石成龍 汪錫武 李安琪 錢森和，2 王洲，2 趙世光，2 劉艷，2薛正蓮，2

（1. 安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，蕪湖 241000；2. 安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000）

阪崎克羅諾桿菌是一種食源性條件致病菌，為兼性厭氧革蘭陰性氏桿菌，隸屬于腸桿菌科［1］。在嬰幼兒奶粉、肉制品、果蔬等多種食品中常被檢測(cè)到，其中奶粉是該菌的主要感染源［2］?？蓪?dǎo)致危及生命的侵襲性疾病，如嬰兒壞死性小腸結(jié)腸炎、腦膜炎和敗血癥，致死率高達(dá)40%-80%［3］。

食品生產(chǎn)設(shè)備表面和環(huán)境中的阪崎克羅諾桿菌以生物被膜的形式存在［4］。與游離菌相比，生物被膜內(nèi)的細(xì)菌耐受性更強(qiáng)，可保護(hù)病原體免受惡劣環(huán)境的侵害，是食品持續(xù)污染的重要來(lái)源［5］。細(xì)菌生物被膜因其耐受性而難以去除，傳統(tǒng)的消毒程序?qū)ι锉荒げ荒芡耆行?，并可能?dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生。因此，為了提高食品及加工環(huán)境的安全性，需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)無(wú)毒副作用的綠色環(huán)保型抗菌劑。天然抗菌肽具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、消除生物被膜的潛力，且在環(huán)境中容易降解，并且?guī)缀鯚o(wú)毒。是食品保鮮及加工行業(yè)值得注意的一種抗菌劑。植物源抗菌化合物可能作為一種控制污染食品動(dòng)物及其產(chǎn)品的耐抗生素的人畜共患病原體的新手段具有重要價(jià)值。

ε-聚賴氨酸是一種由白色鏈霉菌產(chǎn)生的天然陽(yáng)離子多肽［6］，含有25-35個(gè)氨基酸殘基。具有抗菌活性強(qiáng)、安全性高［7］、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。在120℃下熱處理20 min后，ε-PL的抗菌活性并沒(méi)有受到影響。且You等［8］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠攝入實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)每日攝入ε-PL不會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群的永久性變化，為其安全性提供關(guān)鍵證據(jù)，表明ε-PL對(duì)生物體無(wú)毒無(wú)害，在生物體中能夠直接降解成賴氨酸［7］。ε-PL已被日本、韓國(guó)等國(guó)家的機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)作為食品防腐劑。中國(guó)也于2014批準(zhǔn)ε-PL能夠用于果蔬的保鮮。近年來(lái)，應(yīng)用到食品加工行業(yè)中的抗生素種類以及劑量不斷增加，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題也隨之嚴(yán)重，而ε-PL作為一種無(wú)毒、安全、可生物降解的天然抗菌劑，與傳統(tǒng)抗生素相比，在發(fā)揮抑菌作用的同時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性，目前，已有相關(guān)報(bào)道將ε-PL應(yīng)用于果蔬、肉類等保鮮防腐技術(shù)。如盧緒志等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ε-PL可抑制肉類中微生物的生長(zhǎng)及相關(guān)酶的活力；巴良杰等［10］利用含500 μg/mL ε-PL的保鮮紙貯存果李，結(jié)果表明，ε-PL保鮮紙抑制了果實(shí)的腐爛率、失重率及MDA含量的增加，削弱了果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，保持了果實(shí)良好的感官品質(zhì)。同時(shí)，ε-PL對(duì)單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌等重要食源性致病菌都具有良好的抑菌效果［11］。但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道ε-PL對(duì)乳源性條件致病菌阪崎克羅諾桿菌是否有抑制作用，在本研究中，以阪崎克羅諾桿菌質(zhì)控菌株為供試菌來(lái)研究ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌及其生物被膜的作用機(jī)制，初步探索其對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抗菌機(jī)制，以期為ε-PL在食品加工中的進(jìn)一步應(yīng)用和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 阪崎克羅諾桿菌ATCC51329，為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液 （1）TSB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L，調(diào)pH至7.3±0.2。（2）TSB固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2.0%的瓊脂。（3）TSB半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.5%的瓊脂。所有培養(yǎng)基均121℃，1×105Pa滅菌15 min。（4）磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：KH2PO40.24 g/L，Na2HPO41.44 g/L，NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，調(diào)pH至7.4。

