沈燕如,泥永淘,胡偉,李磊,歐珠羅布
1.西藏大學附屬阜康醫(yī)院消化內科,西藏拉薩 850000;2.西藏大學附屬阜康醫(yī)院實驗室,西藏拉薩 850000;3.西藏大學醫(yī)學院,西藏拉薩 850000
《2020全球癌癥報告》顯示,2018年全球結直腸癌新發(fā)193萬例,死亡93萬例,居第3位常見癌癥和第2位常見癌癥死亡原因[1]??v觀國內,結直腸癌位居第3位常見癌癥和第5位常見癌癥死亡原因[2]。與結直腸癌發(fā)病相關的主要基因突變靶點和信號調控通路中,研究最多且最典型的是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)所介導的信號傳導通路,而K-ras、PIK3CA基因是導致EGFR下游信號通路持續(xù)激活的主要原因之一。西藏海拔高,特殊環(huán)境及飲食背景下,藏族結直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達情況及其相關性值得探究,但目前鮮有相關研究報道?;?此,本研究選取2020年9月—2021年9月于西藏大學附屬阜康醫(yī)院就診的70例藏族結直腸癌患者為研究對象,分析藏族結直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變與EGFR基因表達情況及三者之間的相關性,旨在為藏族結直腸癌患者分子靶向治療提供理論依據(jù)?,F(xiàn)報道如下。
選取于本院診治的藏族結直腸癌患者70例為研究對象。本研究通過西藏大學附屬阜康醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。70例患者中男43例,女27例;年齡34~75歲,平均(53±11.8)歲。
納入標準:①手術切除腫瘤組織/內鏡活檢組織病理確診結直腸癌;②臨床資料完整;③世居西藏。排除標準:①有放療或化療史者;②合并其他惡性腫瘤者。
1.3.1熒光定量PCR法檢測K-ras、PIK3CA基因突變將石蠟包埋的結直腸癌組織5 μm厚切片,連續(xù)切10張。DNA提取試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司)提取切片中的結直腸癌組織DNA,K-ras基因突變檢測試劑盒和PIK3CA基因突變檢測試劑盒檢測K-ras基因第2、3、4外顯子和PIK3CA基因第20外顯子突變情況。
1.3.2免疫組化SP法檢測EGFR基因表達EGFR單克隆抗體(鼠抗人)、pv-6000試劑盒、DAB染色液、PBS緩沖液(粉末)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。按照試劑盒說明進行實驗操作,采用PBS代替一抗作陰性對照,已知的陽性切片作陽性對照。以細胞質或細胞膜出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為陽性。
分析藏族結直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達情況,三者與臨床病理特征的關系及三者之間的相關性。
采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù),計數(shù)資料以[n(%)]表示,采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
70例藏族結直腸癌患者中有28例存在K-ras基因突變,突變率為40.0%;6例存在PIK3CA基因突變,突變率為8.6%;43例EGFR基因呈陽性表達,陽性率為61.4%。
K-ras基因突變率,右半結腸癌患者高于左半結腸癌患者、TNMⅢ~Ⅳ期結直腸癌患者高于TNMⅠ~Ⅱ期結直腸癌患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);不同年齡分層(分為≥60歲和<60歲)、性別、腫瘤直徑(分為≥5 cm和<5 cm)和分化程度的結直腸癌患者之間K-ras基因突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PIK3CA基因突變率,低分化結直腸癌患者高于中高分化結直腸癌患者,TNMⅢ~Ⅳ期結直腸癌患者高于TNMⅠ~Ⅱ期結直腸癌患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);不同年齡分層、性別、原發(fā)部位和腫瘤直徑的結直腸癌患者之間PIK3CA基因突變率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。EGFR基因陽性表達,TNMⅢ~Ⅳ期結直腸癌患者高于TNMⅠ~Ⅱ期結直腸癌患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);不同年齡分層、性別、原發(fā)部位、腫瘤直徑和分化程度的結直腸癌患者之間EGFR基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
表1 藏族結直腸癌患者K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達與臨床病理特征的關系[n(%)]
5例患者存在K-ras基因和PIK3CA基因共同突變。K-ras基因突變和PIK3CA基因突變之間存在正相關(r=0.271,P=0.023)。19例患者存在K-ras基因突變且EGFR基因陽性表達,但K-ras基因突變和EGFR基因陽性表達之間無相關性(r=0.108,P=0.374)。4例患者存在PIK3CA基因突變且EGFR基因陽性表達,但PIK3CA基因突變和EGFR基因陽性表達之間無相關性(r=0.033,P=0.787)。
