胡功政 崔小蝶 翟亞軍 賀丹丹

（河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，鄭州 450046）

黏菌素（colistin，COL）屬于陽離子多肽類抗生素，因腎臟和神經(jīng)毒性于20世紀70年代幾乎被棄用，由于多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）革蘭陰性菌的出現(xiàn)，醫(yī)學和獸醫(yī)臨床將面臨無抗菌藥可用的局面，因此COL又被老藥新用，作為治療嚴重MDR革蘭陰性菌感染的最后一道防線。而隨著COL使用的增長，細菌COL耐藥性世界范圍內日益增長，已成為全球關注的焦點。研制具有新作用靶點的新抗菌藥異常艱難，而逆轉耐藥性的聯(lián)合用藥（與新的化合物或老藥聯(lián)用）是與MDR細菌斗爭的經(jīng)濟、有效策略。聯(lián)合用藥可利用藥物間的協(xié)同作用，大幅提高抗菌療效，克服細菌耐藥性，減緩耐藥性發(fā)展。逆轉COL耐藥性的化合物篩選、逆轉作用（聯(lián)合用藥協(xié)同增效）及其機制研究，近年已引起國內外高度重視［1-4］，并已取得可喜進展。

細菌COL耐藥性，本質上是細菌在COL壓力下、為了生存而產(chǎn)生的適應性反應，與COL的作用機制密切相關；而聯(lián)用藥物或佐藥的逆轉作用往往也針對其作用機制和耐藥機制，即作用機制、耐藥機制與逆轉耐藥機制間具有有機的內部聯(lián)系。

1 COL作用機制

過去一般認為COL對革蘭陰性菌的作用機制是膜損害（膜裂解死亡途徑），現(xiàn)在的試驗已證明其作用機制還包括：囊泡-囊泡觸聯(lián)途徑、活性氧（reactive oxygen species，ROS）殺滅途徑及呼吸酶抑制途徑。

1.1 膜裂解死亡途徑

COL可選擇性地與革蘭陰性菌外膜（outer membrane，OM）LPS（起始靶位）結合，通過膜裂解殺滅細菌［5-7］。首先，COL帶正電荷的二氨基丁酸殘基中的游離r-氨基質子化，靜電吸引類脂A中帶負電荷的磷酸頭部，競爭性替代Ca2+和Mg2+。隨后COL分子插入疏水性N-末端脂肪酸鏈和D-phe6-L-leu7片段進入外膜，減弱鄰近類脂A的組裝，引起外膜膨脹并形成不穩(wěn)定區(qū)。最后，COL橫跨疏水頭部和脂肪酸鏈的表面，引起自促攝入（self-promoted uptake），使內膜（internal membrane，IM）稀薄并破壞磷脂雙層的完整性，從而導致IM裂解和細菌死亡。

1.2 囊泡-囊泡觸聯(lián)途徑

COL分子可借助于靜電作用和兩個疏水區(qū)，與陰離子的磷脂囊泡（即OM內葉和IM的外葉）結合，介導環(huán)繞周質的囊泡-囊泡觸聯(lián)融合，引起囊泡間（OM和IM小葉間）的磷脂交換，導致磷脂組成的特異性喪失和滲透性平衡破壞，使細菌裂解死亡［5-7］。

1.3 羥基自由基（·OH）誘導的死亡途徑（活性氧ROS殺滅途徑）

COL穿過外膜和內膜時，使細菌活性氧（ROS）［超氧化物（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）］水平升高，首先促進生成O2-，O2-隨后由超氧化物歧化酶（SOD）轉換成H2O2，H2O2將Fe2+氧化成Fe3+并生成·OH（芬頓反應）。·OH可導致DNA損傷、脂質和蛋白質的氧化損傷，最終導致細菌死亡［5，7］。這一過程不依賴于COL與OM特異性靶位點的結合。

此外，COL刺激大腸桿菌soxS的表達，soxS是sodA（編碼含Mn-SOD），fpr（編碼NADPH：鐵氧蛋白氧化還原酶）和ydbK（編碼Fe-S還原酶）等ROS應激相關基因的轉錄激活劑［5］。

1.4 呼吸酶抑制途徑

COL穿過外膜和內膜進入細胞后，可加速TCA（三羧酸）循環(huán)和增強呼吸鏈，通過抑制細菌呼吸鏈中的NADH氧化酶等關鍵酶，造成呼吸鏈混亂并生成超氧化物［5-6］。