1.1.3 主要試劑與儀器 PI染色試劑盒，生工生物工程股份有限公司；SYTO 9染色試劑盒，賽默飛世爾科技公司；堿性磷酸酶活力測(cè)試試劑盒，南京建成生物工程研究所；ε-PL（純度≥98%），鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；磷酸二氫鉀、葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、結(jié)晶紫，大豆蛋白胨，均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器如下：全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛）、熒光倒置顯微鏡（德國(guó)徠卡）、透射電子顯微鏡（日本日立）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（金壇市杰瑞爾電器有限公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（寧國(guó)沙鷹科學(xué)儀器有限公司）、臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 挑取供試菌單菌落接種于10 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到10 mL新鮮TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4，備用。

1.2.2 ε-聚賴氨酸抗菌活性的測(cè)定

1.2.2.1 ε-PL 對(duì)阪崎克羅諾桿菌的最小抑菌濃度測(cè)定 采用肉湯稀釋法進(jìn)行ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌最小抑菌濃度的測(cè)定，將供試菌菌懸液接種在ε-PL終濃度為 4 096、2 048、1 024、512、256、128、64、32 μg/mL的96孔板中，以不加ε-PL溶液作為對(duì)照組，在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD值。與對(duì)照孔相比，完全抑制被測(cè)菌株可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低抑菌劑濃度被確定為MIC濃度［12］。

1.2.2.2 ε-PL 對(duì)阪崎克羅諾桿菌生長(zhǎng)的測(cè)定 將活化后的菌懸液按1%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL新鮮TSB液體培養(yǎng)基中，并向新鮮TSB液體培養(yǎng)基中分別加入ε-PL溶液，使ε-PL終質(zhì)量濃度為1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC，以不加 ε-PL溶液作為對(duì)照組，每個(gè)濃度重復(fù)3次，37℃恒溫中200 r/min震蕩培養(yǎng)，間隔2 h吸取各體系中200 μL液體，加入96孔板中測(cè)定吸光度。24 h作為一個(gè)周期來(lái)繪制時(shí)間生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 ε-PL 對(duì)阪崎克羅諾桿菌細(xì)胞膜壁結(jié)構(gòu)的影響 將活化的菌液4 000 r/min 離心10 min，收集菌體。使用PBS洗滌3次并重懸。向其中加入ε-PL溶液以形成1×MIC和2×MIC的終濃度，以不加ε-PL溶液作為對(duì)照組。

1.2.3.1 核酸通透性分析 將供試菌液于37℃、180 r/min振蕩器中培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，4 000 r/min離心10 min取上清，測(cè)OD260值。研究ε-PL對(duì)菌體細(xì)胞膜通透性的影響。

1.2.3.2 堿性磷酸酶含量分析 將供試菌液37℃靜置培養(yǎng)0、3、6、9、12 h取樣，使用堿性磷酸酶測(cè)試盒測(cè)定AKP酶活，研究ε-PL對(duì)菌體細(xì)胞壁通透性的影響。

1.2.4 透射電鏡觀察ε-PL 對(duì)阪崎克羅諾桿菌細(xì)胞形態(tài)的影響 阪崎克羅諾桿菌接種至TSB培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL，加ε-PL溶液，使ε-PL終濃度分別為1×MIC、2×MIC，空白對(duì)照組加同體積的培養(yǎng)基，置37℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)6 h。取菌液離心，無(wú)菌PBS洗滌至上清無(wú)色透明為止，棄上清，收集細(xì)菌沉淀。以2.5%的戊二醛溶液固定2-4 h，然后再用1%的磷鎢酸鈉緩沖液混合，用無(wú)菌毛細(xì)吸管吸取混合菌懸液滴在銅網(wǎng)膜上，樣品干燥后，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察ε-PL對(duì)細(xì)菌形態(tài)的影響。

