劉藝云 鄧?yán)?岳慧穎 岳超 劉健華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642）

抗菌藥物在感染性疾病的治療過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但也給細(xì)菌帶來(lái)選擇性壓力。隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性快速發(fā)展且新耐藥菌不斷出現(xiàn)。據(jù)估計(jì)，全球每年因耐藥菌感染引起的死亡人數(shù)超過(guò)70萬(wàn)，這對(duì)公共衛(wèi)生安全和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［1］，但新藥研發(fā)緩慢，臨床抗感染治療可選擇的抗菌藥物越來(lái)越少，因此急需探索新型抗菌策略對(duì)抗不斷復(fù)雜化的耐藥細(xì)菌感染。

質(zhì)粒等可移動(dòng)元件介導(dǎo)的耐藥基因（antimicrobial resistance genes，ARGs）水平傳播被認(rèn)為是導(dǎo)致耐藥性發(fā)展如此迅速的重要原因［2-3］。接合是質(zhì)粒在不同細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移ARGs的主要方式，抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移將有助于控制耐藥基因的傳播，因此接合轉(zhuǎn)移抑制劑被認(rèn)為是耐藥性防控的有效策略之一，為解決耐藥性問(wèn)題提供了新思路，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注［4-5］。本文將在概述質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移過(guò)程及其機(jī)制的基礎(chǔ)上，對(duì)目前已報(bào)道的接合抑制劑展開(kāi)綜述。

1 耐藥基因傳播方式

細(xì)菌耐藥性具有可遺傳性和可傳播性，即ARGs可通過(guò)垂直克隆和水平基因轉(zhuǎn)移兩種方式進(jìn)行傳播。垂直基因轉(zhuǎn)移（vertical gene transfer，VGT）是指細(xì)菌通過(guò)增殖分裂將其基因從親代傳遞給子代［6］。水平基因傳播（horizontal gene transfer，HGT）是指基因借助可移動(dòng)遺傳元件（mobile genetic elements，MGEs）在同一種屬細(xì)菌甚至不同種屬細(xì)菌間傳播，細(xì)菌之間的HGT主要有3種方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合［7］。MGEs包括質(zhì)粒、插入序列、轉(zhuǎn)座子和整合子等，其中質(zhì)粒可在不同菌種/菌株中進(jìn)行自我復(fù)制，且具有接合轉(zhuǎn)移的功能，這些特性使質(zhì)粒成為ARGs傳播的完美載體［3,8］。

現(xiàn)有研究表明，臨床上常見(jiàn)的重要耐藥基因，如碳青霉烯酶耐藥基因（blaNDM和blaKPC等）、超廣 譜 β 內(nèi) 酰 胺 酶（expanded-spectrum β-lactamase，ESBL）基因、黏菌素耐藥基因mcr-1和替加環(huán)素耐藥基因（tet（X4）和tmexCD1-toprJ1等）常位于質(zhì)粒上，攜帶耐藥基因的質(zhì)粒通過(guò)接合在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致ARGs在全球廣泛傳播和擴(kuò)散［7-8］。此外，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移會(huì)誘發(fā)細(xì)菌基因調(diào)控，進(jìn)而將質(zhì)粒上的ARGs整合到細(xì)菌染色體基因組上，從而有效避免質(zhì)粒不相容性對(duì)ARGs水平轉(zhuǎn)移的抑制作用，加速了多重耐藥菌的出現(xiàn)［9-11］。攜帶ARGs質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性迅速發(fā)展和越來(lái)越復(fù)雜的重要原因。

2 質(zhì)粒的接合過(guò)程和機(jī)制

接合又稱接合轉(zhuǎn)移，是指質(zhì)?；蛘辖雍闲栽墓w細(xì)菌轉(zhuǎn)移至受體細(xì)菌的過(guò)程。

2.1 參與質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的重要元件

質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移過(guò)程非常復(fù)雜，需要許多基因產(chǎn)物的參與，主要包括轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（transfer，tra）和轉(zhuǎn)移復(fù)制起始點(diǎn)（origin of transfer，oriT）（圖1-A）［12］。根據(jù)功能的不同，轉(zhuǎn)移相關(guān)基因tra可分為兩種組分：接合配對(duì)形成系統(tǒng)Mpf（mating pair formation，Mpf）和DNA 轉(zhuǎn)移和復(fù)制系統(tǒng)Dtr（DNA transfer and replication，Dtr）。根據(jù)水平轉(zhuǎn)移的能力和特性，質(zhì)?？煞譃樽灾鬓D(zhuǎn)移型質(zhì)粒（又稱接合型質(zhì)粒conjugative plasmid）、可移動(dòng)型質(zhì)粒（mobilizable plasmid）和非接合型質(zhì)粒（non-conjugative plasmid）。其中，接合型質(zhì)粒一般能夠編碼接合轉(zhuǎn)移所需的所有蛋白，實(shí)現(xiàn)自身在細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移（圖1-B）；可移動(dòng)質(zhì)粒只含有Dtr組分，需借助共棲接合型質(zhì)粒的Mpf系統(tǒng)所編碼的通道進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移（圖1-B）；非接合型質(zhì)粒無(wú)法進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，但可通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式進(jìn)行傳播和擴(kuò)散［7,12］。

