萬正強 李 成 鄭冬冰 王英磊

1 濱州醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺 264003； 2濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院泌尿外科 山東 煙臺 264010

細胞周期蛋白B1(cyclinB1，CCNB1)基因定位于人染色體5q12，長約8.8 kb，包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，可由2個不同的轉(zhuǎn)錄起始位點產(chǎn)生2個不同轉(zhuǎn)錄組，分別是組成型表達蛋白和G2/M期細胞周期調(diào)節(jié)蛋白[1]。其編碼產(chǎn)物細胞周期蛋白B1的分子質(zhì)量為62kD，含出核序列和入核序列，2種序列通過自身磷酸化的改變促進CCNB1穿梭于胞質(zhì)和胞核間，使CCNB1在整個細胞周期中始終處于一種動態(tài)平衡[2]。CCNB1與細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependentkinase1，CDK1)結(jié)合并磷酸化CDK1Thr160/Thr161形成異源二聚體CCNB1/CDK1，即細胞成熟促進因子(maturationpromotingfactor，MPF)，促進細胞從G2期進入M期，啟動細胞有絲分裂[3]。CCNB1在細胞中的功能隨細胞周期變化，間期集中在細胞質(zhì)，但可以穿梭到細胞核，前期在細胞核中累積，然后在前中期聚集染色質(zhì)、紡錘體微管、中心體和染色質(zhì)，進入有絲分裂時，CCNB1-CDK1被激活并促進早期事件，比如染色體濃縮、細胞核膜包膜破壞和紡錘體極裝配。CCNB1-CDK1復(fù)合物的另一功能是分解核膜使得有絲分裂紡錘體進入染色體[4]。

許多研究表明 CCNB1 在多種腫瘤中異常表達，如肺癌[5]、乳腺癌[6]、食管癌[7]、結(jié)腸癌[8]、肝癌[9]等腫瘤組織，并參與各種癌癥類型的細胞生長、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移，有望作為腫瘤診斷和預(yù)后的分子標志物。CCNB在非小細胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)中的表達高于正常組織，并且與患者的分化程度、組織類型、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤直徑、分期、有無遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)；并且高表達的患者有較短的總生存率，這些結(jié)果表明CCNB1可用作診斷和預(yù)后生物標志物及治療NSCLC的分子靶點[10-11]。Fang等[12]在研究p53突變的乳腺癌中，體外實驗研究示circ-ccnb1與H2AX 和Bclaf1 形成復(fù)合物，抑制乳腺癌細胞增殖，促進凋亡，表明突變型p53促進乳腺癌進展受到環(huán)狀RNA circ-CCNB1抑制。Huang等[13]利用免疫組化檢測了 100 例食管鱗癌組織和 41 例正常組織中CCNB1的表達水平，發(fā)現(xiàn)CCNB1在癌組織中過表達并且與病理分級有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，進一步體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn) CCNB1 的異位表達能促進細胞增殖，增強細胞侵襲和遷移能力并導(dǎo)致細胞通過毛細血管內(nèi)皮外滲的能力增加，同時發(fā)現(xiàn)CCNB1能通過促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變促進轉(zhuǎn)移。相反，沉默CCNB1可以抑制食管癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)細胞株中抑制CCNB1的表達能抑制腫瘤細胞的增殖，并能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)分子CDK1/CDC25C 促使細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，還發(fā)現(xiàn)抑制CCNB1可能通過激活p53-野生型HCT116細胞中的p53/Bax通路促使腫瘤細胞發(fā)生早期凋亡。然而抑制CCNB1 表達可抑制p53-突變HCT116細胞增殖，阻斷細胞周期進程，誘導(dǎo)細胞凋亡。谷軍生等[15]在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中研究發(fā)現(xiàn)抑制CCNB1的表達后，肝癌細胞系的增殖能力明顯降低，細胞遷移能力和侵襲能力及成瘤能力受到顯著抑制，肝癌細胞系的凋亡率明顯升高。Chai等[16]研究發(fā)現(xiàn)敲除肝癌細胞 SMMC7721和HepG2中的CCNB1 表達，MTT測定顯示CCNB1的敲低能顯著抑制2種HCC細胞系的增殖和腫細胞的克隆形成能力。目前，對于腫瘤中CCNB1表達，預(yù)后及免疫相關(guān)性的研究還很少，對CCNB1在腫瘤發(fā)病機制中的作用，尤其是在膀胱癌中的作用還沒有全面了解。本研究利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫對CCNBI泛癌分析，分析CCNB1在膀胱癌中的表達及臨床相關(guān)性，尋找腫瘤預(yù)后預(yù)測因子和治療新靶點。

1 材料與方法

1.1 CCNB1基因在泛癌中的差異表達分析 為了分析在不同腫瘤組織和正常組織之間CCNB1的差異表達，本研究對至少具有兩個正常組織的腫瘤類型進行t檢驗，采用基因表達水平中位數(shù)來計算倍數(shù)變化，分別在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫進行泛癌組織和癌旁組織之間CCNB1表達水平的差異分析，P<0.01且表達倍數(shù)變化值|log2(fold change)|≥2被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 HPA數(shù)據(jù)庫中CCNB1蛋白在泛癌組織中差異表達分析 HPA數(shù)據(jù)庫(human protein atlas，HPA)，即人類蛋白表達圖譜數(shù)據(jù)庫，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從RNA和蛋白水平研究人類不同組織和器官中的蛋白表達情況，從tissue atlas，cell atlas和pathology atlas角度分別展示蛋白在正常組織、細胞和腫瘤組織中的表達情況，可進行腫瘤組織蛋白差異表達分析，并可進行基因與腫瘤的生存分析。