1.2.5 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌表面疏水性的影響 供試菌液制備同1.2.4，將供試菌液37℃靜置培養(yǎng)6 h，將2 mL供試菌液與800 μL二甲苯混勻，震蕩2 min，室溫垂直靜置30 min，測(cè)定下液相的OD600，細(xì)菌表面疏水性計(jì)算公式：

疏水性（%）=［（菌液稀釋后OD600-菌液靜置后下液相的OD600）/菌液稀釋后的OD600］×100%

1.2.6 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌泳動(dòng)性的影響 供試菌液制備同1.2.4，將供試菌液37℃靜置培養(yǎng)6 h，取1 μL供試菌液滴加至半固體瓊脂培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12 h，測(cè)量供試菌泳動(dòng)直徑，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均。

1.2.7 亞抑菌濃度ε-PL 對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成的影響 將活化后的菌懸液按1%接種量加至TSB培養(yǎng)基中。37℃、180 r/min振蕩器中培養(yǎng)，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中期，超凈工作臺(tái)中分裝至玻璃試管中，向其中加入ε-PL溶液以形成1/8×MIC、1/4×MIC的終濃度，以不加ε-PL溶液作為對(duì)照組。37℃、在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次。使用0.1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，33%的冰醋酸進(jìn)行脫色，觀察生物被膜形成情況。

1.2.8 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜清除的影響 將活化后的菌懸液按1%接種量加至TSB培養(yǎng)基的玻璃試管中。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)36 h，倒掉培養(yǎng)基，使用PBS洗滌3次，向其中加入ε-PL溶液以形成1×MIC和2×MIC的終濃度，以不加ε-PL溶液作為對(duì)照組。分別放置在靜置和震蕩環(huán)境中浸泡處理3、9、20 h，結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物被膜清除效率［13］。細(xì)菌生物被膜清除率由公式：

生物被膜清除率（%）=［（清除處理前OD595-清除處理后OD595）/清除處理前OD595］×100%

1.2.9 激光共聚焦顯微觀察生物被膜清除效果 使用無(wú)菌蓋玻片作為生物被膜附著載體，樣品制備同1.2.8，用PBS溶液清洗清除處理后樣品3次后使用30 mmol/L PI和50 mmol/L STYO 9染色液進(jìn)行染色處理，在黑暗條件下染色反應(yīng)15 min，使用倒置熒光顯微鏡觀察，在室溫下評(píng)估細(xì)胞膜通透性［1］。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析 采用OriginPro 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖和數(shù)據(jù)差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌抑菌活性評(píng)價(jià)

通過(guò)比較ε-PL處理前后的吸光度變化及視覺(jué)觀察，對(duì)抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-A所示，隨ε-PL質(zhì)量濃度升高，OD600值逐漸減小，表示ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑菌效果越強(qiáng)。當(dāng)ε-PL的終質(zhì)量濃度為256 μg/mL時(shí)，其OD600值為對(duì)照組OD600值的16.08%，幾乎完全抑制了菌體的生長(zhǎng)，表明ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌ATCC51329的MIC值為256 μg/mL。

測(cè)定阪崎克羅諾桿菌在ε-PL不同濃度作用下浮游菌的OD600，繪制其生長(zhǎng)曲線結(jié)果如圖1-B。對(duì)照組在2-8 h快速生長(zhǎng)，10 h后趨于穩(wěn)定，OD600穩(wěn)定于1.4左右，而ε-PL可抑制阪崎克羅諾桿菌浮游菌株生長(zhǎng)，并且隨著藥物濃度的升高其抑制作用越強(qiáng)，浮游菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制。1/8×MIC、1/4×MIC ε-PL濃度下對(duì)阪崎克羅諾桿菌浮游菌株生長(zhǎng)的影響不顯著，屬于亞抑菌濃度。1/2×MIC ε-PL濃度下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期延緩，終點(diǎn)OD600約為對(duì)照組的70%，菌體生長(zhǎng)受到影響。而ε-PL質(zhì)量濃度大于1×MIC時(shí)，OD600幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)中的菌液也接近澄清，說(shuō)明此時(shí)ε-PL幾乎能夠完全抑制阪崎克羅諾桿菌生長(zhǎng)。