2 COL耐藥機制研究進展

沙門菌、大腸桿菌等對COL的獲得性耐藥機制十分復雜，主要有染色體介導的脂多糖（LPS）修飾［由雙組分信號轉導系統(tǒng)（TCSs）PhoPQ和PmrAB］、質粒介導的可轉移COL耐藥（mcr基因）及尚未闡明分子機制的主動外排系統(tǒng)等［7-9］。

2.1 染色體介導的LPS修飾（涉及2個TCSs PhoPQ和PmrAB）

2.1.1 PhoPQ介導LPS類脂的AL-Ara4N修飾 TCS PhoPQ由感應子激酶PhoQ和調控子PhoP組成（圖1）。PhoP通過感應陽離子抗菌肽等外部信號使自身發(fā)生磷酸化而被激活，后者再激活arnBCADTEF（也稱pmrH）的表達。pmrH編碼4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖（Ara4N）轉移酶，使陽離子的Ara4N加成到類脂A的磷酸基團，產(chǎn)生L-Ara4N化修飾，導致陽離子COL與外膜陰性LPS的親和力降低，使細菌耐藥［7-9］。MgrB為負性調控蛋白，通過抑制PhoQ而抑制pmrH的表達。mgrB缺失、變異，均可上調PhoPQ和pmrH的表達，導致對COL耐藥。

圖1 由脂多糖（LPS）修飾介導的沙門菌對黏菌素的一般耐藥機制Fig. 1 General mechanism of Salmonella resistance to COL mediated by lipopolysaccharide（LPS）modification

2.1.2 PmrAB介導的類脂A的pEtN修飾 TCS PmrAB由感應子激酶PmrB和調控子PmrA組成（圖1）。沙門菌中，PmrD是PhoPQ和PmrAB兩個TCSs間的連接蛋白，發(fā)揮正調控作用。PmrB感應外部信號（如COL等）被激活，通過磷酸轉移使PmrA磷酸化而激活，進而上調pmrC表達，pmrC編碼磷酸乙醇胺（pEtN）轉移酶，使pEtN加成到類脂A的1-磷酸上，產(chǎn)生pEtN修飾，使細菌耐藥［8-9］。PhoPQ也可通過激活PmrD，間接激活PmrAB，進而刺激pmrC的表達。PmrA磷酸化后也可上調pmrH的表達。

PmrA介導的LPS修飾發(fā)生于類脂A、核心多糖和 O-抗原鏈 3 個區(qū)域［6，8］。（1）最內的類脂 A區(qū)，PmrA除激活pmrC、pmrH外，還可激活L-Ara4N生物合成與類脂A修飾物加合相關基因ugd（編碼UDP-葡萄糖-脫氫酶）和pbg（編碼L-Ara4N轉移酶）的表達；（2）中心的核心多糖區(qū)，PmrA可激活eptB和cptA基因，后者的產(chǎn)物可介導LPS核心區(qū)磷酸化的庚糖（I）磷酸基團的PEtN修飾；（3）最外的O-抗原鏈，O抗原長度的增加將導致對COL高度耐藥，PmrA可上調沙門菌LPS修飾位點Wzzst和Wzzsep基因的轉錄，增加LPS中O-抗原量，增加耐藥性。

2.2 質粒介導的耐藥機制

自質粒介導的mcr-1（編碼pEtN轉移酶）被發(fā)現(xiàn)以來［10］，已在全球動物和人的腸桿菌科細菌中相繼檢出。迄今已報道10種mcr基因（mcr-1-mcr-10）［11］。MCR-1編碼一個pEtN轉移酶，導致在pEtN加成到LPS的脂質A，增加LPS上的陽離子電荷，從而降低COL與LPS的結合［10］。所有已發(fā)表的MCR-1的晶體結構都表明MCR-1的活性位點有至少一個共同的鋅離子，證實MCR-1是一種鋅離子蛋白［12］。mcr-1可同時位于染色體和質粒上，單拷貝mcr-1可致LPS修飾，而多拷貝染色體mcr-1可促進耐藥性的穩(wěn)定持續(xù)［13］。位于質粒上的mcr基因加速了COL耐藥性在不同細菌種屬之間的傳播，因此為解決COL耐藥日益嚴重的問題，中國已禁止將COL作為飼料添加劑用于促生長，許多歐洲國家也減少了COL在畜牧業(yè)中的應用［14］。

2.3 未闡明分子機制的主動外排系統(tǒng)

