王亞?wèn)|，曹碧月，高生寶，王雪君，步雪峰

0 引 言

胃癌在世界常見(jiàn)腫瘤中發(fā)病率居第四位，是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，僅次于肺癌和肝癌[1]。胃癌分為早期胃癌和晚期胃癌，腫瘤的分期決定了治療效果和治療決策，如早期胃癌患者行根治性手術(shù)，后期同時(shí)進(jìn)行化療治療，術(shù)后5年生存率為90%，因此，胃癌的治療效果是可以接受的[2]。但是，如目前常用的癌胚抗原、CA199等腫瘤標(biāo)記物，在胃癌早期診斷中陽(yáng)性率較低，因此，需要發(fā)現(xiàn)一種更有效的早期胃癌診斷標(biāo)志物[3]。環(huán)狀RNA(CircRNAs)是一種特殊非編碼RNA，廣泛存在于生物體內(nèi)[4-5]。不僅與人類(lèi)許多疾病密切相關(guān)，且具有潛在的癌癥診斷與生物治療價(jià)值[6]。其本身為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可不受外切酶影響，遂在細(xì)胞內(nèi)更加穩(wěn)定[7]。

MicroRNA(miRNAs)是一種小型非編碼RNA，可通過(guò)抑制信使RNA(mRNA)翻譯或促進(jìn)mRNA降解在逆轉(zhuǎn)后水平上調(diào)控基因表達(dá)，正確調(diào)控miRNA的表達(dá)是維持平衡生理環(huán)境的必要條件，這些小分子幾乎影響細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、細(xì)胞增殖到細(xì)胞凋亡的所有遺傳途徑，其靶基因范圍廣泛，干預(yù)著疾病的發(fā)生發(fā)展[8-10]。