圖1 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑菌評(píng)價(jià)Fig. 1 Bacteriostatic evaluation of ε-PL against C. sakazakii

2.2 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌膜壁特性的影響

2.2.1 胞外核酸分析 細(xì)菌上清液的紫外吸收情況如圖2-A所示。與對(duì)照相比，亞抑菌濃度1/8×MIC、1/4×MIC ε-PL濃度下，紫外吸收未隨時(shí)間改變而升高，核酸泄露量沒(méi)有發(fā)生明顯改變，亞抑菌濃度處理并未引起細(xì)胞膜通透性的改變。與對(duì)照相比，1/2×MIC ε-PL處理1 h后趨于穩(wěn)定，OD260達(dá)到了0.398，較起始增加了33.67%；1×MIC ε-PL處理4 h后趨于穩(wěn)定，OD260達(dá)到了0.772，較起始增加了66.19%；2×MIC ε-PL處理3 h后趨于穩(wěn)定，OD260達(dá)到了0.853，較起始增加了70.22%，實(shí)驗(yàn)組在260 nm波長(zhǎng)處的吸光值均顯著大于對(duì)照組。

2.2.2 胞外堿性磷酸酶分析 暴露于ε-PL下的阪崎克羅諾桿菌AKP濃度變化如圖2-B所示，亞抑菌濃度1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC組AKP濃度并未隨處理時(shí)間變化而明顯增加。在前3 h內(nèi)，1×MIC、2×MIC組中AKP濃度均快速增加。對(duì)照組AKP濃度達(dá)到（0.529±0.187）U/L，1×MIC組和2×MIC組的AKP濃度要高于對(duì)照組，且AKP濃度隨著ε-PL濃度的升高而增大，1×MIC組AKP濃度達(dá)到（2.115±0.187）U/L，2×MIC組AKP濃度達(dá)到（3.173±0.324）U/L。3 h后，1×MIC、2×MIC組中AKP濃度基本維持穩(wěn)定。

圖2 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌膜壁特性的影響Fig. 2 Effect of ε-PL on membrane wall properties of C.sakazakii

2.3 透射電鏡觀察

由圖3可知，對(duì)照組（圖3-A）菌體整體表現(xiàn)為桿狀，菌體細(xì)胞形態(tài)保持完整，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)光滑完整無(wú)破損，細(xì)胞內(nèi)容物充實(shí)致密。經(jīng)1×MIC的ε-PL處理后（圖3-B），菌體出現(xiàn)了明顯的凹陷、孔洞等受損情況，外觀已發(fā)生改變。而經(jīng)2×MIC的ε-PL處理后（圖3-C），菌體細(xì)胞壁與細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，部分細(xì)胞壁膜、細(xì)胞器和細(xì)胞核區(qū)消失，甚至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空化現(xiàn)象，菌體嚴(yán)重變形。

圖3 ε-PL處理后阪崎克羅諾桿菌的透射電鏡圖像（×15.0 k）Fig. 3 Transmission electron microscope image of C. sakazakii after ε-PL treatment（×15.0 k）

2.4 菌體表面疏水性測(cè)定

由圖4可知，經(jīng)ε-PL處理后阪崎克羅諾桿菌表面疏水性明顯下降，且呈ε-PL濃度依賴性。ε-PL處理3 h后，2×MIC組表面疏水性為66.31%，低于相同作用時(shí)間的1×MIC組（69.9%）和CK組（73.8%）；ε-PL作用6 h時(shí)，2×MIC和1×MIC處理組阪崎克羅諾桿菌表面疏水性分別為47.3%和56.6%，而對(duì)照組基本維持不變。

圖4 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of ε-PL on the surface hydrophobicity of C. sakazakii

