姜宜鑫 劉玉芳 趙大華 張楊楊 于 寧

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 山東 濱州 256603

子宮內(nèi)膜樣癌(endometrioid adenocarcinoma，EAC)是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，分為I型癌和II型癌兩種亞型。I型癌最為常見，以EAC為代表，大部分EAC臨床進展緩慢，總體預(yù)后較好，但仍有5%～15%的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或者死亡，腫瘤晚期或復(fù)發(fā)的患者生存率明顯降低，輔助治療也十分有限。因此，探討EAC發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的分子改變和研究EAC的發(fā)病機制對于腫瘤的治療、預(yù)防具有重要的臨床意義。

蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后有相關(guān)性[1]。為研究CIP2A在EAC中的表達及其臨床意義，本研究通過免疫組化、RT-PCR檢測，比較正常增生期子宮內(nèi)膜(normal endometrium，NE)和不同子宮內(nèi)膜病變中CIP2A表達情況，來觀察CIP2A的表達與臨床病理參數(shù)及與患者預(yù)后的關(guān)系，探討CIP2A蛋白在EAC惡性進展中的生物學(xué)作用及在患者預(yù)后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院病理科2009年1月到2014年1月存檔的病例及蠟塊，包括150例EAC、14例子宮內(nèi)膜不典型增生(endometrial atypical hyperplasia，EAH)、20例子宮內(nèi)膜增生癥(endometrial hyperplasia，EH)及30例NE。150例EAC患者年齡為30～75歲，平均年齡為(55.2±3.6)歲。收集14例新鮮的EAC組織和腫瘤組織旁正常內(nèi)膜組織，樣本保存于液氮罐。所有樣本的使用均經(jīng)過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，并且獲得患者或其家屬的知情同意。所有入選病例的切片都由兩位病理醫(yī)生重新閱片，統(tǒng)一診斷意見。查閱患者的病歷資料和病理報告，記錄相關(guān)資料。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法 鼠抗人CIP2A單克隆抗體(NB110-59722)購自于Novus Biologicals公司。鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號為MIB1)、羊抗兔/鼠二抗及免疫組織化學(xué)試劑盒(PV900)購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。按試劑盒說明進行操作，石蠟標本切片厚度為3 μm，60℃烤箱內(nèi)烤片40 min，經(jīng)二甲苯、梯度酒精水化，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，采用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS緩沖液浸泡3 min/次，共3次。血清封閉30 min后甩去血清，加入CIP2A一抗(1∶1 000)，Ki-67一抗孵育，4℃過夜。加入生物素標記通用型二抗，37℃溫箱內(nèi)孵育30 min，PBS緩沖液浸泡 3 min/次，共3次。DAB試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察。用已知陽性的切片作為CIP2A的陽性對照，用扁桃體組織切片作為Ki-67的陽性對照，PBS代替一抗作空白對照。每張切片綜合閱片觀察后，計數(shù)10個視野，評估陽性細胞的強度和所占的比例。

1.2.2 CIP2A的免疫組化結(jié)果判定 腫瘤細胞的胞漿和胞核著色均被認為是陽性著色。CIP2A染色強度分為0(完全不著色)，1(弱陽性)，2(中度陽性)，3(強陽性)四個等級。陽性細胞的比例評分為1(1%～25 %)，2(26%～50 %)，3(51%～75 %)，4(76%～100%)。免疫組化結(jié)果即為陽性細胞著色的強度和比例的評分乘積，判定標準為：得分為0～1分判定為陰性，2～5分判定為CIP2A低表達，6～12分判定為CIP2A高表達。

1.2.3 Ki-67的免疫組化結(jié)果判定 陽性著色部位在腫瘤細胞的細胞核。采用半定量法判定結(jié)果。腫瘤細胞的著色程度為1(弱陽性)，2(中度陽性)，3(強陽性)。腫瘤陽性細胞的百分比評分為0(≤5%)，1(6%～25 %)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(76%～100%)。兩項指標評分乘積，判定標準為：0分為陰性表達，1～7分為低表達，8～12分為高表達。

1.2.4 實時熒光定量PCR 用RNAiso(TaKaRa公司)從EAC組織和正常內(nèi)膜組織中提取總RNA。按照PrimeScript TM RT reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司)的說明書合成cDNA，使用SYBR? Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)試劑盒檢測CIP2A的mRNA表達水平，以GAPDH為內(nèi)參。使用Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR系統(tǒng)。CIP2A和GAPDH的引物均由TaKaRa公司設(shè)計合成，以正常內(nèi)膜組織的表達量作為對照，用相對Ct值來表示CIP2A的相對表達量。