EGFR又稱HER-1,為HER/erbB家族成員,在缺乏特異性配體時,其處于抑制狀態(tài),當EGFR配體與EGFR胞外結合域結合后可致EGFR二聚化和激活。一些惡性腫瘤細胞異常產生EGFR配體,以自分泌方式激活EGFR,另外EGFR亦可以被自身的突變激活。EGFR的激活刺激下游通路(RAS/MAPK和PI3K/AKT信號通路等)的激活,導致癌細胞增殖。EGFR存在于細胞質及細胞膜表面,在癌組織中表達最高,在腺瘤中表達中等,在正常上皮中表達極低。本研究結果顯示,EGFR基因陽性表達率較高,為61.4%,與文獻報道基本一致[3]。
K-ras屬RAS基因家族,是癌癥中最常突變的癌基因。K-ras基因編碼的K-ras蛋白有GTP酶活性,其如同一個分子開關,在活化和非活化的信號傳導結構之間循環(huán)。K-ras蛋白結合GTP時為活化態(tài),K-ras蛋白與下游信號分子結合并激活相應效應分子,信號實現(xiàn)傳遞;當GTP水解且K-ras蛋白結合GDP時為失活態(tài),信號被阻止。當K-ras基因突變后,K-ras蛋白的GTP酶活性降低,其水解GTP能力下降,與GTP牢固結合,持續(xù)處于活化態(tài),從而放大下游信號通路。這導致細胞內信號轉導紊亂,細胞不依賴EGFR地激活信號,持續(xù)增殖甚至癌變[4]。本研究結果顯示,K-ras基因突變率為40.0%,與文獻報道基本一致[5-6]。
PI3K/AKT是EGFR激活的第2個主要信號通路。EGFR與配體結合激活PI3K。PI3K由催化亞基p110和調節(jié)亞基p85組成。p110可使PIP2磷酸化生成PIP3,PIP3隨后激活AKT,而AKT可促進細胞增殖,抑制細胞凋亡。PIK3CA是編碼p110的基因,正常細胞中p110為低活性,當PIK3CA突變后可通過激活p110,刺激AKT信號而致細胞增殖和侵襲。本研究中PIK3CA基因突變率為8.6%,朱鳳偉等[6]研究結果顯示結直腸癌患者中PIK3CA突變率為5.67%,而Poulsen TS等[7]研究得出PIK3CA在結直腸癌患者中突變率為18.8%,該差異可能與民族及環(huán)境有關。
進一步分析K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因陽性表達與臨床病理特征的關系,本研究顯示右半結腸癌患者及TNMⅢ~Ⅳ期結直腸癌患者Kras基因突變率更高。本結果與美國癌癥數(shù)據(jù)庫分析的19877例無轉移結直腸癌患者的相關研究結論相一致[8]。有研究表明K-ras基因突變同結直腸癌的轉移密切相關[9]。本研究顯示K-ras基因突變與年齡、性別、腫瘤直徑和分化程度無關。朱鳳偉等[6]研究發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變與患者年齡、性別、腫瘤大小無關,此與本研究結果一致。但不同的是其研究顯示K-ras基因突變與肝轉移和臨床分期亦無關。另也有研究指出K-ras基因突變率隨年齡增加而升高[10]。分析上述不同可能與樣本量及民族地域差異有關。本研究顯示,低分化結直腸癌患者及TNMⅢ~Ⅳ期結直腸癌患者PIK3CA基因突變率更高。劉鑫等[5]研究亦發(fā)現(xiàn)Ⅲ~Ⅳ期結直腸癌患者其PIK3CA基因突變率更高。但另有研究顯示,PIK3CA基因突變與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度及臨床分期均無關[6],該差異可能與腫瘤異質性有關,還需進一步研究驗證。本研究中TNMⅢ~Ⅳ期結直腸癌患者EGFR基因陽性表達率更高。Nemanqani DM等[3]研究亦發(fā)現(xiàn)EGFR在晚期結直腸癌中有較高的表達。本研究顯示不同年齡分層、性別、原發(fā)部位、腫瘤直徑和分化程度患者之間EGFR基因表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而Lawan AI等[11]研究顯示腫瘤大小與EGFR陽性表達之間存在關聯(lián),與本文不一致,可能與本研究樣本量較少有關。
本研究中,有5例患者存在K-ras基因和PIK3CA基因共同突變(突變率為7.1%),兩者之間存在正相關,與報道一致[12]。但K-ras、PIK3CA基因突變與EGFR基因陽性表達之間無相關性。有研究指出K-ras基因突變與EGFR基因突變幾乎不會同時出現(xiàn),考慮兩者的基因突變在腫瘤的發(fā)生中是獨立存在的[13]??笶GFR單抗是結直腸癌最常用的靶向藥物,抗EGFR單抗能結合EGFR的胞外區(qū)域阻止配體與EGFR結合,抑制EGFR及其下游信號通路的激活。K-ras基因突變后可抵抗EGFR單抗,導致EGFR單抗治療無效[14]。在EGFR單抗治療無效的患者中,K-ras基因突變占30%~40%,有研究提出PIK3CA基因突變可能是導致K-ras野生型患者EGFR單抗治療無效的原因[15]。目前,多數(shù)學者認為K-ras和PIK3CA基因突變狀態(tài)與化療療效相關。美國綜合癌癥網絡NCCN指南[16]建議所有轉移性結直腸癌患者進行K-ras基因突變檢測,K-ras基因突變患者不建議應用西妥昔單抗和帕尼單抗。西藏藏族群居于高原環(huán)境,飲食習慣與低海拔區(qū)人群有明顯不同,藏族人群結直腸癌疾病特征及K-ras、PIK3CA基因突變及EGFR基因表達情況自有特點。本研究中,存在樣本量小、,缺乏生存隨訪等缺陷,需進一步探究。
綜上所述,70例藏族結直腸癌患者中K-ras基因突變率為40.0%,PIK3CA基因突變率為8.6%,EGFR基因陽性表達率為61.4%。K-ras基因突變和PIK3CA基因突變存在正相關,但K-ras、PIK3CA基因突變與EGFR基因陽性表達之間無相關性。所以,在結直腸癌進展過程中,K-ras基因和PIK3CA基因可能是協(xié)同作用,而K-ras、PIK3CA基因與EGFR基因可能是相關獨立作用,對此還需進一步研究。有必要對藏族結直腸癌患者進行K-ras、PIK3CA基因突變和EGFR基因表達檢測,不但有利于精準治療,改善預后,同時也可為完善藏族結直腸癌基因突變情況提供研究參考。