2.5 泳動(dòng)性測(cè)定

如圖5所示，對(duì)照組阪崎克羅諾桿菌其泳動(dòng)圈直徑為（6.17±0.25）cm，經(jīng)1×MIC和2×MIC濃度的ε-PL處理后，阪崎克羅諾桿菌泳動(dòng)圈直徑分別顯著下降至（4.87±0.12）cm和（3.63±0.21）cm。說(shuō)明ε-PL可以抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)能力，且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

圖5 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌泳動(dòng)性的影響Fig. 5 Effect of ε-PL on the motility of C. sakazakii

2.6 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成的影響

時(shí)間殺滅曲線如圖6所示，阪崎克羅諾桿菌生物被膜的形成可分為：0-24 h黏附期，24-48 h成熟期，48-96 h衰亡期。亞抑菌濃度的ε-PL可以大大減少生物被膜的產(chǎn)生。細(xì)菌生物被膜生長(zhǎng)到36 h時(shí)，對(duì)照組生物被膜生長(zhǎng)達(dá)到成熟期，其OD595達(dá)到了0.917，1/8×MIC濃度下生物被膜生長(zhǎng)量的OD595達(dá)到了0.326，同對(duì)照組相比，抑制率達(dá)到64.45%。1/4×MIC濃度下生物被膜生長(zhǎng)量的OD595達(dá)到了0.183，同對(duì)照組相比，抑制率達(dá)到79.39%。隨著濃度的增加，生物被膜的形成明顯減少。

圖6 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成量的影響Fig. 6 Effect of ε-PL on the amount of C. sakazakii biofilm formation

2.7 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜清除效果分析

由圖7可知，靜置處理時(shí)清除率隨作用時(shí)間的延遲而提高，靜置處理20 h時(shí)，清除率基本達(dá)到穩(wěn)定，1×MIC處理的清除率達(dá)到58.00%，2×MIC處理的清除率達(dá)到63.20%，而聯(lián)合物理振蕩會(huì)縮短清除時(shí)間、提高清除率，振蕩處理3 h時(shí)，清除效果基本穩(wěn)定，清除率不再隨時(shí)間的延長(zhǎng)而大幅提高，1×MIC處理的清除率達(dá)到58.02%，2×MIC浸泡處理的清除率達(dá)到79.74%。

圖7 ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜清除率的影響Fig. 7 Effect of ε-PL on the biofilm clearance of C. sakazakii

2.8 熒光染色法檢驗(yàn)生物被膜清除效果

由圖8知，在ε-PL對(duì)生物被膜的清除不同處理方式中，靜置20 h與振蕩3 h清除效果基本穩(wěn)定，下圖為熒光顯微鏡下ε-PL對(duì)成熟生物被膜清除后剩余被膜菌通透性變化。圖8-A-C為ε-PL靜置處理20 h下對(duì)照組、1×MIC組、2×MIC組，由于處理時(shí)間較長(zhǎng)，生物被膜菌死亡較為嚴(yán)重，熒光以紅色為主，對(duì)成熟生物被膜的清除效果較弱。圖8-D-F為ε-PL振蕩處理3 h下對(duì)照組、1×MIC組、2×MIC組，對(duì)照組中因處理時(shí)間短而存在較多活細(xì)菌，熒光以綠色為主。視野下整體紅色熒光占比隨藥物處理濃度升高而升高，菌密度隨藥物處理濃度升高而降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同2.7結(jié)果相吻合。

圖8 不同處理方式對(duì)生物被膜菌存活的影響（×200）Fig. 8 Effects of different treatment methods on the living of biofilms（×200）

