王 磊 趙志玲 連 霞 金昌洙

濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，濱州醫(yī)學(xué)院山東省腫瘤免疫治療研究創(chuàng)新團隊 山東 煙臺 264003

免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)含有6個保守的氨基酸序列(S/I/V/LxYxxI/V/L)[1]，可以招募磷酸酶SHP1、SHP2以及SHIP1，進(jìn)而抑制免疫細(xì)胞的活性。因此，細(xì)胞內(nèi)含有ITIM序列的膜蛋白被統(tǒng)稱為免疫抑制受體[2]。

白細(xì)胞免疫球蛋白受體亞家族成員B4(leukocyte immunoglobulin like receptor B4，LILRB4)屬于免疫抑制受體家族成員，其細(xì)胞外包含2個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig domain)，細(xì)胞內(nèi)含有3個ITIMs模體。正常情況下，LILRB4主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、祖肥大細(xì)胞和破骨細(xì)胞[1,3-4]。LILRB4是急性單核細(xì)胞白血病(M4和M5)的表面分子標(biāo)志物，與ApoE結(jié)合后，分泌Arginase和uPar，促進(jìn)白血病細(xì)胞的免疫逃避[5]。LILRB4在非小細(xì)胞肺癌中也有較高水平表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成和腫瘤間質(zhì)化轉(zhuǎn)變[6]。在腫瘤微環(huán)境中，LILRB4表達(dá)于髓系來源的各細(xì)胞表面，抑制T細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃避[7]，因此，LILRB4已經(jīng)成為腫瘤免疫治療理想靶點。lilrb4是靈長類特有的基因，盡管有文獻(xiàn)[1]報道小鼠體內(nèi)的Gp49b是其同源基因，但其表達(dá)模式、結(jié)構(gòu)、功能以及配體與LILRB4均有較大差異，無法完全模擬LILRB4的功能。因此，本研究的主要目的是在小鼠髓系細(xì)胞中條件性表達(dá)人LILRB4，構(gòu)建針對人LILRB4免疫耐受小鼠，對于LILRB4在疾病中的作用及功能研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J小鼠購自上海南方模式生物科技有限公司，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院SPF級動物房，所有動物實驗均已獲得濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(No.2021-22)。Anti-human LILRB4-APC(Cat#17-5139-42，1∶100，Invitrogen)，Isotype-APC(Cat#17-4172-42，1∶400，Invitrogen)，Anti-mouseCD11b-PE(Cat # 301330，1∶200，Biolegend)。瓊脂糖購自Biosharp公司，異氟烷購自深圳瑞沃德生命科技有限公司，小鼠基因型快速鑒定試劑盒購自Transgene公司。

1.2 儀器 小鼠麻醉儀購自深圳瑞沃德生命科技有限公司，C6-Plus 流式細(xì)胞儀購自BD公司，小型高速冷凍離心機購自Eppendorf公司，瓊脂糖電泳儀、PCR儀、凝膠成像儀均購自Bio-Rad公司。

1.3lilrb4基因條件性表達(dá)小鼠的構(gòu)建 應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在rosa26基因位點通過同源重組的方式插入人lilrb4基因編碼序列，序列前含有一個兩側(cè)帶有LoxP序列的轉(zhuǎn)錄終止序列，在Cre重組酶存在的情況下可以識別LoxP序列后將轉(zhuǎn)錄終止序列切除進(jìn)而啟動下游lilrb4的表達(dá)。lilrb4基因條件性表達(dá)小鼠構(gòu)建策略見圖1A。首先通過體外轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA及gRNA序列(GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG)，然后構(gòu)建同源重組載體，該載體含有3′同源臂CAG-LSL-LILRB4-WPRE-polyA5′同源臂，載體圖譜見圖1B。將Cas9 mRNA、gRNA及同源重組載體顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠。PCR及測序鑒定陽性的F0代小鼠，與C57BL/6J小鼠交配獲得陽性F1代小鼠。F1代小鼠進(jìn)行自交獲得純合的小鼠命名為Rose26LSL/LSL，然后與Lyz2-Cre小鼠雜交獲得Rose26LSL/-;Cre。Rose26LSL/-;Cre再進(jìn)行自交獲得髓系細(xì)胞上條件性表達(dá)人LILRB4的小鼠，命名為Rose26LSL/LSL;Cre。

A.小鼠構(gòu)建策略示意圖；B.同源重組載體質(zhì)粒圖譜；C.lilrb4表達(dá)序列PCR引物鑒定策略，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別代表引物P1、P2、P3、P4的位置。

1.5lilrb4基因條件性表達(dá)小鼠的鑒定

1.4 人與小鼠lilrb4基因及蛋白的同源性分析 利用NCBI數(shù)據(jù)庫分別找到人與小鼠lilrb4基因CDS及蛋白質(zhì)氨基酸序列，將得到的序列進(jìn)行對比分析相似性。