采用正向（激活）或反向（基因缺失或外排泵抑制）研究均證明，外排泵如AcrAB-TolC（大腸桿菌、沙門菌等），KpnEF（肺炎克雷伯菌），以及MexXYOprM（綠膿桿菌）等在COL耐藥性中十分重要［8-9］。外排泵抑制劑CCCP能逆轉多種細菌對COL的耐藥性，無論涉及pmrB、mgrB變異，還是涉及mcr-1陽性，均有逆轉效果［15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，沙門菌主動外排系統(tǒng)（AcrAB-TolC）ΔacrB時，并不明顯改變對COL的敏感性，但當ΔtolC或ΔacrB與CpxAR系統(tǒng)激活協(xié)同作用時，菌株對COL的敏感性顯著增強［16-19］。而SoxRS可通過上調AcrAB-TolC介導陰溝和阿氏腸桿菌對COL的異質性耐藥［20］。盡管現(xiàn)已證明外排泵在COL耐藥性中有重要作用，但其具體分子機制并不清楚。

3 佐藥逆轉細菌COL耐藥性的研究進展

3.1 逆轉COL耐藥性的藥物或化合物

研發(fā)新抗菌藥耗時長、費用高、風險大，而抗生素佐藥（adjuvants）針對細菌的非必須功能，并增強抗生素活性，可提供經(jīng)濟有效的方法逆轉細菌耐藥性。

目前，應用佐藥逆轉COL耐藥性已成為研究熱點，有多種方法用于佐藥篩選，如表型檢測（MIC測定、棋盤試驗等）、分子對接技術、生物信息學方法［4］和萬古霉素低溫拮抗作用篩選方法［21］等。萬古霉素低溫拮抗作用是有用的較新的特異性篩選平臺，E.coli在應激期間對萬古霉素變得敏感，這種表型可由滅活涉及外膜生物合成尤其是LPS核心多糖合成所必需的基因所逆轉。由于涉及非必需的外膜生物合成的基因損害，常常使革蘭陰性菌對經(jīng)典的作用于革蘭陽性菌的抗生素敏感，故在低溫下即15℃對萬古霉素拮抗作用的篩選檢測，可檢出擾亂外膜的非致死分子即逆轉COL耐藥性的化合物。已有研究利用該篩選方法對1 440種之前批準的藥物進行了篩選，篩選鑒定出1種活性化合物噴他脒（pentamidine），能夠逆轉革蘭陰性菌的COL耐藥性，突顯了這種篩選方法的特異性。

已報道逆轉COL耐藥性的佐藥約60余種，主要包括（1）抗寄生蟲藥物：如抗原蟲藥噴他脒、水楊酰苯胺類抗蠕蟲藥五羥氯柳胺、氯硝柳胺、碘醚柳胺等［21-25］；（2）大環(huán)內酯類抗革蘭陽性菌抗生素克拉霉素、阿奇霉素等［26］；（3）其他藥物：褪黑素［27］、紫檀芪（抗癌）［28］、疊氮胸苷［29］、阿司匹林等；（4）天然化合物：如白藜蘆醇、熊果酸、蛇床子素、丁香酚［30-33］；（5）藥物衍生物：如苯并咪唑、色胺和苯氨乙酮衍生物和［34-35］；（6）新的先導化合物：如廣譜佐藥SLAP-S25［1］、OmpA抑制劑AOA-2［36］；（7）小分子化合物 ：二氨基咪唑［37］、dephostatin［38］和帶正電荷的二胺嗎啡代寡核苷酸肽［39］。

3.2 逆轉COL耐藥性的分子機制

逆轉COL耐藥性的機制研究報道不斷增加，但仍處于初步探索階段，大多數(shù)僅針對相應藥物的某一方面機制進行研究且不深入，復雜的逆轉機制闡明仍面臨著挑戰(zhàn)。目前已報道的逆轉COL耐藥的機制主要分為以下幾個方面：與COL作用機制相關的逆轉機制，與COL耐藥機制相關的逆轉機制、影響外膜蛋白表達的逆轉機制以及綜合逆轉機制。

與COL作用機制相關的逆轉機制主要有：（1）損害細菌外膜：通過外漏蛋白質或核酸含量的測定、膜完整性和通透性試驗、細菌的溶解檢測等試驗證明 ：如噴他脒［21］、氯羥柳胺［22］、粉防己堿［40］等逆轉細菌（肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌）COL耐藥性，其機制在于損害細菌外膜而增加了細菌外膜的通透性；（2）增強氧化應激：質子驅動力（PMF）的破壞會減少ATP的生成，增加氧氣消耗和氧化應激。當外排泵受到抑制時，通過PMF、細胞內ATP水平、耗氧量及菌體內氧化還原電位測定等證明，氯硝柳胺能使大腸桿菌解偶聯(lián)氧化磷酸化，破壞菌株的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導致氧化應激增加，是逆轉COL耐藥性的機制之一［41］。