本研究篩選出環(huán)狀hsa_circ_0000128暫未有相關(guān)研究，該研究探討hsa_circ_0000128在胃癌組織、細(xì)胞株中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的機(jī)制。探討作為早期診斷標(biāo)志物及可能作為治療的分子靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源選取2019年11月至2020年8月至江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院病理科的40份胃腺癌及癌旁組織標(biāo)本。術(shù)前均未接受任何放、化療。其中取距離胃癌組織外緣5 cm的組織作為癌旁組織。病理科收取組織后液氮罐中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱，已備進(jìn)一步使用。本研究經(jīng)過(guò)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：K-20200058-Y)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2材料高通量測(cè)序(上海歐易生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；人胃癌細(xì)胞MGC-803、BGC-823、HGC-27(中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；胎牛血清(BI公司)；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基(BI公司)；Trizol試劑(Ambion life technologies)；小干擾RNA(si-RNA,蘇州吉瑪基因股份有限公司)、miR干預(yù)試劑(上海生工生物有限公司)；PCR引物(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (南京厚載生物科技有限公司);過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、hsa_circ_0000128-WT、hsa_circ_0000128-Mut與mimics/miR-NC(湖州河馬生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；兔抗Bcl-2、EIF4A1(杭州華安生物技術(shù)有限公司);兔抗 cleaved-caspase-3(CST公司)；兔抗Bax(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1 環(huán)狀RNA及miR-623的篩選收集5對(duì)胃腺癌組織及癌旁組織(距離腫瘤>10 cm),上海歐易生物公司，通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)全基因組序列，使用DE-Seq軟件對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果經(jīng)行處理，進(jìn)行差異顯著性分析。挑選出表達(dá)差異的環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出下游miR-623。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI 1640、DMEM于飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)胃癌細(xì)胞BGC-823、HGC-27以及MGC-803，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.2.3RNA的提取及對(duì)hsa_circ_0000128、miR_623、EIF4A1相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)采用Trizol試劑提取胃癌及癌旁組織、胃癌細(xì)胞株、干預(yù)后胃癌細(xì)胞株及正常胃黏膜上皮細(xì)胞中總RNA.使用Nanodrop2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度及純度。按照TAKARI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒加樣步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系配置方法為：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，環(huán)狀RNA上、下引物各0.4 μL，8.2 μL DEPC水以及1 μL cDNA。RT-PCR實(shí)驗(yàn)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃退火 30 s，40次循環(huán)，獨(dú)立樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在CFX96熒光定量PCR儀中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以2-ΔΔCt法反映hsa_circ_0000128、miR-623、EIF4A1的相對(duì)表達(dá)水平。Hsa_circ_0000128上游引物：5′-TCAGACACGACTTATCACCCAG-3′，下游引物：5′-GCAGATGGCACAAGCAAAG -3′，內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCCACTTCTCTCTAAGGAGAAT-3′下游引物：5′-TACACGAAAGCAATGCTATCAC-3′。miR_623上游引物：5′-GCCGAGTGGGTTGTCGGGGACG -3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT -3′,U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT -3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC -3′,EIF4A1上游引物：5′-CATCCAGCAGCGAGCCATTCTAC -3′，下游引物：5′-ACCAACCAGATGCCACTCTACCC -3′。根據(jù)RT-PCR在胃癌細(xì)胞株及胃上皮粘膜細(xì)胞中的結(jié)果選取表達(dá)量最多及最少的細(xì)胞系繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染將HGC-27、MGC-803細(xì)胞株分別接種于兩塊細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中設(shè)置相應(yīng)的circRNA組別：Si-NC組(Si-NC轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、Si-circ組(si-hsa_circ_0000128轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、Si-EIF4A1組(Si-EIF4A1轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、miR-NC組(miR-623-NC轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、miR-mimics 組(miR-623-mimics轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、miR-inh組(miR-623-inhibitors轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、Si-circ +miR-NC組(Si-circ、miR-NC轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)、Si-circ +miR-inh組(Si-circ、miR-inh轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞)。每孔接種細(xì)胞5×105個(gè)，溫箱培養(yǎng)12 h后待細(xì)胞貼壁。將按比例配置完全的干擾試劑通過(guò)LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染于相對(duì)于的細(xì)胞孔中，更換無(wú)血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h后重新?lián)Q至10%FBS 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，提取相對(duì)應(yīng)的RNA并進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白并進(jìn)行目的蛋白的蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)水平。同期進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)①克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染相對(duì)應(yīng)干擾的MGC-803、HGC-27細(xì)胞分別接種在6孔板中(500個(gè)/孔)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，每3～5 d換液一次，經(jīng)常觀察，待平板中出現(xiàn)肉眼可觀察到的克隆團(tuán)時(shí)終止培養(yǎng)，去除上清，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入4%甲醛溶液后置于4 ℃冰箱內(nèi)固定細(xì)胞15 min，再次使用PBS清洗3次，加入結(jié)晶紫溶液(1 mL/孔)染色，時(shí)長(zhǎng)20 min，使用PBS清洗染色劑，空氣干燥。計(jì)數(shù)細(xì)胞的克隆數(shù)，公式如下：

克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%

②TRANSWELL實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染完成后的MGC-803、HGC-27貼壁細(xì)胞消化離心后置于無(wú)血清培養(yǎng)基中，于24孔板中加入600 μL 10%BI血清的培養(yǎng)液，后放置TRANSWELL小室，加入細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)的細(xì)胞懸液，于37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h后，棄置培養(yǎng)液，使用PBS清洗兩次，后4%甲醛溶液固定30 min，適當(dāng)風(fēng)干，后0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞，再次使用PBS清洗3次，顯微鏡隨機(jī)挑選六個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)。

1.2.6檢測(cè)EIF4A1基因在胃癌中的表達(dá)及干預(yù)胃癌細(xì)胞株后相應(yīng)的表達(dá)取干預(yù)后的MGC-803、HGC-27細(xì)胞，按1.2.2提取細(xì)胞RNA，后同前RT-qPCR驗(yàn)證。

1.2.7蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株中相關(guān)凋亡蛋白及EIF4A1蛋白表達(dá)水平取干預(yù)后胃癌細(xì)胞MGC-803、HGC-27，在6孔板中加入每孔1 mL/孔配置完全的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，使用蛋白刮沿板孔壁反復(fù)刮取完全，后吸入1mL EP管中，100 ℃水浴鍋加熱5 min，煮沸完全后4000 rcf/min,離心5 min，取上清，按照BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒操作步驟測(cè)定蛋白濃度，后按3∶1比例加入配置均勻的4×上樣緩沖液。