以手機學(xué)習(xí)平臺為主的智慧課堂在外語教學(xué)中得到廣泛運用，符合當(dāng)今信息時代發(fā)展的需要。以核心素養(yǎng)培養(yǎng)為目標(biāo)的高職大學(xué)英語教學(xué)新模式主要從教學(xué)內(nèi)容選擇、教學(xué)設(shè)計和教學(xué)評價三方面提出智慧教學(xué)模式設(shè)計思路，并對實施過程進(jìn)行探索。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Prism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5.1 基因型鑒定 根據(jù)表達(dá)序列插入位點設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR擴增目的條帶，lilrb4表達(dá)小鼠基因型鑒定策略見圖1。Lilrb4表達(dá)序列引物序列如下：P1 5′-TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA-3′；P2 5′-TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA-3′；P3 5′-AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG-3′；P4 5′-AGACAGAAGGCAACTGAGCC-3′。Cre表達(dá)序列鑒定引物如下：P5 5′-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3′；P6 5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′；P7 5′-TTACAGTCGGCCAGGCTGAC-3′。反應(yīng)體系如下：模板2 μL，正向引物(10 μM)0.2 μL，反向引物(10 μM)0.2 μL，2×TransDirect Mouse Genotyping SuperMix 10 μL，高壓滅菌水2.6 μL。

2.2 Rose26LSL/LSL;Cre和Rose26LSL/LSL小鼠基因型的鑒定 根據(jù)1.5.1的基因型鑒定策略，lilrb4表達(dá)序列純合子小鼠引物P1/P2不能擴增出片段，P3/P4能夠擴增出408 bp片段。cre陽性小鼠P5/P6可以擴增出700 bp片段，P6/P7擴增出350 bp片段，而cre陰性小鼠只有P6/P7擴增出350 bp片段。PCR結(jié)果顯示，以Rose26LSL/LSL;Cre鼠耳作為模板，lilrb4鑒定組只有引物P3/P4擴增出408 bp目的片段(圖3A)，cre鑒定組P5/P6擴增出700 bp片段，P6/P7擴增出300 bp片段(圖3B)；以Rose26LSL/LSL鼠耳作為模板lilrb4鑒定組只有引物P3/P4擴增出408 bp目的片段(圖3C)，cre鑒定組P5/P6未能擴增出片段，P6/P7擴增出300 bp片段(圖3D)。

2.1 人lilrb4與小鼠Gp49b基因及蛋白同源性分析 人lilrb4基因的編碼序列為1 347個堿基(NM_001278426.4)，編碼448個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(NP_001265355.2)。小鼠Gp49b基因的編碼序列為1 008個堿基(NM_013532.3)，編碼335個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(NP_038560.1)。NCBI數(shù)據(jù)庫比對人lilrb4與小鼠Gp49b基因編碼序列的同源性，結(jié)果表明：在1-411及990-1100基因位點分別有72%的同源性，而412-989未發(fā)現(xiàn)任何同源序列(圖2A)。蛋白比對發(fā)現(xiàn)：在1-373位置上的氨基酸有41%的相似性，而在386-415位點僅有27%的同源性，其余未找到相似序列(圖2B)。以上結(jié)果表明，人lilrb4與小鼠Gp49b基因及蛋白同源性較差，小鼠的Gp49b基因不能完全模擬人lilrb4的功能。

主要實驗儀器：HWCL-3恒溫油浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)，pHS-2型酸度計(上海盛磁儀器有限公司) ，T6紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，S-3000N臺式掃描電子顯微鏡(日本株式會社日立制作所)，VERTEX-33 傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker Optik GMBH公司)。

2 結(jié)果

說出來。在自己情緒消極時，傾訴的對象就有限制了，一定要找一個充滿正能量的人作為傾訴的對象，把自己的失望、氣惱、傷感等說出來。只有把消極的東西說出來，人才有可能裝入積極的東西。說出來，就是從可信賴的朋友或同事那里尋求安慰和幫助，緩解消極情緒。

A.人lilrb4與小鼠Gp49b基因CDS序列比對；B.人LILRB4與小鼠gp49蛋白序列對比。

1.5.2 細(xì)胞水平LILRB4表達(dá)情況檢測 從Rose26LSL/LSL和Rose26LSL/LSL;Cre小鼠的球后靜脈取血，加入紅細(xì)胞裂解液30 min后，PBS洗滌1遍，進(jìn)行抗體染色。分別利用CD11b-PE、Isotype-APC，CD11b-PE、LILRB4-APC組合在髓系細(xì)胞上檢測LILRB4的表達(dá)水平，然后將Rose26LSL/LSL和Rose26LSL/LSL;Cre小鼠麻醉狀態(tài)下處死，分離小鼠骨髓并制備成單細(xì)胞懸液，通過70 μm細(xì)胞濾器進(jìn)行過濾，PBS洗滌重復(fù)上述染色。