1.3 CCNB1在泛癌中的預(yù)后分析 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫基于EGA以及TCGA等公共數(shù)據(jù)庫的基因芯片和RNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建而成[17]，可以評估54 675個基因在21種癌癥中對于生存率的影響，主要包括乳腺癌(6 234例)、卵巢癌(2 190例)、肺癌(3 452例)和胃癌(1 440例)等。PrognoScan數(shù)據(jù)庫通過大量收集公開的癌癥芯片數(shù)據(jù)集來探索基因表達與患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系，包括總體生存期和無病生存期(disease-free survival，DFS)等。本研究利用Kaplan-Meier Plotter和PrognoScan數(shù)據(jù)庫分析和驗證泛癌中CCNB1表達對患者生存率的影響，P<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義；研究TIMER和CIBERSORT數(shù)據(jù)庫中泛癌中CCNB1表達與免疫的相關(guān)性。

1.4 CCNB1表達水平與多種腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性 運用交互式在線數(shù)據(jù)庫TIMER數(shù)據(jù)庫[18]，在其“基因”模塊中研究了CCNB1表達水平和不同腫瘤中腫瘤浸潤免疫細胞(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)之間的相關(guān)性，TIMER應(yīng)用去卷積堆積方法從基因表達譜推斷腫瘤浸潤免疫細胞的豐度，TIMER數(shù)據(jù)庫包含10 897個樣本，可以對TCGA中33種癌癥類型評估其免疫浸潤的豐度，免疫細胞類型包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞6種。在此，本研究分析了CCNB1表達與腫瘤浸潤細胞的相關(guān)性并探究腫瘤免疫浸潤與患者預(yù)后的關(guān)系，并利用CIBERSORT數(shù)據(jù)庫進行部分驗證，進一步探究CCNB1與8種癌癥類型中22種免疫細胞亞型的相關(guān)性，并利用R包“GSVA包”重點分析了在膀胱癌中，CCNB1表達與24免疫細胞浸潤的相關(guān)性。

1.5 CCNB1表達水平與膀胱癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫是一個有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，主要基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進行分析，可以對相關(guān)基因進行biomarker鑒定、表達譜分析，生存分析等，還可以分析目標基因在癌和癌旁表達差異以及與癌癥組織不同病理分級、年齡、性別、體重、種族等的相關(guān)性[19]。本研究探究了CCNB1表達水平與膀胱癌臨床表型的相關(guān)性，包括病理分級，年齡、吸煙習慣、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床特征。隨后本研究從TCGA-GDC網(wǎng)站下載了408例膀胱癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)，采用卡方檢驗分析驗證CCNB1表達與膀胱癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，運用單因素與多因素Cox回歸分析影響患者生存的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 基因富集分析 通過GSEAv4.1.0軟件[20]進行基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)，以檢測CCNB1表達高分組和低分組之間差異富集的信號通路，選擇MSigDB基因集中的基因集“c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt”作為參考基因集，標準化P<0.05、標準化富集分數(shù)(normalized enrichment score，NES)>1.5且 FDRq<0.05的信號通路被認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，GSEA分析通常富集豐富的信號通路被認為是與CCNB1表達相關(guān)的潛在通路。

2 結(jié)果

2.1 CCNB1在多種腫瘤的癌組織及其癌旁組織差異表達，且與其臨床分期及預(yù)后相關(guān) 本研究在ONCOMINE和GEPIA中分析了CCNB1基因表達水平，以探究其在整個癌癥范圍內(nèi)的表達情況。在ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中，與相應(yīng)的正常組織相比，CCNB1在癌癥組織中的表達水平更高，包括膀胱癌、頭頸癌、乳腺浸潤癌、子宮頸癌、結(jié)直腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌以及淋巴瘤和肉瘤，但在膀胱癌、頭頸部鱗癌、乳腺癌中CCNB1表達既有上調(diào)，也有下調(diào)，這種情況的出現(xiàn)，本研究考慮可能與其腫瘤亞型有關(guān)。另外，在白血病、黑色素瘤中CCNB1僅表達下調(diào)(圖1A)。為了進一步分析和驗證CCNB1在泛癌中的表達情況，本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對CCNB1在前列腺腺癌、頭頸部鱗癌、肝細胞癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌和乳腺浸潤癌和其癌旁組織中的差異表達進行驗證。本研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1在前列腺腺癌、頭頸部鱗癌、肝細胞癌、肺腺癌、結(jié)腸腺癌和乳腺浸潤癌的表達顯著高于癌旁組織，P<0.05(圖1B)。以上結(jié)果表明，CCNB1在泛癌中普遍高表達，這揭示了CCNB1作為原癌基因的作用。