配置10% SDS-PAGE凝膠，80 V 電泳30 min，110 V電泳60 min，將蛋白按mark標(biāo)識(shí)分子量大小切膠分離，350 mA轉(zhuǎn)膜110 min。觀察PVDF膜上是否存在mark條帶，存在則使用牛血清白蛋白常溫封閉條帶1.5 h，配置相關(guān)一抗按1∶1000稀釋后分別予條帶敷兔抗cleaved-caspase-3,Bcl-2, Bax,EIF4A1，兔多抗β-actin及GAPDH,4 ℃冰箱敷于育過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，每次15 min，潔凈濾紙吸出殘留TBST后敷二抗，再次使用TBST洗膜3次，每次10分鐘。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影。Image J對(duì)蛋白條帶吸光度進(jìn)行定量分析。

1.2.8熒光素酶驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出下游miR-623,通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)。在24孔板內(nèi)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，將hsa_circ_0000128-WT、hsa_circ_0000128-Mut與mimics/miR-NC轉(zhuǎn)染至HGC-27和MGC-803細(xì)胞中，溫箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基棄置，PBS緩慢洗滌2次，每孔中加入100 μL的1×Passive Lysis Buffer(由5×Passive Lysis Buffer加雙蒸水稀釋得到)，搖床震蕩30 min。吸取裂解產(chǎn)物，15 000 rfc/min,離心10 min，取20 μL上清至標(biāo)記好的離心管，熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)熒光值。

2 結(jié) 果

2.1 hsa_circ_0000128的篩選使用五組胃腺癌組織、癌旁組織進(jìn)行高通量測(cè)序，篩選出相對(duì)表達(dá)量相對(duì)較大且尚未被研究的環(huán)狀RNA：hsa_circ_0000128，見(jiàn)圖1。

圖 1 高通量測(cè)序結(jié)果

2.2胃腺癌組織及胃癌細(xì)胞株中has_circ_0000128、miR-623的表達(dá)通過(guò)高通量測(cè)序篩選出環(huán)狀RNA(hsa_circ_0000128)，在胃腺癌組織和正常組織中的相對(duì)表達(dá)量。40例胃癌組織中hsa_circ_0000128的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組織(P<0.05)。hsa_circ_0000128在3種胃癌細(xì)胞MGC-803、HGC-27以及BGC-823中的相對(duì)表達(dá)量均高于正常人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1(P<0.05)。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)circRNA下游具有表達(dá)差異的miRNA為miR-623，通過(guò)樣本PCR驗(yàn)證miR-623在40例胃癌組織中含量均小于癌旁組織(P<0.05)，在胃癌細(xì)胞株中含量均低于正常胃正常粘膜上皮細(xì)胞(P<0.05)。結(jié)果所示在HGC-27與MGC-803中差異最明顯，后續(xù)挑選此兩種細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。見(jiàn)圖2。

與GES-1比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05

2.3hsa_circ_0000128的敲減效率及miR-623對(duì)應(yīng)表達(dá)情況胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)的si-circ-000128及si-NC 48h后，RT-qPCR法檢測(cè)胃癌細(xì)胞HGC-27、MGC-803中hsa_circ_0000128的表達(dá)水平，SI-circ組的相對(duì)表達(dá)量明顯低于SI-NC組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染si-circ-0000128后miR-623的含量明顯升高，加入miRNA inhibitor后，SI-circ+miR-inh組較SI-circ+miR-NC組miR-623含量下降(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明通過(guò)si-circ-0000128可明顯降低hsa_circ_0000128在在胃癌中的相對(duì)表達(dá)量，hsa_circ_0000128可作為miR-623的海綿，影響其表達(dá)。見(jiàn)圖3。