A.Rose26LSL/LSL;Cre小鼠lilrb4表達(dá)序列鑒定組中1、3、5泳道為P1/P2引物擴增片段，2、4、6泳道為P3/P4引物擴增片段(408 bp)；B.cre表達(dá)序列鑒定組中 1、3、5泳道為P5/P6引物擴增片段(700 bp)，2、4、6泳道為P6/P7引物擴增片段(350 bp)；C.Rose26LSL/LSL小鼠lilrb4表達(dá)序列鑒定組中1、3、5、7泳道為P1/P2引物擴增片段，2、4、6、8泳道為P3/P4引物擴增片段(408 bp)； D.cre表達(dá)序列鑒定組中1、3、5、7泳道為P5/P6引物擴增片段，2、4、6、8泳道為P6/P7引物擴增片段(350 bp)。M為DNA Ladder。

2.3 髓系細(xì)胞中人LILRB4的表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,在Rose26LSL/LSL;Cre小鼠外周血CD11b陽性的髓系細(xì)胞中檢測到了人LILRB4的表達(dá)，而在Rose26LSL/LSL小鼠中未檢測到人LILRB4的表達(dá)(圖4A)。平均熒光強度統(tǒng)計分析結(jié)果驗證了該結(jié)論(圖4B)。骨髓中染色結(jié)果與外周血一致，僅在Rose26LSL/LSL;Cre的小鼠的骨髓髓系細(xì)胞中檢測到了LILRB4的表達(dá)(圖4C)。

A.外周血CD11b陽性髓系細(xì)胞中LILRB4的流式檢測圖；B.外周血CD11b陽性的髓系細(xì)胞中LILRB4表達(dá)的平均熒光強度統(tǒng)計分析；C.骨髓中CD11b陽性髓系細(xì)胞中LILRB4的流式檢測圖。MFI為平均熒光強度；**P<0.01。

3 討論

LILRBs家族有5個成員，主要表達(dá)于造血系細(xì)胞中，并抑制多種免疫細(xì)胞的激活。由于LILRBs的免疫抑制功能與CTLA4、PD-1等免疫反應(yīng)靶點的功能類似，因此，LILRBs被認(rèn)為是免疫反應(yīng)靶點分子[8]。LILRBs家族中的LILRB4作為M4、M5型急性髓系細(xì)胞白血病的分子標(biāo)志物，通過免疫反應(yīng)靶點作用促進(jìn)腫瘤的免疫逃避，并作為腫瘤支持因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[5]。LILRB4在腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高，這提示，未來應(yīng)用LILRB4的免疫治療效果有望達(dá)到目前已在臨床上應(yīng)用的PD-1抑制劑[9]的水平。

我回到房間，在想這突如其來的來自隔壁的好意，究竟是什么意思，看著那個精致的果盤上擺滿的玲瓏剔透的水果上細(xì)細(xì)的牙簽，我覺得這些牙簽分分鐘都有可能插進(jìn)我的喉嚨，要了我的命。我將果盤中的水果都倒進(jìn)了廚房的垃圾桶里，一個不留。我覺得我做得對，我甚至都不知道她的名字。

小鼠和人類在遺傳和病理生理方面具有相似性。基因工程小鼠模型是研究人類疾病的最佳選擇，特別是Cre-LoxP系統(tǒng)廣泛用于條件性模型構(gòu)建，并以特定的方式研究組織/細(xì)胞(空間控制)或時間(時間控制)的相關(guān)基因[10]。靈長類lilrb4基因在小鼠體內(nèi)的同源基因為Gp49b。有文獻(xiàn)[9,11]報道，利用全身敲除Gp49b的小鼠模型證明lilrb4在實體瘤發(fā)展過程中抑制免疫反應(yīng)以及在病毒感染后可以調(diào)控NK細(xì)胞的功能。雖然都含有2個免疫球蛋白樣胞外域，但LILRB4胞內(nèi)域含3個ITIMs模體，而gp49B僅有2個ITIMs模體，且兩者的同源性較差，gp49B并不能完全模擬LILRB4在體內(nèi)的功能。因此，gp49B全身敲除的小鼠并不是理想的研究LILRB4的模型。目前尚未見報道關(guān)于靈長類LILRB4在小鼠體內(nèi)過表達(dá)的研究。本研究通過構(gòu)建在髓系細(xì)胞條件性表達(dá)靈長類lilrb4基因的小鼠模型，成功解決了小鼠對人LILRB4產(chǎn)生免疫排斥的問題，為未來LILRB4應(yīng)用于腫瘤免疫治療的研究提供了一個較為理想的小鼠模型。