A.與正常組織相比，CCNB1在不同癌組織中的表達情況；B.在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，CCNB1在多種癌組織及癌旁組織差異表達(T代表腫瘤樣本，N代表正常樣本)；C.在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，CCNB1表達與多種腫瘤的臨床病理分期的相關(guān)性；D.在HPA數(shù)據(jù)庫中，CCNB1蛋白在多種癌組織及癌旁組織的表達水平；E.在腎癌、肝癌和肺癌中，CCNB1蛋白表達水平與患者總生存期的相關(guān)性。

隨后，在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，本研究探究了CCNB1表達水平與以上6種腫瘤臨床病理分期之間的相關(guān)性，包括子宮內(nèi)膜癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀癌、結(jié)腸腺癌、肺腺癌和胰腺癌。結(jié)果表明CCNB1基因的表達水平與以上4種人類腫瘤臨床病理分期有相關(guān)性，包括腎透明細胞癌、腎乳頭狀癌、結(jié)腸腺癌、肺腺癌和胰腺癌，P<0.01(圖1C)，表明CCNB1在促進腫瘤進展中有著關(guān)鍵作用，這驗證了本研究之前的觀點，CCNB1是一種普遍存在的原癌基因。

最后本研究在蛋白質(zhì)水平對CCNB1的表達情況進行了分析，利用HPA數(shù)據(jù)庫分析人直腸組織、乳腺組織、肺組織、肝組織和前列腺組織的腫瘤組織和癌旁組織中CCNB1蛋白的表達情況，并探究了CCNB1蛋白表達與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1蛋白主要表達于細胞的細胞質(zhì)中，CCNB1蛋白在腎癌、肝癌和肺癌組織中表達顯著增高，P<0.05，進一步的生存分析表明高表達CCNB1蛋白的腎透明細胞癌、肝細胞癌和肺腺癌患者總生存期較差，P<0.01(圖1D、E)，這進一步證實了CCNB1是一種普遍存在的原癌基因的觀點，是眾多癌癥預(yù)后的不利因素。

2.2 多種腫瘤CCNB1高表達與患者更差預(yù)后密切相關(guān) 為探究CCNB1表達與癌癥患者預(yù)后的相關(guān)性，本研究利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫和PrognoScan數(shù)據(jù)庫進行了相關(guān)分析，Kaplan-Meier Plotter的數(shù)據(jù)主要來自TCGA數(shù)據(jù)，而PrognoScan數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)主要來自GEO數(shù)據(jù)庫，TCGA數(shù)據(jù)和GEO數(shù)據(jù)是分別獨立的數(shù)據(jù)集，故兩個數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果可相互驗證。在兩個數(shù)據(jù)庫中，本研究分析了CCNB1表達水平與10種癌癥類型預(yù)后的相關(guān)性，包括膀胱癌、乳腺癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀癌、肝細胞癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺癌、腦癌和前列腺癌。在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫，本研究發(fā)現(xiàn)在7種癌癥類型中，CCNB1的高表達都會造成患者更低的生存率，包括膀胱癌、乳腺癌、腎透明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、卵巢癌和胰腺癌(圖2A)。

在PrognoScan數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果與在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在以下6種癌癥類型中，CCNB1的高表達都會造成患者更差的預(yù)后，包括乳腺癌、膀胱癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌和肺腺癌(圖2B)。以上分析表明，CCNB1為普通存在的原癌基因，其高表達可能會導(dǎo)致患者更差的預(yù)后。

A.在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中，CCNB1基因表達水平與腫瘤患者總生存期的相關(guān)性；B.在PrognoScan數(shù)據(jù)庫中，CCNB1基因表達水平與腫瘤患者總生存期的相關(guān)性。

2.3 CCNB1與多種腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，且可能通過影響腫瘤的免疫微環(huán)境進而影響患者預(yù)后 腫瘤浸潤性淋巴細胞是一類腫瘤浸潤性且具有抗原效應(yīng)的細胞群，包括存在于腫瘤癌巢內(nèi)的瘤內(nèi)腫瘤浸潤淋巴細胞及間質(zhì)中的基質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細胞，由T細胞、B細胞和自然殺傷細胞構(gòu)成，被認為是免疫生物學(xué)標記物，是癌癥前哨淋巴結(jié)狀態(tài)和存活的獨立預(yù)測因子。TIMER數(shù)據(jù)庫，利用RNA-Seq表達譜數(shù)據(jù)檢測腫瘤組織中免疫細胞的浸潤情況，提供6種免疫細胞的浸潤情況，包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。在此，本研究分析了在5種癌癥類型中，CCNB1與腫瘤免疫浸潤細胞的相關(guān)性，包括膀胱癌、腎透明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌和前列腺癌，分別分析了其表達水平與6種免疫浸潤細胞得分的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，在5種癌癥類型中，僅在腎透明細胞癌中CCNB1表達與其腫瘤純度顯著負相關(guān)性，而在膀胱癌、腎透明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌和前列腺癌5種癌癥類型中，CCNB 1表達與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的浸潤水平均有相關(guān)性，P<0.05。在膀胱癌中，CCNB1表達水平與CD8+T細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞的浸潤水平呈顯著正相關(guān)，而與B細胞、CD4+T細胞的浸潤水平呈顯著負相關(guān)。然而在肺腺癌中，CCNB1表達水平與B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤水平呈顯著負相關(guān)(圖3A)。這些發(fā)現(xiàn)強烈表明，在膀胱癌和肺腺癌等癌癥中，CCNB1可與免疫浸潤細胞相互作用從而影響患者的生存狀況。