圖1 可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒遺傳結(jié)構(gòu)示意圖（修改自文獻(xiàn)［12］）Fig. 1 Schematic diagram of the genetic constitution of transmissible plasmids（Modified based on the reference［12］）

Mpf系統(tǒng)又稱為接合系統(tǒng)，其編碼的蛋白組裝成復(fù)合跨膜蛋白和菌毛，建立細(xì)菌間蛋白質(zhì)和DNA轉(zhuǎn)移的通道（圖1-A和圖2）。根據(jù)蛋白同源性和功能相似性，Mpf系統(tǒng)分為8種類別，其中4種來(lái)自變形桿菌門并參與細(xì)菌DNA接合轉(zhuǎn)移，包括MPFT（根癌農(nóng)桿菌pTi質(zhì)粒virB系統(tǒng)所編碼）、MPFF（IncF型質(zhì)粒編碼）、MPFI（IncI型質(zhì)粒編碼）和 MPFG（以流感嗜血桿菌ICEHin1056為原型的整合接合性元件 integrative and conjugative elements, ICE）［13-14］。接合系統(tǒng)常被混淆為Ⅳ型分泌系統(tǒng)（type Ⅳ secretion system, T4SS），但實(shí)際上T4SS系統(tǒng)范疇更廣，包括3類系統(tǒng)，即效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、DNA攝取分泌系統(tǒng)和DNA接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，因此質(zhì)粒的DNA接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Mpf系統(tǒng)）只是T4SS的一種亞型［15-16］。下文將DNA接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Mpf系統(tǒng)）簡(jiǎn)稱為T4SS系統(tǒng)。值得注意的是，雖然不同T4SS系統(tǒng)中的基因/蛋白名稱不同，但其所編碼的大多數(shù)蛋白功能相似、結(jié)構(gòu)高度同源，如IncF型質(zhì)粒編碼的TraBF、TraVF和 TraKF蛋白分別與pTi質(zhì)粒編碼的VirB10、VirB9和VirB7蛋白高度同源［14］。以VirB所編碼的T4SS系統(tǒng)為例（圖2），該系統(tǒng)是由VirB1-11蛋白組成的跨膜蛋白高分子復(fù)合體，根據(jù)蛋白位置和功能將其分為3個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域：性菌毛（pilus）、通道底部（channel bottom）和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道（transmembrane transport channel）（圖2）。其中，菌毛由多個(gè)VirB2和小部分VirB5蛋白螺旋組裝而成；通道底部由六聚體ATP酶（VirB4和VirB11蛋白）組成，為菌毛的發(fā)生和底物運(yùn)輸提供能量；其余VirB蛋白組成跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道［17-18］。另外，還有偶聯(lián)蛋白（type Ⅳcoupling protein, T4CP），如VirD4，結(jié)合在T4SS轉(zhuǎn)運(yùn)通道內(nèi)膜上，可特異性識(shí)別松弛酶和松弛體蛋白等，且為底物運(yùn)輸提供能量［17］。

圖2 接合轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)模型和接合抑制劑的潛在靶點(diǎn)（修改自文獻(xiàn)［17］）Fig. 2 Structure of conjugation and the potential targets of conjugation inhibitors（Modified based on the reference［17］）

Dtr系統(tǒng)是接合型質(zhì)粒準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA的功能性組分，該組分系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)移起始區(qū)（oriT）、松弛酶（relaxase）、松弛體（relaxosome）和多種輔助因子［19］。oriT位點(diǎn)是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)，也是質(zhì)粒轉(zhuǎn)移后DNA末端重新環(huán)化的位點(diǎn)。松弛酶是Dtr系統(tǒng)的一個(gè)核心組成部分，是一種特殊的DNA內(nèi)切核酸酶［20］。松弛體由許多種蛋白組成（如IncF質(zhì)粒所編碼的TraY、TraM、TraI蛋白和宿主編碼的IHF蛋白），在幫助松弛酶與oriT結(jié)合中扮演著重要角色［20-21］。Dtr各組分的功能，將在下文質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移過(guò)程中進(jìn)行概述，在此不做贅述。

2.2 接合過(guò)程及其機(jī)制

質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移主要由松弛酶、偶聯(lián)蛋白以及接合轉(zhuǎn)移T4SS系統(tǒng)共同調(diào)控，是一個(gè)多步驟的過(guò)程。由于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在一定差異，質(zhì)粒在這兩種細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移過(guò)程略有不同，下面以IncF質(zhì)粒在革蘭陰性菌接合轉(zhuǎn)移為例進(jìn)行介紹。