1.3 隨訪 電話和回訪中心隨訪150例EAC患者的術(shù)后恢復(fù)及生存情況，獲得完整的隨訪資料。出現(xiàn)下列情況中的一種并且排除其他惡性腫瘤的可能，即視為復(fù)發(fā)：患者出現(xiàn)胸水或腹水，細胞學(xué)檢查找到癌細胞；盆、腹腔或遠隔部位出現(xiàn)影像學(xué)能夠測量的占位性病灶；影像學(xué)檢查為陰性，但血清中腫瘤標記物如CA125等持續(xù)性升高。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。運用方差分析或Fisher'精確檢驗分析CIP2A在不同的內(nèi)膜病變中陽性率的差異，以及CIP2A的表達與臨床病理指標之間的關(guān)系。Kaplan-Meier統(tǒng)計法進行生存分析，以患者死亡和腫瘤復(fù)發(fā)為終點事件，計算總體生存率。生存率的比較采用Log-Rank時序檢驗。生存資料的多因素分析應(yīng)用Cox比例風險回歸模型。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIP2A在不同病變的子宮內(nèi)膜病變中的表達 CIP2A的陽性著色部位為細胞漿及細胞核。在正常子宮內(nèi)膜組織中，大部分的內(nèi)膜腺體呈現(xiàn)陰性表達，少數(shù)有局灶弱陽性表達(圖1)。CIP2A的陽性表達在不同的內(nèi)膜病變組織中存在差異。CIP2A的表達陽性率在NE、EH、EAH、EAC中呈上升趨勢，分別為26.7%、40%、42.9%和87.3%，在EAC中陽性率最高。EAC與其他三組的CIP2A陽性率相比，P均<0.01。而CIP2A在NE、EH及EAH三組之間的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。150例EAC病例中，79例(52.6%)CIP2A蛋白呈現(xiàn)高表達，52例(34.7%)低表達，19例(12.7%)為陰性。見表1。

A. CIP2A在正常增生期子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)陰性表達(×40)；B. CIP2A在子宮內(nèi)膜樣癌組織中呈現(xiàn)陰性表達(×200)；

表1 CIP2在不同子宮內(nèi)膜的表達

2.2 CIP2A蛋白表達與EAC患者臨床病理特征的關(guān)系 CIP2A蛋白表達在EAC中與組織學(xué)分級、FIGO分期以及宮頸管受累有相關(guān)性，P<0.05。CIP2A的陽性表達與Ki-67增殖指數(shù)有明顯相關(guān)性，P<0.01。CIP2A蛋白表達與患者年齡、肌層侵犯、脈管癌栓、淋巴結(jié)及附件的累及均未見明顯相關(guān)性。見表2。

表2 子宮內(nèi)膜樣癌CIP2A表達與子宮內(nèi)膜樣癌臨床病理指標的關(guān)系

2.3 CIP2A蛋白在EAC組織中的表達 本研究應(yīng)用RT-PCR法檢測了14例EAC組織和癌旁正常內(nèi)膜組織中CIP2A的表達水平，結(jié)果顯示，14例EAC組織的CIP2A mRNA相對表達量高于正常子宮內(nèi)膜組織的相對表達量，P<0.01(圖2)。

2.4 CIP2A的表達與患者預(yù)后的關(guān)系 150例EAC患者隨訪資料完整，隨訪時間為25～89月。12例EAC患者死亡，4例復(fù)發(fā)，五年生存率為96%。

NE. 增生期子宮內(nèi)膜；EAC.子宮內(nèi)膜樣癌。兩組比較，**P<0.01。

本研究對150例EAC患者的生存時間進行Kaplan-Meier曲線分析，結(jié)果顯示，CIP2A蛋白高表達的EAC患者總體生存率明顯降低，CIP2A高表達與EAC患者總生存率下降顯著相關(guān)，P<0.05(圖3)。

圖3 Kaplan-Meier生存率分析

Cox比例風險模型的單因素分析顯示，CIP2A表達水平、組織學(xué)分級、FIGO分期、肌層浸潤、脈管內(nèi)癌栓、附件轉(zhuǎn)移及Ki-67增殖指數(shù)均會影響患者總體生存期，P<0.05。多因素生存分析結(jié)果顯示，組織學(xué)分級、FIGO分期、脈管內(nèi)癌栓是影響EAC患者預(yù)后的獨立因素。見表3。