*P<0.05

2.4敲減hsa_circ_0000128對(duì)細(xì)胞凋亡的影響取干預(yù)后的胃癌細(xì)胞株提取對(duì)應(yīng)蛋白進(jìn)行Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SI-circ組Cleaved-caspase-3、Bax相對(duì)表達(dá)量較SI-NC組增加(P<0.05)；SI-circ組Bcl-2相對(duì)表達(dá)量較SI-NC組下降(P<0.05)，見(jiàn)圖4，表1。miR-623 inhibitor加入減緩了凋亡蛋白的表達(dá)，間接說(shuō)明促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖5，表2。

1、2：分別為HGC-27細(xì)胞Si-NC組、Si-circ組； 3、4：分別為MGC-803細(xì)胞Si-NC組、Si-circ組

1、2：分別為HGC-27細(xì)胞SI-circ+miR-NC組、Si-circ+miR-inh組； 3、4：分別為MGC-803細(xì)胞SI-circ+miR-NC組、Si-circ+miR-inh組

表 1 敲減環(huán)狀RNA后細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)情況

表 2 敲減環(huán)狀RNA加入miRNA抑制劑后細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)情況

2.5敲減hsa_circ_0000128對(duì)細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染相對(duì)應(yīng)干擾48 h后，克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，HGC-27和MGC-803中Si-circ組的克隆形成率[(11.57±1.724)%、(12.47±2.401)%]明顯低于Si-NC組[(32.53±3.250)%、(25.07±1.557)%]。加入miR-623 inhibitor后可逆轉(zhuǎn)抑制現(xiàn)象，SI-circ+miR-NC組克隆形成率為[(10.43±1.305)%、(12.50±1.400)%]明顯低于Si-circ+miR-inh組[(25.03±1.665)%、(19.63±1.955)%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明低表達(dá)的hsa_circ_0000128可抑制細(xì)胞增殖，敲低miR-623可挽救circRNA被敲減的情況進(jìn)而增加細(xì)胞功能。

2.6敲減hsa_circ_0000128對(duì)細(xì)胞遷移的影響通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)表明，SI-circ組較SI-NC組遷移明顯降低(P<0.05)。miRNA inhibitor干預(yù)后可減輕影響，說(shuō)明轉(zhuǎn)染si-circ-0000128可明顯降低胃癌細(xì)胞株的遷移能力，敲低miR-623可減輕相應(yīng)表現(xiàn)。見(jiàn)圖6，表3。

圖 6 敲減環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128將降低胃癌細(xì)胞遷移能力

表 3 不同干預(yù)組的胃癌細(xì)胞遷移數(shù)據(jù)比較

2.7熒光素酶結(jié)合靶點(diǎn)驗(yàn)證將hsa_circ_0000128-WT熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到miRNA的mimics中，與miR-NC相比，可顯著降低相對(duì)熒光素酶活性。Hsa_circ_000128-WT可以抑制miR-623熒光素酶活性，而突變型hsa_circ_0000128-Mut則對(duì)miR-623熒光素酶活性無(wú)明顯影響，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7，表4。

圖 7 hsa_circ_0000128與miR-623靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

表 4 熒光素酶驗(yàn)證靶點(diǎn)驗(yàn)證hsa_circ_0000128與miR-623關(guān)系

2.8hsa_circ_0000128通過(guò)miR-623靶向調(diào)節(jié)EIF4A1的表達(dá)通過(guò)Targetscan等數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)簡(jiǎn)單miR-623下游靶基因EIF4A1，見(jiàn)圖8。通過(guò)PCR驗(yàn)證EIF4A1在40對(duì)胃癌組織(7.627±2.146)及胃癌細(xì)胞株HGC-27、MGC-803(2.757±0.211、1.967±0.130)表達(dá)較癌旁組織(5.343±1.507)、正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1(1.020±0.125)中呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miR-623含量的增多會(huì)抑制EIF4A1的表達(dá)，見(jiàn)表5。使用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)敲減hsa_circ_0000128時(shí)，EIF4A1的含量下降，當(dāng)加入miR-623 inhibitor逆轉(zhuǎn)敲減circRNA情況時(shí)，EIF4A1的表達(dá)含量上升(P<0.01)，見(jiàn)圖9。綜上，hsa_circ_0000128通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-623促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞中EIF4A1的表達(dá)。