3 討論

目前已有相關(guān)學(xué)者開(kāi)展ε-PL相關(guān)的抑菌機(jī)理研究，鮑佳佳等［14］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ε-PL可抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)和生物被膜的形成，并能清除部分預(yù)形成生物被膜。Shen等［15］比較分析了ε-聚賴氨酸處理和未處理的鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)卷曲淀粉樣纖維和纖維素生成、群體感應(yīng)和鞭毛運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)水平下調(diào)，而與可拉酸合成相關(guān)基因的表達(dá)水平上調(diào)。Ning等［16］考察了溶血素Lysqdvp001與ε-PL對(duì)副溶血性弧菌的協(xié)同抗菌作用。發(fā)現(xiàn)Lysqdvp001和ε-PL協(xié)同誘導(dǎo)副溶血性弧菌細(xì)胞損傷和形態(tài)學(xué)破壞，同時(shí)二者聯(lián)用可去除聚苯乙烯、玻璃和不銹鋼表面約44%-68%的副溶血弧菌生物被膜。陳曉青等［17］研究發(fā)現(xiàn)ε-PL對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，ε-PL濃度升高時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用隨之增強(qiáng)。1/2 MIC的ε-PL能顯著降低金黃色葡萄球菌生物被膜的形成能力。

抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)一直是食品行業(yè)面臨的一大難題。ε-PL已被應(yīng)用于食品抑菌中以減少抗生素的使用。阪崎克羅諾桿菌是重要的乳源性條件致病菌，給乳制品加工行業(yè)帶來(lái)巨大安全隱患，然而ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌的抑菌活性及對(duì)其生物被膜的清除、抑制作用，為ε-PL應(yīng)用于乳制品加工食品安全提供理論基礎(chǔ)。

細(xì)菌細(xì)胞膜壁結(jié)構(gòu)的完整性是保證細(xì)菌正常代謝存活的重要條件之一。若細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到破壞，核酸和蛋白質(zhì)等大分子細(xì)胞內(nèi)容物流出，通過(guò)測(cè)定核酸的釋放情況，可進(jìn)一步分析細(xì)胞膜的通透性［18］。Liu 等［19］在 ε-PL 對(duì)指狀青霉的抑菌機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，ε-PL破壞了細(xì)胞質(zhì)膜的完整性導(dǎo)致內(nèi)容物發(fā)生泄漏，而且ε-PL還可引起膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生丙二醛（malondialdehyde，MDA），造成病原菌細(xì)胞進(jìn)一步損傷。因此，用260 nm處的紫外吸收值測(cè)定核酸從細(xì)胞質(zhì)中泄漏的量，評(píng)估細(xì)胞膜受損程度。堿性磷酸酶（AKP）是一種分布在細(xì)胞膜壁中間的酶，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜壁結(jié)構(gòu)保持完整時(shí)，在細(xì)胞外無(wú)法檢測(cè)到其活性［20］。當(dāng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞后，菌體抗?jié)B透壓能力下降，AKP泄漏出來(lái)［21］。因此，可通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌胞外的AKP活力變化來(lái)觀察其對(duì)細(xì)胞壁的破壞情況。

結(jié)果表明，1/8×MIC、1/4×MIC、1/2×MIC等亞抑菌濃度的ε-PL不會(huì)大幅度改變阪崎克羅諾菌的細(xì)胞膜壁特性，與測(cè)定的時(shí)間殺滅曲線結(jié)果相吻合。而1×MIC、2×MIC等高濃度ε-PL的處理增加了阪崎克羅諾菌的細(xì)胞膜壁的通透性，以至于實(shí)驗(yàn)組外環(huán)境中260 nm波長(zhǎng)處的吸光值顯著升高、AKP活力增加。這是由于ε-PL為陽(yáng)離子型多肽，會(huì)取代細(xì)胞壁表面的陽(yáng)離子，與細(xì)胞膜中的磷脂頭基結(jié)合，引起負(fù)曲率折疊的形成，損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而喪失正常功能［22］。由此可推斷ε-PL發(fā)揮抑菌作用需要一定的閾值濃度，抑菌濃度下可以破壞細(xì)胞膜壁的完整性，加速核酸、AKP等細(xì)胞內(nèi)容物從細(xì)菌胞內(nèi)泄漏。一般認(rèn)為ε-PL對(duì)細(xì)胞膜的作用屬于物理作用，即氈毯模型理論［23］。