首先，供體菌的性菌毛游離端與受體細(xì)菌接觸，細(xì)菌之間通過(guò)性菌毛和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道形成接合通道。隨后菌毛與受體菌接觸的信息傳遞給偶聯(lián)蛋白，激活松弛酶。被激活的松弛酶在松弛體協(xié)助下，特異性識(shí)別質(zhì)粒上oriT序列的nic位點(diǎn)并切開(kāi)磷酸二酯鍵，致使質(zhì)粒變成一條被切割的線狀單鏈DNA（T鏈）和一條未被切割的環(huán)化單鏈DNA。前者通過(guò)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)（松弛酶將T鏈5'端的脫氧核苷酸鍵轉(zhuǎn)移至自身的酪氨酸上）與松弛酶共價(jià)鏈接，形成蛋白-DNA復(fù)合物（圖2）；后者在供體菌細(xì)胞中通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成第二條DNA鏈，形成一個(gè)完整的質(zhì)粒。單鏈質(zhì)粒DNA與松弛酶形成蛋白-DNA復(fù)合物后，偶聯(lián)蛋白通過(guò)特異性識(shí)別松弛酶和松弛體以結(jié)合或募集蛋白-DNA復(fù)合物，隨后該復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)至跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道上，轉(zhuǎn)運(yùn)到受體菌中（圖1-C和圖2）。研究者將T鏈轉(zhuǎn)移至受體菌的過(guò)程比喻為“拍即送模型”［22］：松弛酶充當(dāng)T鏈（線狀單鏈DNA）的先導(dǎo)蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)通道從供體菌中被泵到受體菌中，T鏈搭著松弛酶的“便車”發(fā)生了轉(zhuǎn)移。T鏈到達(dá)受體菌后，松弛酶將nic位點(diǎn)識(shí)別為終止位點(diǎn)并進(jìn)行反向切口反應(yīng)，分解共價(jià)蛋白-DNA復(fù)合物，T鏈再環(huán)化并通過(guò)滾環(huán)復(fù)制合成第二條DNA鏈，在受體細(xì)菌中形成一個(gè)完整的質(zhì)粒［23-24］。

3 接合抑制劑

接合抑制劑是一類靶向抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的物質(zhì)，可降低質(zhì)粒及其所攜帶耐藥基因在不同細(xì)菌間的傳播能力，對(duì)耐藥性防控具有重要的意義。目前已報(bào)道的接合抑制劑主要有天然產(chǎn)物、小分子化合物和納米材料等，其中天然產(chǎn)物包括脂肪酸類化合物和磷酸化多糖類抗生素。下面按照化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和屬性（表1），對(duì)各類接合抑制劑分別進(jìn)行介紹。

參References獻(xiàn)文考［25］［27］［29］［30］［36］［37］［33］［40］［41］［44］［48］49］［51］［53］［58］［59］［60］［24］［62］倍素＊［倍2 d： 7.2-10.7： 350倍倍倍： IncI，）倍霉用A-B ： 98數(shù)id 00倍eO 倍質(zhì)Fold reduction in plasm（6-25黃作 倍 ＊倍）倍pared to control）倍s ： 40 μg/L A ： IncW，的制 ： 2 2-HD倍倍：98 NP降MoS2 ： 1 ppm抑TZ）： 90 PL 64有下IncH）2-H 52倍率倍（140 μmol/L）DA mol/L）（100 2 ： 10）C倍IncX 2-BP mol/L）uO 982300 10 ： 4： 100具）C5 0NP ol/L 倍s ： 410 m頻0.1 g）@倍 （P和和倍合ol/L 55 μg/L ol/L.4 m和transfer frequency加移： 50-70添轉(zhuǎn)mm ol/L接0中合in）： 1 000 Fe2+： 9 R-07 ol/L 4.E7： 20 mm 8-16 Fe2O3（00 CA mm mol/L F scFv-P）C 9 kv（ ）（0 8：100 DH粒和mol/L）料接（0IncFmm/M 0.5 m（1IncL.4 m50μm.3 m50 BA 00 10mm 50飼 對(duì) （1（510（1NP 20數(shù)cy due to inhibitor com倍的耐Antimicrobial resistance genes 降M-1，（0頻transfer frequen blaTE M-1，blaTE下率轉(zhuǎn)移id），tI1 p合-II X-M-15，blaCT-II， 接X(jué)-M-14，am因粒-2基hibitor s 3） 質(zhì)tet，3） 致藥TX blaCT -M C），tet（W blaC），str，tet（c（aatet（c（C），tet（Win aa 導(dǎo)劑reduction in plasm in ） 制fold抑類）c,合分cNIn IncF接的，劑ju gation-1組）a（IncI，移n of con 101（II）a（IncFI，IncI，）b（IncN，6（照制cH IncN R1對(duì)抑a, pKM InIncH）b-Iγ，和于IncF和比相on original article data（IncWIncX轉(zhuǎn)））c和，IncX，）IncP））orizatio（R388（IncW），IncI1合M101（IncN）IncP M101（IncN）IncP IncP M101（IncN）IncP粒Plasmids）值1 接IncP和R388（IncW）4（數(shù)IncL ateg 4（IncL 4（IncP RP 4-7（IncF的4（（IncW/M）c pK 4（IB質(zhì)pK pK RP RP RP RP IncF R388（IncW）RP 一統(tǒng)表Table 1 C出換ly in this article based（IncF，/M算 文本菌氏菌，門沙據(jù)菌、 胞菌菌 菌菌菌 菌 菌 菌菌菌 單菌菌 菌 菌 菌菌菌數(shù)桿桿桿球球桿氏 桿 桿桿桿 假桿桿 桿 桿 桿桿桿始verted uniform腸 腸 腸腸腸腸 門 腸 腸腸腸 臭腸腸 腸 腸 腸腸腸原大 大 大糞糞大沙 大 大大大 惡大大 大 大 大大大的→→→→→→ → → →→→ →→→ → → →→→章文屬Species 菌菌菌 菌菌菌 菌 菌 菌菌菌 菌菌菌 菌 菌 菌菌菌桿 桿 桿 桿球桿 桿 桿 桿桿桿 桿桿桿 桿 桿 桿桿桿據(jù)腸 腸 腸 腸腸腸 腸 腸 腸腸腸 腸腸腸 腸 腸 腸腸腸根act ;d： values con：菌 大 大 大 大糞大 大 大 大大大 大大大 大 大 大大大；d烯 ） 響戊影B AD氫-H R-07 nano-T和e2O3有iO2，脫沒(méi)aic acids A（2）3，P）/2 e2+素：素油A）酸酸（2-B NP 85nano-F onents 霉霉料BA；c 39肪酸5u2+黃黃l2O3，和亞HC脂材MoS2 u2+，F(xiàn)米（P 體 酸 弱oderate impact; c： no imp酸（D基/軟）脂鹽）KSK8抗硝R-072，Ps / C微-0分Comp油酸2-炔Tanzaw 105055，2 2-溴nano-A外內(nèi)24 nano-SiO2 Fe2O3@CeO2 納 體子酸Fv-，C 亞 果體體BA UM C10，CuO N離NO3膦鏈由效組等雙單自：act; b： m（ （衍抗類；b其類肼 物著顯別Categories 及 糖 酰物 合類多基生 化料 體 果ignificant imp酸化楊衍 類材 子 效：肪物 酸素 水其 肽米 離 他類 脂生 磷生 亞及 擬納 等 其 注Note： a： S：a

