粒體的功能。

為了進(jìn)一步在分子水平上證實(shí)MⅥ對肝細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用，本研究采用PGC-1α的特異性抑制劑SR-18292共處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，與單獨(dú)高劑量MⅥ比較，抑制劑和高劑量MⅥ共處理能明顯提高細(xì)胞培養(yǎng)上清中的AST和ALT含量；在細(xì)胞氧化應(yīng)激水平方面，抑制劑的加入會降低GSH-Px、SOD活性，而升高M(jìn)DA含量；在細(xì)胞線粒體拷貝數(shù)、線粒體熒光強(qiáng)度方面，加入抑制劑會明顯降低線粒體拷貝數(shù)和熒光強(qiáng)度。同時，抑制劑SR-18292能降低PGC-1α、NRF和TFAM的表達(dá)，影響線粒體的生成并且能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果充分說明MⅥ能夠降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，保護(hù)線粒體的功能使細(xì)胞免于凋亡。有報道顯示，MⅥ能夠在體外衰老的細(xì)胞模型中明顯降低細(xì)胞中的ROS水平，減輕紡錘體的形成和染色體異常排列，提高線粒體數(shù)量、ATP水平和膜電位，同時也能降低細(xì)胞的凋亡水平[16]。該項(xiàng)研究也支持本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時也進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)論：MⅥ能通過PGC-1α/NRF/TFAM信號通路促進(jìn)線粒體的生物合成，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，改善膿毒癥引起的肝細(xì)胞損傷。