圖 8 miR-623與EIF4A1預(yù)測(cè)位點(diǎn)

表 5 胃癌細(xì)胞中miR-623含量對(duì)EIF4A1表達(dá)的影響

*P<0.05

3 討 論

盡管在胃癌相關(guān)研究方面有許多重大的進(jìn)展，胃癌的發(fā)病已經(jīng)下降，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家，但胃癌仍是世界上最普遍的癌癥之一[11]。胃癌具有起病隱匿、早期易漏診、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[12]。為了改善胃癌治療的預(yù)后，迫切需要敏感、較特異的分子標(biāo)志物及相關(guān)治療靶點(diǎn)，以獲得更好的診療效果[13]。circRNA是一種新的非編碼RNA，以往的眾多研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在眾多癌癥當(dāng)中發(fā)揮相關(guān)作用，但其生物學(xué)機(jī)制仍不清楚，如hsa_circ_0000096與胃癌細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)[14-15]。不同的circRNA在不同的腫瘤中含量也不同，通過(guò)過(guò)表達(dá)或者敲減相關(guān)circRNA導(dǎo)致不同腫瘤的生物學(xué)特性發(fā)生改變，從而影響其發(fā)生增殖、凋亡等不同變化，如hsa_circ_0001649 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與胃癌病理分化程度顯著相關(guān)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)5組胃癌標(biāo)本及其相對(duì)應(yīng)癌旁組織進(jìn)行高通量測(cè)序，篩選出中高表達(dá)的hsa_circ_0000128進(jìn)行研究。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)也可證實(shí)hsa_circ_0000128在胃癌組織及相關(guān)胃癌細(xì)胞株中高表達(dá)。由此表明環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128在胃癌中可能發(fā)揮的是原癌基因的作用。

Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA CircNRIP1在胃癌中上調(diào)AKT1蛋白從而增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖的能力，通過(guò)siRNA敲減CicrRNA后，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞株的增殖、遷移及侵襲能力下降。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)外泌體中環(huán)狀RNA CircSHKBP1通過(guò)影響熱休克蛋白HSP90從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。本研究使用小干擾RNA干擾環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128使其含量變化從而影響胃癌細(xì)胞株HGC-27、MGC-803的生物學(xué)特性的變化。下調(diào)環(huán)狀RNA后可明顯觀察到胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等能力下降，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。由此可見(jiàn)，hsa_circ_0000128可能成為胃癌的診斷及治療新的靶點(diǎn)，但其機(jī)制需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，多數(shù)研究證明了circRNA與miRNA存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制關(guān)系，circRNA可以充當(dāng)miRNA海綿的作用[21]。Shi等[22]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA LPAR3海綿miRNA-198促進(jìn)食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移。Shang等[23]發(fā)現(xiàn)外泌體中circPACRGL通過(guò)miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)hsa_circ_0000128可能影響miRNA的靶點(diǎn)及其相對(duì)應(yīng)的蛋白EIF4A1。

EIF4A1為真核翻譯起始因子4A1,EIF4A1基因在胃癌細(xì)胞株中明顯高表達(dá)于正常胃上皮細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，在胃癌中存在促瘤效應(yīng)，EIF4A1的減少將導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的凋亡[24]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減hsa_circ_0000128后胃癌細(xì)胞內(nèi)EIF4A1含量也隨之下降，導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白BCL-2及Bax的含量改變，其可能是導(dǎo)致胃癌凋亡的關(guān)鍵因素。

因此，本研究說(shuō)明hsa_circ_0000128的高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，抑制細(xì)胞的凋亡。其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-623上調(diào)EIF4A1影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，降低環(huán)狀RNA的含量，胃癌細(xì)胞株HGC-27、MGC-803的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)也發(fā)生改變。本文尚可加大研究患者樣本數(shù)量，分類(lèi)研究，同時(shí)還可以檢測(cè)術(shù)前、術(shù)后、及術(shù)后隨訪患者血清中環(huán)狀RNA的變化，完善hsa_circ_0000128在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起到調(diào)控的作用,發(fā)掘其成為新的胃癌診療標(biāo)志物的潛力。