3.1 脂肪酸類及其衍生物

脂肪酸類化合物接合抑制劑是一類來(lái)源于海洋微生物和植物的提取物，最初是基于高通量接合篩選體系（high-throughput conjugation，HTC）得到，并經(jīng)接合試驗(yàn)證實(shí)該類化合物能夠抑制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移［25］。Fernandez-Lopez等［25］研究者構(gòu)建含有熒光標(biāo)記的重組質(zhì)粒R388+lux（R388質(zhì)粒lac啟動(dòng)子下游插入lux報(bào)告基因），該質(zhì)粒在供體菌（含有l(wèi)acI抑制子）中不發(fā)光，只有R388+lux轉(zhuǎn)移到受體菌中（接合轉(zhuǎn)移發(fā)生）才發(fā)光，從而設(shè)計(jì)出高通量的HTC?；贖TC，研究人員篩選了植物提取物的化合物庫(kù)，發(fā)現(xiàn)C18不飽和脂肪酸，如油酸（oleic acids）、亞油酸（linoleic acids）和脫氫戊烯酸（dehydrocrepenynic acid，DHCA），對(duì)R388質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，且該類化合物還能降低IncF型 R1質(zhì)粒和IncP 型RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移效率。其中，亞油酸和DHCA對(duì)R388質(zhì)粒的抑制效果最明顯，800 μmol/L亞油酸和140 μmol/L的DHCA導(dǎo)致R388質(zhì)粒的接合頻率分別下降了200倍和 350 倍［25］。Li等［26］也發(fā)現(xiàn) 3 mmol/L 亞油酸可導(dǎo)致IncX4型mcr-1陽(yáng)性質(zhì)粒的接合頻率下降100倍。Lopatkin等［11］進(jìn)一步證實(shí)了亞油酸可降低質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)0.35 μmol/L亞油酸即可抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，從而降低質(zhì)粒在菌群中的入侵和穩(wěn)定持留。另外，Getino等［27］以抑制活性最強(qiáng)的、具有2-炔基脂肪酸（2-alkynoic fatty acids，2-AFAs）骨架的DHCA為母核結(jié)構(gòu)（圖3），經(jīng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到抑制活性更強(qiáng)的化合物，如2-棕櫚酸（2-hexadecynoic acid，2-HDA）和 2-硬脂酸（2-octadecynoic acid）。其中，2-HAD是具有一條16個(gè)碳原子鏈長(zhǎng)的2-烷基非飽和脂肪酸（圖3），對(duì)質(zhì)粒R388在不同菌種，如大腸桿菌、沙門菌、惡臭假單胞菌和根癌農(nóng)根菌間的接合轉(zhuǎn)移均有抑制作用。除此之外，2-HAD也能夠抑制多種質(zhì)粒在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移，如0.4 mmol/L的2-HAD導(dǎo)致IncF、IncW和 IncH質(zhì)粒的接合頻率下降100倍，較高濃度的2-HAD（1 mmol/L）導(dǎo)致IncI、IncL/M和 IncX的接合頻率下降6-25倍，但對(duì)IncN和IncP質(zhì)粒無(wú)影響。2-HAD在體內(nèi)也顯示出較好的抑制活性，當(dāng)2-HAD（1.6 μg/mg）添加在魚飼料或注入小鼠腸道內(nèi)（100 μg）時(shí)，魚和小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌間的耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效率分別降低了10倍和50倍［28］。由于2-HAD對(duì)某些細(xì)菌和細(xì)胞有毒性，其成藥性存在問(wèn)題，研究者從海洋微生物中篩選出細(xì)胞毒性較小的tanzawaic acids類化 合 物， 如 tanzawaic acids A 和 B（ 圖 3）［29］。0.4 mmol/L的tanzawaic acids B可導(dǎo)致IncF、IncW 的接合頻率下降100倍，IncFI、IncI、IncL/M、IncX 和IncH的接合頻率下降了2-10倍，同樣對(duì)IncN和IncP 質(zhì)粒無(wú)影響［29］。