隨后，本研究在TIMER數(shù)據(jù)庫進一步分析了以上5種癌癥類型免疫浸潤水平和CCNB1表達對患者預(yù)后的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，B細胞、樹突狀細胞和CCNB1表達與肺腺癌預(yù)后有關(guān)，隨著B細胞和樹突狀細胞浸潤水平升高，患者生存時間延長。CD8+T細胞、CCNB1表達與膀胱癌預(yù)后有關(guān)，隨著CD8+T細胞浸潤水平升高，患者生存時間縮短。而在腎透明細胞癌、肝細胞癌和前列腺癌中，其預(yù)后與免疫細胞浸潤無相關(guān)性(圖3B)。以上表明，CCNB1在肺腺癌、膀胱癌的免疫細胞浸潤中起著強有力的調(diào)節(jié)作用，對B細胞、樹突狀細胞和CD8+T細胞浸潤的調(diào)控作用尤其強。

為進一步探究CCNB1與以上6種免疫細胞的22種分子亞型之間的相互作用，本研究在CIBERSORT數(shù)據(jù)庫進一步分析了CCNB1與22種免疫細胞亞型的相關(guān)性，使用Spearman相關(guān)系數(shù)表示兩者之間的相關(guān)性，其結(jié)果用熱圖展示(圖3C)。泛癌熱圖顯示，CCNB1與多種腫瘤的Act-CD4+T細胞顯著負相關(guān)，隨著CCNB1高表達，其浸潤水平降低，而與Mast Acting細胞顯著正相關(guān)，隨著CCNB1表達上調(diào)，其浸潤水平增加。

A.在TIMER數(shù)據(jù)庫中，CCNB1表達水平與膀胱癌、腎透明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌和前列腺癌腫瘤免疫浸潤水平的相關(guān)性；B.在TIMER數(shù)據(jù)庫中，膀胱癌、腎透明細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌和前列腺癌中免疫浸潤水平與患者總生存期的相關(guān)性；C.在TIMER數(shù)據(jù)庫中，CCNB1表達水平與24種免疫細胞亞型的相關(guān)性分析，結(jié)果用熱圖展示；D.在CIBERSORT數(shù)據(jù)庫中，CCNB1表達水平與24種免疫細胞亞型的相關(guān)性分析，結(jié)果用棒棒圖展示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

鑒于CCNB1表達與膀胱癌免疫浸潤細胞明顯相關(guān)，且免疫浸潤水平與膀胱癌患者預(yù)后有關(guān)，故本研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱尿路上皮癌RNAseq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，利用R包“GSVA包”進一步分析了在膀胱癌中，CCNB1表達與24種免疫細胞的相關(guān)性，其相關(guān)性用Spearman相關(guān)系數(shù)表示，分析結(jié)果用棒棒圖展示。從棒棒圖中可知，在膀胱癌中，CCNB1表達與多種免疫細胞相關(guān)，包括immature DC、Macrophages、Mast cells、NK cells和Th2 cells等(表1)，其中與免疫細胞Th2 細胞顯著正相關(guān)，P<0.001(圖3C)，CCNB1表達增加，Th2 細胞浸潤水平增加。

表1 CCNB1表達水平與膀胱癌腫瘤免疫浸潤細胞的相關(guān)性

以上分析表明，CCNB1可與多種腫瘤免疫浸潤細胞相互作用從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，進而影響患者預(yù)后。

2.4 CCNB1表達水平與膀胱癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，且為膀胱癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子 鑒于CCNB1表達與膀胱癌免疫浸潤水平顯著有關(guān)，且其浸潤水平與膀胱癌患者預(yù)后相關(guān)，CCNB1在基因組、轉(zhuǎn)錄組均展示出其在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中相對特異性的作用，那么CCNB1在膀胱癌臨床層面的表現(xiàn)如何？故本研究進一步分析了CCNB1表達與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性。

為探究CCNB1表達水平與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性，本研究首先利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫進行了相關(guān)分析，包括疾病分期、年齡、吸煙習慣和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，在以上亞組分析中，膀胱腫瘤患者的CCNB1表達均明顯高于正常對照組，P<0.05。在疾病分期中，CCNB1表達在膀胱腫瘤分期II期、III期和IV期較正常對照組明顯更高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0、N1、N2和N3中CCNB1表達較正常對照組明顯更高。在年齡中，41～60、61～80和81～100歲中CCNB1表達較正常對照組表達明顯更高，且發(fā)現(xiàn)在41～60、61～80和81～100歲中CCNB1表達較21～40歲表達明顯更高，P<0.05，提示CCNB1表達與年齡有明顯相關(guān)性。在吸煙習慣中，非吸煙者、吸煙者和改良吸煙者(<15歲)和改良吸煙者(<15歲)中CCNB1表達較正常對照組表達明顯更高，但CCNB1在吸煙者中較非吸煙者中表達并無差異，表明吸煙可能并不會影響CCNB1的表達(圖4A)。綜合以上分析，本研究認為CCNB1表達可作為膀胱癌潛在的診斷指標。