利用透射電子顯微鏡觀察ε-PL的處理對(duì)阪崎克羅諾菌的細(xì)胞膜壁損傷的影響，結(jié)果表明，ε-PL的處理會(huì)使阪崎克羅諾菌菌體受損，出現(xiàn)空洞、空化等現(xiàn)象。一般認(rèn)為，ε-PL對(duì)革蘭氏陰性菌的敏感性要高于革蘭氏陽(yáng)性菌，可能和細(xì)胞壁組分有關(guān)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁表面分布著大量的脂多糖，帶有大量負(fù)電荷，而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁表面僅有少量磷壁酸帶有負(fù)電荷，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽(yáng)性菌更容易吸附ε-PL［24］。由于ε-PL在細(xì)胞表面的靜電吸附作用，促使細(xì)胞膜和細(xì)胞壁剝離，內(nèi)容物流出，使細(xì)胞受到生理?yè)p傷，且菌體受損程度與作用濃度有關(guān)。這與Hyldgaard等［25］研究ε-PL對(duì)大腸桿菌的抑菌作用結(jié)果相似。同時(shí)與本文細(xì)胞膜壁通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。

生物被膜是由細(xì)菌自身分泌基質(zhì)聚合物包裹細(xì)菌群形成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它能夠定植在生物和非生物表面［26］。生物被膜的存在給公共衛(wèi)生帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，其原因是細(xì)菌通過(guò)生物被膜的保護(hù)作用，使菌體免受不良環(huán)境的侵害，生物被膜的存在能增強(qiáng)菌體抵抗抗生素等其他外部壓力高度耐受的能力［27］。生物被膜菌對(duì)抗生素等抗菌藥的抑制力是浮游菌的10-1 000倍［28］，而ε-PL作為一種抗生素替代品，可用于抑制和清除細(xì)菌生物被膜的形成，同時(shí)減少食品加工領(lǐng)域的微生物耐藥性的發(fā)生［29］。在生物被膜形成的黏附階段，細(xì)菌需要運(yùn)動(dòng)到介質(zhì)表面并通過(guò)黏附因子相互作用附著在介質(zhì)的表面，從而形成菌落的聚集，為生物被膜的形成提供了基礎(chǔ)平臺(tái)。細(xì)菌的泳動(dòng)性和表面疏水性與細(xì)菌生物被膜生長(zhǎng)密不可分。表面疏水性影響著微生物在含水層中的遷移，表面疏水性越大，微生物的黏附性越大，越易形成生物被膜，越不易遷移。細(xì)菌的泳動(dòng)性有利于細(xì)菌生物被膜的形成以及細(xì)菌在介質(zhì)表面的黏附聚集，細(xì)菌遷移運(yùn)動(dòng)在生物被膜形成過(guò)程中具有極其重要的作用［30］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ε-PL處理后阪崎克羅諾桿菌表面疏水性明顯下降，ε-PL作為陽(yáng)離子型多肽，與菌體細(xì)胞表面陰離子型脂多糖結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性降低，最終起到破壞細(xì)胞壁膜的作用。此結(jié)果與楊昆等［31］的結(jié)果保持一致。同時(shí)證明ε-PL可以抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動(dòng)能力，且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。相關(guān)研究表明，黃芩苷同樣對(duì)阪崎克羅諾桿菌具有抑制效果，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)出黃芩苷可通過(guò)下調(diào)阪崎克羅諾桿菌與運(yùn)動(dòng)有關(guān)基因的表達(dá)［32］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與郭都等［33］的研究結(jié)果保持一致。說(shuō)明ε-PL能夠降低阪崎克羅諾桿菌的表面疏水性，減弱其吸附能力，調(diào)控阪崎克羅諾桿菌的遷移能力，干擾其與運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)。