圖3 脂肪酸類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Chemical structure of fatty acid compounds

上述的脂肪酸均屬于非飽和脂肪酸，不飽和雙鍵或三鍵曾被認(rèn)為是此類化合物發(fā)揮抑制活性的必須結(jié)構(gòu)。García-Cazorla等［30］研究發(fā)現(xiàn)某些飽和脂肪酸，如2-溴軟脂酸（2-bromopalmitic acid）（圖3）具有類似的功能，100 μmol/L的2-溴軟脂酸導(dǎo)致質(zhì)粒R388的接合效率降低到對(duì)照組的2%左右。盡管上述脂肪酸類化合物結(jié)構(gòu)各異，但均能夠抑制VirB11及其同源蛋白（如質(zhì)粒R388編碼的TrwD蛋白）ATPase活性（圖2-C）［27,29-30］，由此推測(cè)脂肪酸可能是通過(guò)與相關(guān)ATPase互作，從而發(fā)揮抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的功能。

3.2 磷酸化多糖類抗生素

黃霉素（flavomycin）是一種動(dòng)物專用的磷酸多糖類抗生素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有1個(gè)3-磷酸甘油酸單元、4-5個(gè)糖基和1個(gè)特殊的異戊烯基脂肪鏈（圖4），可通過(guò)干擾細(xì)胞壁肽聚糖的合成從而抑制細(xì)菌的繁殖，對(duì)革蘭陽(yáng)性桿菌具有良好的抑菌效果。由于該類抗生素?zé)o法穿透革蘭陰性菌的外膜，導(dǎo)致對(duì)革蘭陰性桿菌沒(méi)有殺菌效果。相較于黃霉素的抗菌特點(diǎn)，其作為飼料添加劑提高飼料利用率、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的作用更受關(guān)注。但由于藥物殘留、細(xì)菌耐藥性和環(huán)境污染等原因，自2020年1月起，我國(guó)全面禁止使用除中草藥外的所有藥物作為促生長(zhǎng)劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中［31］，這極大限制了黃霉素的應(yīng)用。值得注意的是，陸續(xù)有文章報(bào)道黃霉素作為飼料添加劑降低了動(dòng)物排泄物中耐藥菌的數(shù)量［32-34］，且能夠抑制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移［32,35］。

圖4 黃霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Chemical structure of flavomycin

Riedl等［36］研究者通過(guò)體外接合試驗(yàn)的方法，研究黃霉素對(duì)攜帶萬(wàn)古霉素耐藥基因vanA質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)黃霉素（8-16 mg/L）可降低萬(wàn)古霉素耐藥質(zhì)粒在糞腸球菌的接合轉(zhuǎn)移頻率（降低50-70倍）。隨后，Bogaard等［32］發(fā)現(xiàn)黃霉素可降低多重耐藥大腸桿菌在豬腸道中的數(shù)量，但該報(bào)道未評(píng)估黃霉素對(duì)耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率的影響。后來(lái)，Poole等［35］發(fā)現(xiàn)黃霉素顯著降低了質(zhì)粒在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移頻率，并發(fā)現(xiàn)增加黃霉素的預(yù)處理時(shí)間可更有效抑制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。Kudo等［37］研究者也發(fā)現(xiàn)黃霉素（2 mg/L）可降低產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移頻率（1.4-3.0倍），并再次證實(shí)該藥物（0.5 μg/L）可降低攜帶vanA基因的質(zhì)粒在糞腸球菌的接合轉(zhuǎn)移頻率（7.2-10.7倍）。最近的研究表明，黃霉素在體內(nèi)對(duì)細(xì)菌間質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移具有較好的抑制作用，當(dāng)黃霉素64 ppm添加到雞飼料或250-500 g/t添加到豬飼料時(shí)，肉雞泄殖腔的耐藥沙門菌和保育豬糞便中四環(huán)素耐藥大腸桿菌都顯著性降低［33-34］。

顯然，上述研究均表明黃霉素具備成為有效接合抑制劑的潛力，為拓展該藥在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供了新角度。已有的研究尚未系統(tǒng)比較和評(píng)估該藥物對(duì)不同耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的抑制效果，其抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制也還有待于進(jìn)一步研究。