為進一步分析和驗證CCNB1表達與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性，本研究從TCGA-GDC網(wǎng)站下載已被TCGA確診的408例膀胱癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)，分析CCNB1表達與其臨床病理特征的相關(guān)性，包括年齡、性別、組織學(xué)分級、總生存期、病理分期、T分期、N分期、M分期、放療、淋巴血管侵犯和吸煙與否。

首先，本研究根據(jù)CCNB1表達水平，將408例膀胱癌患者分為CCNB1高表達組和CCNB1低表達組，用卡方檢驗分析人口統(tǒng)計學(xué)和臨床病理參數(shù)與CCNB1表達的關(guān)系。分析表明，CCNB1表達水平與組織學(xué)分級(P<0.001)、淋巴血管侵犯(P=0.017)和總生存期(P=0.028)有相關(guān)性，而與年齡、性別、病理分期、T分期、N分期、M分期、放療和吸煙與否無相關(guān)性。以上分析與本研究在UALCAN數(shù)據(jù)庫的分析基本一致，但在UALCAN數(shù)據(jù)庫的分析顯示，CCNB1表達與年齡、臨床分期有相關(guān)性(P<0.05)(圖4A)，出現(xiàn)這一情況，本研究認為這可能與本研究排除了較多的臨床病理信息不全的患者所致。另外，UALCAN數(shù)據(jù)庫沒有分析CCNB1表達與膀胱癌組織學(xué)分級的關(guān)系，在此，本研究發(fā)現(xiàn)這兩者之間有相關(guān)性(P=0.017)(表2)。

表2 CCNB1基因表達水平與膀胱癌患者臨床病理特征的相關(guān)性/(n=204)

表2 (續(xù))

隨后，本研究利用Cox比例風險模型驗證CCNB1作為膀胱癌預(yù)后因素的潛力，其單因素與多因素Cox回歸分析結(jié)果使用R包“forestplot包”繪制為森林圖(圖4B、C)。單因素Cox回歸分析表明，年齡(P=0.006)、病理分期(P<0.001)、T分期(P<0.001)、N分期(P<0.001)、M分期(P<0.001)、淋巴血管侵犯(P<0.001)和CCNB1表達(P=0.020)與患者預(yù)后有關(guān)。隨后，本研究將單因素Cox分析中有意義的臨床病理特征(P<0.05)納入多因素Cox回歸模型進行多因素回歸分析，結(jié)果表明，淋巴血管侵犯(P=0.034)和CCNB1表達(P=0.009)與患者OS相關(guān)。最后，為了進一步探究CCNB1診斷膀胱癌的敏感性和特異性如何，本研究繪制了膀胱癌的ROC曲線，從圖可知，在鑒別正常組織和腫瘤結(jié)局上，變量CCNB1的預(yù)測有較高準確性(AUC=0.909，CI=0.842～0.977)。另外，在鑒別低級和高級結(jié)局上，變量CCNB1的預(yù)測能力有一定準確性(AUC=0.813，CI=0.729～0.898)(圖4D)。以上分析表明，淋巴血管侵害和CCNB1表達是膀胱癌患者預(yù)后的獨立危險因素，且CCNB1在診斷膀胱癌中有著較好的診斷效果。

A.在UALCAN數(shù)據(jù)庫中，CCNB1基因表達水平與膀胱癌臨床病理特征的相關(guān)性；B.CCNB1基因表達水平與膀胱癌臨床病理特征的單因素回歸分析；C.CCNB1基因表達水平與膀胱癌臨床病理特征的多因素回歸分析；D.CCNB1基因在膀胱癌中診斷性ROC曲線。

2.5 CCNB1與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其可能通過調(diào)控P-53信號通路等經(jīng)典癌癥通路影響膀胱癌患者預(yù)后 為探索CCNB1影響膀胱癌患者臨床結(jié)局的潛在機制，本研究利用GSEA軟件進行了基因富集分析。在P<0.05、FDRq<0.25和NES>1.5的條件下，GSEA共富集到40個KEGG信號通路，在此，本研究僅展示前10個KEGG信號通路，CCNB1低表達組和高表達組各5個(圖5A、表3)。在GSEA富集分析中，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1高表達組主要富集于代謝相關(guān)通路，包括不飽和脂肪酸的代謝，亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、α-亞麻酸代謝和初級膽汁酸合成以及水鹽代謝等通路；而CCNB1低表達組主要富集于生物體生長發(fā)育相關(guān)通路，包括細胞周期、嘧啶代謝、剪接體、蛋白酶體和DNA復(fù)制等通路。

隨后，本研究從單細胞基因組測序方向，利用Tabula Muris數(shù)據(jù)庫進一步分析CCNB1在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。Tabula Muris數(shù)據(jù)庫是一個小鼠細胞信息的開源數(shù)據(jù)庫，收集了20個小鼠器官中分離出100 000多個細胞并進行注釋，可通過利用小鼠的轉(zhuǎn)錄組圖譜發(fā)現(xiàn)新的細胞類型，發(fā)現(xiàn)已知細胞類型中的新的基因表達，以及比較不同器官細胞類型。在此，基于FACS方法的分析表明，CCNB1在小鼠多種組織均有表達，包括膀胱組織、腦組織、骨髓組織、脂肪組織、肺組織、乳腺組織等，且在乳腺組織中表達最高。而基于微流體液滴技術(shù)對膀胱組織中的細胞組成進行分析，并通過細胞本體類進行注釋，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1主要通過影響膀胱組織內(nèi)的膀胱細胞、膀胱尿路上皮細胞、內(nèi)皮細胞和白細胞的生物作用來影響膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展(圖5B)。