表3 Cox單因素和多因素分析各因素在EAC患者預(yù)后中的作用

3 討論

CIP2A是一種癌基因，也是蛋白磷酸酶2A的內(nèi)源性抑制劑[1]。CIP2A通過抑制蛋白磷酸酶2A介導(dǎo)的原癌基因c-Myc的N端62位點的磷酸化，維持c-Myc蛋白高水平表達，使腫瘤表現(xiàn)出惡性特征。CIP2A能夠與許多癌基因及轉(zhuǎn)錄因子相互作用[2-5]，這些因子包括癌基因(RAS、beta- catenin、c-SRC)以及轉(zhuǎn)錄因子(E2F1、ETS1、ATF2、FLT1、CHK1)等。CIP2A可以調(diào)控多種信號通路如PI3K-mTOR信號通路[6-7]、RAS-MEK-ERK信號通路[8]以及Wnt-beta-catenin信號通路[9]，這些信號通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此，CIP2A在腫瘤形成的各個環(huán)節(jié)中都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。CIP2A在大部分正常的組織和細胞中表達水平較低，是一種特異性的腫瘤生物學(xué)標志物，可作為具有潛力的腫瘤治療靶點。本研究重點分析了CIP2A蛋白在EAC中的表達水平及與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為EAC的治療提供新的理論依據(jù)。

EAC的發(fā)生發(fā)展與雌激素的過度刺激有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CIP2A在不同的子宮內(nèi)膜病變組織中均有表達，從EH、非典型增生到EAC的過程中，CIP2A蛋白的陽性率明顯升高，在癌組織中的陽性率明顯高于正常增生期、增生癥及非典型增生的內(nèi)膜組織。這提示，CIP2A在EAC發(fā)生發(fā)展的過程中起到了重要的促進作用。免疫組化及PCR結(jié)果顯示，無論是蛋白水平或者mRNA水平，CIP2A在癌組織中的表達水平明顯高于正常內(nèi)膜組織，87.3%的病例呈現(xiàn)彌漫的細胞核和細胞漿的陽性著色，其中胞漿的著色更加廣泛且明顯。本研究分析CIP2A表達與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，CIP2A表達與組織學(xué)分級、FIGO分期相關(guān)，在低分化和FIGO分期較高的病例中陽性率明顯升高。本研究還顯示，CIP2A的陽性表達與較高的Ki-67增殖指數(shù)有明顯相關(guān)性。Ki-67是一種與細胞增殖有關(guān)的核抗原，是評估腫瘤細胞增殖的良好指標。CIP2A對多種腫瘤細胞的增殖具有促進作用，包括肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、腎細胞癌、結(jié)腸癌，軟骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤等[4,10-14]。本研究也初步證實了CIP2A在EAC中具有促進細胞惡性增殖的能力，在腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過程中起到重要的作用。CIP2A對腫瘤細胞增殖的調(diào)控有可能是通過c-Myc原癌基因?qū)崿F(xiàn)的，c-Myc在細胞周期調(diào)控中起著重要作用，而CIP2A能夠保持c-Myc的高表達，進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖。

CIP2A的高表達與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，包括宮頸癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、甲狀腺癌及多發(fā)性骨髓瘤等[5,15]，是有價值的腫瘤預(yù)后評價的生物學(xué)指標。本研究對150例EAC患者進行隨訪發(fā)現(xiàn)，EAC的總體預(yù)后較好，5年生存率為96%。Kaplan-Meier分析顯示，CIP2A高表達的EAC患者生存時間顯著降低。16例死亡或復(fù)發(fā)的病例中，有13例呈現(xiàn)CIP2A蛋白彌漫強陽性高表達狀態(tài)，提示CIP2A蛋白的高表達與EAC的不良預(yù)后有關(guān)。Cox比例風險回歸模型結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期、組織學(xué)分級和脈管內(nèi)癌栓的存在是EAC患者預(yù)后的獨立因素，而CIP2A的高表達并非不良預(yù)后的獨立的影響因素。這個統(tǒng)計結(jié)果可能與EAC相對較高的生存率有關(guān)。

綜上所述，CIP2A在EAC中呈現(xiàn)高表達，并且能夠促進腫瘤細胞的增殖，在EAC的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，其高表達可作為EAC預(yù)后判斷中的一個重要的參考指標。