3.3 亞水楊基酰肼類及其衍生物

亞水楊基酰肼類衍生物接合抑制劑是一類蛋白變構(gòu)抑制劑，是通過(guò)細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)高通量篩選得到的T4SS抑制劑［38］，該類化合物的母體結(jié)構(gòu)是從假結(jié)核耶爾森氏菌中獲得［39］。在革蘭氏陰性菌中，VirB8蛋白以二聚體的形式參與構(gòu)建T4SS系統(tǒng)的高分子蛋白復(fù)合體，而亞水楊基酰肼類化合物可與VirB8蛋白結(jié)合，引起蛋白構(gòu)象變化且干擾蛋白相互作用，阻止VirB8蛋白二聚化，從而抑制T4SS活性［38］。Paschos等［40］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該類化合物可結(jié)合IncN型質(zhì)粒 pKM101編碼的TraE蛋白（VirB8的同源蛋白），導(dǎo)致質(zhì)粒pKM101接合轉(zhuǎn)移效率下降。在D8I-2化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上優(yōu)化得到的多種化合物（B8I-16、BAR-072、BAR-073 和 UM-024）可顯著降低質(zhì)粒pKM101接合轉(zhuǎn)移，如BAR-072（50 μmol/L）導(dǎo)致質(zhì)粒pKM101接合轉(zhuǎn)移頻率下降了10倍，但是該類化合物對(duì)IncP 型RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移無(wú)影響［40］。

在水楊基酰肼類基礎(chǔ)上，Casu等［41］經(jīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了芳基羧酸類化合物（如小分子化合物239852和105055），該類化合物可有效抑制接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的活性。化合物239852的結(jié)構(gòu)由2-呋喃羧酸和2-氯異煙酸組成，化合物105055具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖5），它們都能夠有效結(jié)合TraE蛋白，抑制TraE蛋白二聚體生成（圖2），其與TraE 的平衡解離常數(shù)分別為19.6 μmol/L和9.3 μmol/L，對(duì)質(zhì)粒pKM101在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)出明顯抑制效果?；衔?39852和105055（50 μmol/L）聯(lián)用可導(dǎo)致質(zhì)粒pKM101的接合效率降低到對(duì)照組的45%左右，這兩個(gè)化合物與上述化合物BAR-072（50 μmol/L）聯(lián)用對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的抑制效果更明顯，導(dǎo)致質(zhì)粒pKM101的接合效率降低到對(duì)照組的5%左右。但化合物239852和化合物105055對(duì)IncP型質(zhì)粒RP4的接合轉(zhuǎn)移仍沒(méi)有影響［41］。盡管不同質(zhì)粒所編碼的接合系統(tǒng)的組成蛋白具有高度同源性，但結(jié)構(gòu)上仍存在差異，這可能是亞水楊基酰肼類及其衍生物對(duì)不同類型質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)出不同影響效果的原因。

圖5 亞水楊基酰肼類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 5 Chemical structure of salicylidene acylhydrazide compounds

3.4 擬肽類化合物

擬肽類化合物接合抑制劑是研究者從化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到的T4SS抑制劑，該類化合物具有稠合2-吡啶酮的基本結(jié)構(gòu)骨架（圖6）。在T4SS的菌毛裝配過(guò)程中，分子伴侶-引領(lǐng)蛋白通路（chaperone usher pathway，CUP）調(diào)控菌毛蛋白的組裝，而稠合2-吡啶酮能夠干擾 CUP 活性［42-43］。Shaffer等［44］發(fā)現(xiàn)擬肽類化合物，如化合物C10和KSK85，不僅能夠抑制幽門螺旋桿菌T4SS所介導(dǎo)效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，兩者也能抑制質(zhì)粒在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移?；衔顲10和KSK85（150 μmol/L）都可導(dǎo)致質(zhì)粒pKM101的接合效率降低到對(duì)照組的25%左右，并分別導(dǎo)致IncF型質(zhì)粒R1-16的接合效率降低到對(duì)照組的50%和90%左右［44］。值得注意的是，化合物C10和KSK85僅在2-吡啶酮的萘取代基上相差一個(gè)甲氧基（圖6），但KSK85能夠阻礙T4SS相關(guān)菌毛結(jié)構(gòu)的組裝（圖2），而C10對(duì)菌毛的結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著影響。推測(cè)KSK85可能通過(guò)影響菌毛結(jié)構(gòu)完整性，從而降低質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，而C10可能通過(guò)其他方式發(fā)揮作用。

圖6 擬肽類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 6 Chemical structure of peptidomimetic compounds