A.膀胱癌GSEA富集分析展示前10個富集分析結(jié)果；B.CCNB1在人類不同正常組織單細胞轉(zhuǎn)錄組以及在膀胱癌單細胞轉(zhuǎn)錄組中的表達情況；C.膀胱癌中與CCNB1基因表達相關(guān)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)圖；D.膀胱癌細胞周期信號通路/p53信號通路上的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

最后，為進一步闡明CCNB1在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機制，本研究聯(lián)合miRNACancer數(shù)據(jù)庫、TargetScan Human數(shù)據(jù)庫和ENCORI數(shù)據(jù)庫進一步分析參與調(diào)控CCNB1表達的上游miRNA和其下游信號通路，并構(gòu)建miRNA-mRNA-信號通路的調(diào)控機制網(wǎng)。通過以上數(shù)據(jù)庫聯(lián)合預(yù)測上游miRNA，本研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控CCNB1表達的miRNA有hsa-miR-139-5p、hsa-miR-132-3p和has-miR-181c-5p，取三者交集為hsa-miR-139-5p，進一步分析其下游信號通路，其分析表明，hsa-miR-139-5p負向調(diào)控CCNB1激活P53信號通路和細胞周期通路兩條經(jīng)典癌癥通路，從而影響膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展(圖5C)。隨后，本研究從泛癌角度探究與P53信號通路和細胞周期通路相關(guān)的miRNA、mRNA并構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以進一步分析CCNB1在以上通路中的作用，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1參與以上通路的調(diào)控，并受上游hsa-miR-139-5p調(diào)控(圖5D)，這驗證了本研究先前的分析。

表3 膀胱癌中GSEA富集分析的前10個差異富集的KEGG信號通路

3 討論

細胞分裂失控是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中不可或缺的事件，CCNB1是協(xié)調(diào)正常細胞周期進程的關(guān)鍵分子，在各種人類癌癥類型中異常高表達，CCNB1是一種普遍存在的原癌基因。在ONCOMINE和GEPIA數(shù)據(jù)庫中都證實了這一觀點，這與諸多學(xué)者的觀點基本一致。王璞等[21]發(fā)現(xiàn)CCNB1在口腔鱗癌細胞系中呈高表達，沉默CCNB1基因能夠抑制人口腔鱗癌SCC-15細胞增殖、侵襲和遷移能力，其作用機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān)。張卉等[22]發(fā)現(xiàn)沉默CCNB1的表達，能夠抑制胰腺癌腫瘤細胞的增殖，并發(fā)現(xiàn)這一結(jié)果與P53信號通路被激活有關(guān)。Wendy等[23]通過組織芯片技術(shù)檢測90例I-II期原發(fā)性非小細胞肺癌和支氣管前體病變中CCNB1免疫組化表達，發(fā)現(xiàn)40.9%的非小細胞肺癌CCNB1表達增加。Anna等[24]通過對122例膀胱尿路上皮癌進行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)CCNB1在膀胱尿路上皮癌中高表達，并引起膀胱尿路上皮癌腫瘤細胞的高增殖，其作用機制可能與CCNB1激活p53和Rb通路有關(guān)。Yuan等[25]利用CCNB1 siRNAs降低乳腺癌、宮頸癌、骨肉瘤和前列腺癌腫瘤細胞中CCNB1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)不同來源的腫瘤細胞增殖被抑制50%～80%，凋亡從5%增加到40%～50%。Fang等[26]利用qRT- PCR檢測150例結(jié)直腸癌標本中CCNB1的表達，發(fā)現(xiàn)CCNB1在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，并且發(fā)現(xiàn)CC NB1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。但本研究也發(fā)現(xiàn)在部分癌癥類型中，CCNB1表達為下調(diào)，包括白血病、黑色素瘤，但在ONCOMIN數(shù)據(jù)庫中，這兩種癌癥類型的樣本數(shù)均偏少，或許并不能推翻CCNB1作為原癌基因這一觀點，但CCNB1在這兩種癌癥類型的具體功能需要更多的實驗進行驗證。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)CCNB1在同一癌癥類型所發(fā)揮的功能并不完全相同，比如在膀胱癌，頭頸癌和乳腺癌中，其表達既有上調(diào)也有下調(diào)。本研究考慮這或許與腫瘤亞型有關(guān)，比如乳腺癌根據(jù)ER、PR、HER2和KI67分為管腔上皮A型、管腔上皮B型、HER2過表達型和三陰性型4種分子亞型，其各自的浸潤模式和對靶向藥的敏感性相差甚遠，故本研究認為應(yīng)該關(guān)注到基因與腫瘤亞型的關(guān)系。