與COL耐藥機制相關的逆轉機制主要有：（1）抑制mcr-1的表達或抑制MCR-1蛋白，如粉防己堿可抑制 mcr-1 的表達［40］；蛇床子素［32］、紫檀芪［28］、苯氨乙酮衍生物（能通過氫鍵與MCR-1蛋白互作，抑制MCR-1晶體所導致的磷酸乙醇胺（pEtN）轉移反應，抑制MCR-1的酶活性）［35］、丁香酚［33］不僅可抑制mcr-1的表達，而且其酚羥基還可與MCR-1蛋白的鋅原子結合，與COL聯(lián)用對大腸桿菌產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用；帶正電荷的二胺嗎啡代寡核苷酸肽［39］是以mRNA為靶位、阻止翻譯的MCR-1反義分子，能恢復mcr-1陽性大腸桿菌對COL的敏感性。（2）下調TCS pmrAB表達，如小分子二氨基咪唑［37］及亞硝苯胺類化合物dephostatin［38］，能顯著下調或阻斷TCS pmrAB，逆轉類脂A修飾，阻斷細菌（沙門菌）對COL的耐藥性。（3）外排泵機制：基因缺失技術證明，沙門菌標準菌株JS主動外排系統(tǒng)ΔtolC時，能夠明顯改變對COL的敏感性，菌株對COL的敏感性顯著增強［19］。采用表型改變、外排泵活性、分子對接、轉錄組、基因缺失、熒光探針檢測等試驗及細菌細胞內的抗生素濃度變化證明，多類逆轉藥物（如氯羥柳胺［22］、熊果酸［31］、CCCP［15］和粉防己堿［40］）均有外排泵抑制作用，能使COL耐藥的大腸桿菌或沙門菌恢復敏感性。

影響外膜蛋白表達的逆轉機制：AOA-2通過下調OmpA和上調OmpA25的表達量，增強COL對鮑曼不動桿菌的殺菌活性［36］。

綜合逆轉機制，如SLAP-S25通過膜損害、代謝改變和細胞內抗生素蓄積［1］多種機制恢復細菌對多種抗生素包括COL的敏感性；褪黑素能增加外膜的通透性、促進氧化損傷和抑制外排泵［27］，逆轉由MCR介導的陰性菌對COL耐藥性。粉防己堿通過增強COL的膜損傷能力、破壞了細菌的質子動力、外排泵功能和抑制MCR-1蛋白來逆轉由MCR介導的沙門菌對COL的耐藥性（圖2）［40］。

圖2 逆轉革蘭陰性菌黏菌素耐藥性的分子機制Fig. 2 Molecular mechanism of reversing COL resistance in gram negative bacteria

4 存在問題與展望

近年文獻報道的逆轉細菌COL耐藥性的佐藥已有60余種，但因有效性、安全性、特異性和合理用量等問題尚無一個成功用于臨床。這些佐藥的化學結構及藥理作用各異，其共性逆轉機制除膜損害、mcr-1表達降低或MCR-1活性抑制得到清晰的闡明外，對其他方面分子機制的研究尚不系統(tǒng)深入。例如，抑制外排泵、增加氧化損傷被證明是逆轉COL耐藥性的重要機制，但革蘭陰性菌外排泵有多種，除最重要的外排系統(tǒng)AcrAB-TolC外，依賴TolC的RND外排泵還有AcrAD-TolC、AcrEF-TolC、AcrABTolC等多種，每種外排泵又有多個組分，且其表達受marA、soxS、robA、ranA等全局調控基因的調控。佐藥抑制何種外排泵、如何抑制外排泵而逆轉COL耐藥性及其量效關系？又如氧化損傷涉及ROS產(chǎn)生、清除、TCA循環(huán)、呼吸鏈等環(huán)節(jié)，佐藥通過影響何種環(huán)節(jié)，來逆轉細菌對COL的耐藥性？其量效關系如何？目前對佐藥或聯(lián)合用藥逆轉COL耐藥性的分子機制遠未闡明，該方面的研究總體處于初步階段，是制約安全高效佐藥篩選及聯(lián)用措施建立的關鍵瓶頸。

隨著組學（轉錄組、代謝組和蛋白質組）技術的應用，結合差異基因的缺失與回補，將推動佐藥的具體靶點（如外排泵、氧化應激和代謝途徑）得以揭示，令新的佐藥篩選更具針對性；而對逆轉作用的量效關系研究，將使得聯(lián)合用藥方案或其復方制劑中佐藥用量的確定有科學的理論依據(jù)。可以預見，一批新的逆轉COL耐藥性的高效佐藥將陸續(xù)篩選發(fā)現(xiàn)，逆轉耐藥性的研究理論將不斷的豐富、深化和完善。