3.5 納米材料

納米材料（nanoparticles，NPs）的基本組成單元是納米微粒，納米微粒尺寸（1-100 nm之間）介于原子簇和宏觀物體之間，具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)的基本特性。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米抗菌材料在抗細(xì)菌感染治療方面也展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，如多種金屬及金屬氧化物納米粒子通過(guò)破壞細(xì)菌蛋白質(zhì)和DNA、提高活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量和破壞細(xì)胞膜完整性等機(jī)制發(fā)揮抗菌作用［45-46］。納米材料也能夠影響質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的效率，最初研究者發(fā)現(xiàn)多種納米材料（Nano-Al2O3、Nano-TiO2、Nano-SiO2和 Nano-Fe2O3）對(duì)質(zhì)粒RP4、RK2［47］和 pCF10的接合轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，使質(zhì)粒接合頻率提高了近100倍，可能與此類納米材料（5-50 mmol/L）可提高細(xì)菌內(nèi)活性氧的含量和應(yīng)急反應(yīng)（SOS）有關(guān)［48］。隨后，多項(xiàng)研究表明其他納米材料（CuO NPs、Ag NPs）也可提高細(xì)菌內(nèi)活性氧含量和SOS反應(yīng)水平，并提高了質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移［49-50］。

近年來(lái)，研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)不同金屬、不同濃度的納米材料對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響不同。Wang等［51］發(fā)現(xiàn)Fe2O3促進(jìn)RP4（IncP）質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，MoS2對(duì)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移無(wú)影響，而Fe2O3@MoS2復(fù)合納米材料（100 mg/L）可顯著抑制RP4在大腸桿菌向糞腸球菌、大腸桿菌與大腸桿菌間的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，其抑制效果分別高達(dá)10和100倍以上，該抑制活性主要是由于復(fù)合納米材料抑制接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（trfA和trbB）和外膜孔道基因（ompA和ompC）的表達(dá)等。Parra等［52］發(fā)現(xiàn) 50 mg/L Cu NPs導(dǎo)致IncP質(zhì)粒從羅爾斯通氏菌轉(zhuǎn)移到惡臭假單胞菌的接合頻率降低到對(duì)照組的10%。另外，Yu等［53］研究發(fā)現(xiàn)高濃度的CeO2NPs（25和 50 mg/L）致使IncP型 RP4質(zhì)粒在大腸桿菌間的接合頻率提高到對(duì)照組的118%-123%，而較低濃度（1和 5 mg/L）導(dǎo)致質(zhì)粒的接合頻率降低到對(duì)照組的22%-26%。進(jìn)一步探究CeO2NPs抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，低濃度CeO2NPs（1 mg/L）可降低細(xì)菌內(nèi)活性氧的積累、降低SOS反應(yīng)、減少胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）。EPS的存在可提高細(xì)胞間“接合通道”的穩(wěn)定性、降低接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（如trbBp、trfAp基因）的表達(dá)水平，而高濃度CeO2NPs（50 mg/L）處理后的細(xì)菌則呈現(xiàn)出相反的結(jié)果［53］。類似的，Liu等［54］再次證明了納米硫化零價(jià)鐵可通過(guò)上述相似機(jī)制，顯著降低RP4從大腸桿菌向假單胞菌的轉(zhuǎn)移效率。

雖然目前已報(bào)道的金屬納米材料對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移效率的影響有所差異，但根據(jù)上述數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納米材料抑制細(xì)菌SOS反應(yīng)時(shí)，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移效率下降。現(xiàn)有的研究表明，質(zhì)粒以單鏈DNA形式在細(xì)菌間進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移時(shí)，激發(fā)細(xì)菌SOS反應(yīng)有助于提高細(xì)菌基因組穩(wěn)定性，以確保質(zhì)粒在細(xì)菌間順利完成轉(zhuǎn)移［55-56］。由此推測(cè)納米材料通過(guò)抑制細(xì)菌SOS反應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效率下降。另外，Crane等［57］研究者發(fā)現(xiàn)鋅（如鋅離子載體、吡硫鋅）通過(guò)抑制SOS反應(yīng)，發(fā)揮其抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的功能。綜上，納米材料可通過(guò)降低細(xì)菌SOS反應(yīng)、降低接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)和降低細(xì)菌間胞外聚合物含量等形式，導(dǎo)致質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移效率降低。

3.6 等離子體

等離子體（plasma）是氣體在高壓電場(chǎng)間被擊穿，致使原子及原子團(tuán)被電離而產(chǎn)生的正負(fù)離子組成的離子化氣體狀物質(zhì)。隨著等離子體技術(shù)的發(fā)展，等離子體已被廣泛運(yùn)用于材料、化工醫(yī)療等領(lǐng)域。等離子體環(huán)境可破壞細(xì)菌正常的生理功能，因此被用于醫(yī)療器械、食品、牙齒等的消毒與滅菌。最近，Li等［58］發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌經(jīng)等離子體（10 min，9 kV）處理后，其質(zhì)粒的接合頻率發(fā)生顯著下降。研究者還發(fā)現(xiàn)在表面等離子氧化條件下，添加NO3-、Cu2+、和Fe2+時(shí)，98%質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移受到抑制，同時(shí)顯著消除了細(xì)菌的耐藥基因（如tet(C)、tet(W)、blaTEM-1和aac(3)-II基因）［59］。與納米材料抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制相似，研究者證實(shí)了等離子體可降低細(xì)菌胞內(nèi)活性氧含量、ROS反應(yīng)、細(xì)胞間的黏附性（如胞外聚合物含量降低），從而導(dǎo)致質(zhì)粒接合頻率下降［59］。