CCNB1與多種腫瘤TNM分期有關(guān)，但在各種癌癥類型中所起的作用并不完全相同。Huang等[13]利用qRT- PCR檢測了100 例食管鱗癌組織和 41 例正常食管組織中 CCNB1 的表達水平，發(fā)現(xiàn)CCNB1表達與TNM分期顯著相關(guān)，隨TNM分期增加CCNB1表達水平升高。Fang等[26]利用qRT-PCR檢測了150名結(jié)直腸癌患者的癌組織和鄰近癌旁組織中CCNB1表達水平，發(fā)現(xiàn)CCNB表達水平與晚期TNM分期呈負相關(guān)。然而Wendy等[23]通過組織芯片技術(shù)檢測90例I-II期原發(fā)性非小細胞肺癌和支氣管前體病變中CCNB1免疫組化表達，發(fā)現(xiàn)CCNB1表達與TNM分期無相關(guān)性，而與分化程度有關(guān)。這與本研究在GEPIA數(shù)據(jù)庫中的分析基本一致，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌與TNM分期有相關(guān)性(P<0.001)，且隨著腫瘤分期增加CCNB1表達水平下調(diào)，這與Fang等[26]的研究結(jié)果基本一致。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤中，CCNB1表達與臨床分期無關(guān)，比如子宮內(nèi)膜癌等。那么，CCNB1是如何影響腫瘤TNM分期？在不同的癌癥類型中，其機制也不同。Huang等[13]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)CCNB1能通過促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變促進食管腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，而沉默CCNB1可以抑制食管腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中CCNB1通過降低Sox2ot的表達和間充質(zhì)蛋白N-鈣黏蛋白的表達，同時增加細胞上皮蛋白E-鈣黏蛋白的表達，從而抑制結(jié)直腸癌腫瘤細胞遷移和侵襲。王璞等[21]研究發(fā)現(xiàn)沉默CCNB1基因能夠抑制人口腔鱗癌細胞增殖、侵襲和遷移，其作用機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān)。

CCNB1作為普遍存在的原癌基因，其高表達往往意味著更差的預(yù)后。在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的分析驗證了這一觀點，在多種癌癥類型中，CCNB1高表達均會導(dǎo)致患者預(yù)后更差，且在膀胱尿路上皮癌中，CCNB1表達水平是其預(yù)后的獨立危險因素。CCNB1是如何影響癌癥患者預(yù)后，其具體作用機制尚不清楚，目前認為這可能與CCNB1能夠促進細胞增殖和促進腫瘤組織上皮-間葉轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)有關(guān)[28]，EMT過程能夠明顯增強腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力；可能與CCNB1能夠激活p53信號通路[29]、細胞周期通路和PI3K/Akt 信號通路等癌癥通路有關(guān)。在對CCNB1在膀胱癌中的GSEA富集分析中，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1可能通過影響細胞周期、嘧啶代謝、剪接體、蛋白酶體和DNA復(fù)制等信號通路從而影響膀胱癌的增殖、轉(zhuǎn)移等，進而影響膀胱癌患者的預(yù)后(圖5A)。

腫瘤浸潤淋巴細胞指具有高度異質(zhì)性的淋巴細胞亞群，包括T細胞，少量的B細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等[30]，不同的細胞亞群在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著不同的作用。其包含具有正向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫細胞，如樹突狀細胞、CD8+細胞毒性T淋巴細胞、自然殺傷細胞等[31]，其通過對腫瘤細胞的識別、殺傷和清除，實現(xiàn)腫瘤免疫應(yīng)答，也包含具有負向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫細胞，如腫瘤相關(guān)巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T髄細胞、源性抑制細胞等，其會分泌大量的免疫抑制細胞因子和生長因子，如IL-6、IL-10、VEGF等，抑制上述DC、CD8+細胞毒性T淋巴細胞、自然殺傷細胞的激活，從而使腫瘤細胞逃脫免疫監(jiān)視，最終導(dǎo)致腫瘤形成、侵襲與轉(zhuǎn)移[32]。免疫治療是一種通過增強免疫系統(tǒng)功而達到對抗腫瘤的治療方式，其中免疫細胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，而腫瘤浸潤T淋巴細胞是免疫治療過程中最重要的效應(yīng)細胞類型，主要包括以下亞型：CD8+細胞毒性T淋巴細胞、CD4+T輔助淋巴細胞(Th)、CD45RO+記憶T細胞和FOXP3+調(diào)節(jié)細胞(Tregs)等，其中CD8+T淋巴細胞在抗腫瘤免疫中起核心作用[33]。通過探究CCNB1與腫瘤免疫浸潤細胞的相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB 1表達與5種腫瘤的6種免疫浸潤細胞有顯著相關(guān)，包括B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，且在同一腫瘤的不同免疫浸潤細胞，CCNB1的調(diào)控作用不同，比如在膀胱癌中CCNB1促進CD8+T細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞的浸潤水平，抑制B細胞和CD4+T細胞的浸潤水平。在不同腫瘤間CCNB1所起的調(diào)控作用也不同，在肺腺癌中，CCNB1表達水平抑制B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤水平；而在肝細胞癌中，CCNB1表達水平促進B細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的浸潤水平。進一步分析CCNB1與6種免疫細胞22種亞型的相互作用，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1與多種腫瘤的Act-CD4+T細胞顯著負相關(guān)，而與Mast Acting細胞顯著正相關(guān)，且在膀胱癌中CCNB1與免疫細胞Th2 細胞顯著正相關(guān)。目前研究認為，Th1細胞和Th2細胞都能分泌細胞因子促進自身的增殖并抑制對方的增殖，因此在正常情況下機體中Th1細胞和Th2細胞處于相對平衡的狀態(tài)，當Th1細胞和Th2細胞平衡失衡且Th2 細胞占優(yōu)勢狀態(tài)時，可能會導(dǎo)致腫瘤免疫逃亡[34]。這提示CCNB1可能通過影響膀胱癌中Th1細胞和Th2細胞的平衡性，并使Th2 細胞處于優(yōu)勢狀態(tài)，從而影響患者預(yù)后。以上發(fā)現(xiàn)表明CCNB1可以調(diào)控腫瘤免疫浸潤細胞的浸潤水平，從而影響腫瘤患者的生存狀況。許多學(xué)者的研究證實了以上觀點，Geng等[35]通過對8 600名患者的Meta分析顯示，腫瘤基質(zhì)中高水平CD4+T淋巴細胞浸潤在肺癌患者中表現(xiàn)出更好的預(yù)后。一項涉及4942 名胃癌患者的Meta分析顯示，瘤內(nèi)CD8+和CD3+T細胞的高度浸潤與延長的OS顯著相關(guān)[35]。Chen等[36]對566例食管鱗狀細胞癌患者的研究表明，上皮內(nèi)CD4+T淋巴細胞的浸潤明顯高于腫瘤基質(zhì)區(qū)，上皮CD4+淋巴細胞的浸潤與較長的OS顯著相關(guān)，而CD3+和CD8+T淋巴細胞的浸潤均與食管鱗狀細胞癌患者的預(yù)后無關(guān)。Cai 等[37]發(fā)現(xiàn)肝癌瘤內(nèi)DC的高浸潤度提示較高的DFS，瘤內(nèi)CD45+細胞、CD3+T細胞及CD8+T細胞浸潤均與延長的DFS密切相關(guān)。