生物被膜中附著態(tài)細(xì)菌對(duì)于抗生素和宿主免疫系統(tǒng)等環(huán)境壓力的抵抗能力大大增強(qiáng)，生物被膜一旦形成很難清除［34］，所以從根源阻止生物被膜的形成是被膜防控的常用手段。從現(xiàn)實(shí)應(yīng)用角度出發(fā)，采用亞抑菌濃度探究ε-PL對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成的影響，即減少ε-PL的使用劑量，探究在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下其生物被膜形成的抑制率。結(jié)果表明，ε-PL可以在不影響菌體生長(zhǎng)的情況下對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜的形成具有良好的生物被膜抑制活性。推斷亞抑菌濃度ε-PL可能通過(guò)破壞阪崎克羅諾桿菌的種間信息交流，影響阪崎克羅諾桿菌初始黏附，從而對(duì)其生物被膜的形成產(chǎn)生抑制。和Topa等［34］利用亞抑菌濃度的肉桂醛對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)及生物被膜形成的研究結(jié)果保持一致。

SYTO 9可以自由地穿透任何細(xì)胞的細(xì)胞膜，與胞內(nèi)核酸相結(jié)合，并發(fā)出綠色熒光［35］，PI也是一種核酸染料，但是細(xì)胞外PI只有在細(xì)菌細(xì)胞膜受損后才穿透破損細(xì)胞膜，能進(jìn)入細(xì)菌插入到DNA，發(fā)出增強(qiáng)的紅色熒光［36］。可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞膜的破損情況［37］。

熒光染色實(shí)驗(yàn)證明ε-PL可穿透生物被膜，作用于生物被膜內(nèi)的菌體，嚴(yán)重地破壞了阪崎克羅諾桿菌細(xì)胞膜的完整性，且呈濃度依賴性。也為ε-PL作用可有效清除阪崎克羅諾桿菌生物被膜提供了直接證據(jù)。顧玉卿等［38］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)冬凌草甲素納米脂質(zhì)體濃度大于MIC時(shí)，其對(duì)嗜水氣單胞菌生物被膜的形成具有顯著的抑制作用和清除效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)論與本文一致。

目前采用物理手段如超聲處理、紫外線輻射等處理病原菌，均可破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有助于ε-PL在病原菌細(xì)胞膜上的吸收，二者能有效協(xié)同抑制病原菌的生長(zhǎng)［39］。使用ε-PL對(duì)成熟的阪崎克羅諾桿菌生物被膜進(jìn)行浸泡處理，并聯(lián)合物理振蕩，比較處理前后生物被膜量的變化，可以評(píng)估ε-PL對(duì)生物被膜的清除效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ε-PL處理對(duì)阪崎克羅諾桿菌生物被膜清除率隨處理時(shí)間和處理濃度的增加而提高，且結(jié)合物理震蕩能提高清除效率。推測(cè)ε-PL清除生物被膜是通過(guò)空化生物被膜結(jié)構(gòu)、減少被膜菌之間的相互黏連，ε-PL穿過(guò)生物被膜作用于細(xì)菌，減弱細(xì)菌的代謝及相關(guān)產(chǎn)物合成，甚至殺死細(xì)菌，使生物被膜的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)疏松的孔狀，導(dǎo)致生物被膜的脫落［40］。結(jié)合物理振蕩可加速ε-PL穿透生物被膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了生物被膜結(jié)構(gòu)趨向瓦解。Li等［41］研究表明，山蒼籽精油能以濃度依賴的方式破壞副溶血性弧菌的結(jié)構(gòu)，有效地減少胞外多糖的分泌，破壞已形成的生物被膜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本文結(jié)論保持一致。

4 結(jié)論

ε-聚賴氨酸能改變阪崎克羅諾桿菌細(xì)胞膜壁通透性、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制阪崎克羅諾桿菌生長(zhǎng)繁殖。同時(shí)可降低阪崎克羅諾桿菌細(xì)胞表面的疏水性、運(yùn)動(dòng)性，抑制生物被膜的形成，對(duì)成熟生物被膜也具有清除作用，且結(jié)合物理振蕩可提高清除效率。ε-聚賴氨酸具備開(kāi)發(fā)為新型抗菌藥物的潛力，可作為抗生素替代藥物進(jìn)一步深入研究。