3.7 其他

除上述幾類抑制劑外，還有一些有苗頭的化合物，如松弛酶抑制劑。鑒于松弛酶是啟動(dòng)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，開(kāi)發(fā)以此為靶點(diǎn)的抑制劑，具有潛在的應(yīng)有前景。Lujan等［60］發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽能夠通過(guò)抑制供體菌松弛酶的活性（圖2），顯著性抑制F質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移。隨后Nash等［61］評(píng)估了雙膦酸鹽對(duì)不同質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽特異性抑制F質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移，而對(duì)質(zhì)粒R100和pCU1影響較小，并發(fā)現(xiàn)該化合物是金屬螯合物，主要發(fā)揮抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的功能。單鏈Fv抗體是另一種以松弛酶為靶標(biāo)的接合抑制劑，Garcillán-Barcia等［24］發(fā)現(xiàn)單鏈Fv抗體能夠抑制質(zhì)粒R388松弛酶（TrwC）的活性，當(dāng)Fv抗體在受體細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，可降低質(zhì)粒在細(xì)胞間的接合頻率。

另外，還有其他類化合物也展現(xiàn)出具有抑制質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的功能，如自由亞硝酸通過(guò)改變細(xì)菌胞內(nèi)鐵離子濃度、抑制接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致質(zhì)粒RP4在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移頻率顯著下降［62］。盡管有研究報(bào)道褪黑素可抑制質(zhì)粒的接合頻率［63］，特別是導(dǎo)致攜帶mcr-1基因質(zhì)粒的接合頻率顯著性下降，但應(yīng)注意的是，褪黑素和黏菌素具有協(xié)同殺菌效果［64］，mcr-1陽(yáng)性接合子的減少可能主要是由于兩個(gè)藥物同時(shí)篩選接合子時(shí)產(chǎn)生的協(xié)同殺菌作用所致，而非褪黑素抑制mcr-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所致。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

質(zhì)粒是耐藥基因傳播的主要載體之一，降低質(zhì)粒在細(xì)菌間的接合轉(zhuǎn)移效率，可有效防控耐藥基因/耐藥菌的傳播和擴(kuò)散。在松弛酶、偶聯(lián)蛋白以及接合轉(zhuǎn)移T4SS系統(tǒng)共同調(diào)控下，質(zhì)粒從供體細(xì)菌通過(guò)接合通道單向轉(zhuǎn)移至受體細(xì)菌中，致使質(zhì)粒攜帶的耐藥基因在不同細(xì)菌間傳播。接合抑制劑通過(guò)降低質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力，從而減緩耐藥基因/耐藥菌的擴(kuò)散，是一種有潛力的新型抗菌策略［4-5,19］。

目前多數(shù)接合抑制劑顯示出較好的抑制活性，主要是通過(guò)破壞T4SS系統(tǒng)所編碼轉(zhuǎn)移通道的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，導(dǎo)致質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移能力下降，其中部分抑制劑，如脂肪酸類、亞水楊基酰肼類和擬肽類化合物等，是以某一類接合T4SS系統(tǒng)為靶標(biāo)篩選出來(lái)的化合物，只對(duì)特異質(zhì)粒有抑制活性，存在抑制譜較窄的問(wèn)題［27,29,40,44］。黃霉素在體外和體內(nèi)均顯示出較好的接合抑制活性，但其抑制機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究［32-34］。金屬納米材料是近幾年報(bào)道較多、活性較強(qiáng)的接合抑制劑，主要是通過(guò)干擾細(xì)菌生理功能降低耐藥質(zhì)粒的傳播，沒(méi)有質(zhì)粒特異性，具有良好的應(yīng)用前景，但由于不同濃度金屬原材料對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的影響不同，不能忽視由其所帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)［51-54］。另外，接合轉(zhuǎn)運(yùn)通道和菌毛為膜蛋白復(fù)合體，蛋白分離純化難度較大，導(dǎo)致靶點(diǎn)不明確，難以明確構(gòu)效關(guān)系，存在難以優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)的缺陷。

盡管存在上述局限，接合抑制劑所具備的優(yōu)勢(shì)也不容忽視。抑制劑因不靶向細(xì)菌的生存與繁殖，對(duì)細(xì)菌選擇壓力小，具有不易誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生的特點(diǎn)。再者，多數(shù)抑制劑的靶標(biāo)是T4SS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)通道和菌毛（位于細(xì)菌外膜上）［4,17,44］，規(guī)避了傳統(tǒng)抗菌藥物難以穿過(guò)細(xì)胞膜或被外排泵排出的問(wèn)題，具備較容易到靶標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)，展示了良好的應(yīng)用前景。隨著對(duì)T4SS系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，該系統(tǒng)所編碼的蛋白組件不斷被分離純化和解析［65-67］，靶向T4SS的小分子化合物設(shè)計(jì)和優(yōu)化工作將不斷提升，未來(lái)有望開(kāi)發(fā)更具成藥性的小分子接合抑制劑。