膀胱癌是泌尿系腫瘤中最常見的腫瘤，先前的泛癌分析提示CCNB1在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中有著獨特的作用，本研究在UALCAN數(shù)據(jù)庫的分析表明，CCNB1與膀胱癌多種臨床特征均有相關(guān)性，包括疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、吸煙與否和年齡。比較特別的是，基于TCGA數(shù)據(jù)庫408例膀胱癌研究發(fā)現(xiàn)CCNB1在吸煙者中較非吸煙者中表達并無差異，表明吸煙可能并不會影響CCNB1的表達，吸煙是膀胱癌發(fā)生的獨立危險因素，但可能不是影響CCNB1表達和其下游通路來實現(xiàn)的。CCNB1是否能作為膀胱癌新的預(yù)測因子，這是本研究一直很關(guān)注的問題，基于TCGA數(shù)據(jù)庫408例膀胱癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床病理數(shù)據(jù)，經(jīng)由多因素Cox分析，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1是膀胱癌預(yù)后的獨立危險因素，這預(yù)示CCNB1可作為膀胱癌新的預(yù)后因子。另外，淋巴血管侵犯也是膀胱癌預(yù)后的獨立危險因素。

膀胱癌預(yù)后較差，且易復(fù)發(fā)。本研究已證實CCNB1與患者預(yù)后有關(guān)，且為膀胱癌預(yù)后的獨立危險因素。為了進一步探究CCNB1高表達導(dǎo)致膀胱癌患者更差的預(yù)后的作用機制，本研究首先從單細胞轉(zhuǎn)錄測序方向研究CCNB1作用于膀胱組織的細胞群，發(fā)現(xiàn)CCNB1作用的細胞群除了本研究熟知的膀胱細胞和膀胱尿路上皮細胞外，還作用于內(nèi)皮細胞和白細胞，具體機制尚需進一步探究；另外，Tabula Muris數(shù)據(jù)庫是一個小鼠的單細胞數(shù)據(jù)庫，在人類的膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中，其作用機制可能會有所不同。之后本研究探究了調(diào)控CCNB1表達相關(guān)的miRNA和其作用的下游通路，通過miRNACancer數(shù)據(jù)庫[38]、TargetScan Human數(shù)據(jù)庫[39]和ENCORI數(shù)據(jù)庫[40]聯(lián)合預(yù)測最終發(fā)現(xiàn)hsa-miR-139-5p負向調(diào)控CCNB1激活p53信號通路和細胞周期通路兩條癌癥通路，從而影響膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，這與Anna等[24]的研究結(jié)果基本一致，其研究發(fā)現(xiàn)CCNB1激活 p53和Rb通路從而促進膀胱尿路上皮癌腫瘤細胞的高增殖。p53信號通路和細胞周期通路均為經(jīng)典的癌癥通路p53信號通路主要參與抑制細胞周期進程，分化和加速DNA修復(fù)，基因毒性和細胞應(yīng)激后的衰老等生物過程[41]，而細胞周期通路主要參與細胞周期進程、細胞分化、細胞凋亡等生物過程。

綜上所述，CCNB1可影響泛癌預(yù)后，可作為泛癌的預(yù)后生物標志物，并與免疫浸潤相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)可能提供一種基于免疫的抗腫瘤策略。另外，對膀胱癌組織公共數(shù)據(jù)集的分析表明，CCNB1高表達與膀胱癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，且為膀胱癌患者的獨立預(yù)后因素，其可能通過調(diào)控幾種典型的癌癥相關(guān)通路從而影響膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。