羅瑩瑩，盧其騰，李俊紅，周 輝，張筱楠，龐筱安，韋智曉

0 引 言

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占所有癌癥的3.1%[1-3]。目前，手術(shù)+131I+TSH抑制替代治療已成為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC)的主要治療手段，據(jù)SEER數(shù)據(jù)庫顯示美國甲狀腺癌患者的5年生存率高達(dá)98.1%[4]。然而，約5%的患者應(yīng)用131I治療的效果較差，其10年生存率約為10%[5-7],這部分患者稱為碘難治性分化型甲狀腺癌(radioiodine refractory-differentiated thyroid cancer, RAIR-DTC)[5, 8-9]。研究表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，自噬在癌癥發(fā)生發(fā)展的不同階段起著動態(tài)的抑癌或促癌作用[10-12]。自噬相關(guān)蛋白 (autophagy-related protein, Atg)是一類自噬組成蛋白, 參與調(diào)節(jié)自噬起始和延伸等過程。Atg14定位在自噬體上，是III型磷脂酰肌醇-3激酶復(fù)合物I(PI3K-CI)的核心成分，通過將其定位于自噬小體形成的位置，指導(dǎo)復(fù)合物在自噬中發(fā)揮作用[13-14]。已有研究證明，下調(diào)Atg14可以促進(jìn)骨髓瘤、卵巢癌和骨肉瘤細(xì)胞的凋亡[14-16]；然而，它在DTC的作用仍有待探索。本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法(Immunohistochemistry, IHC)檢測Atg14在RAIR-DTC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平，探討其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料回顧性收集2013年1月至2019年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科72例行甲狀腺癌手術(shù)治療的DTC患者。其中男24例，女48例，年齡13～72歲，平均年齡(37.0±13.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診為DTC；②在我院行甲狀腺切除術(shù)；③至少接受2次131I治療；④無放化療史；⑤無其他惡性腫瘤病史；⑥臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①抗甲狀腺球蛋白抗體(antithyroglobulin antibody,TgAb)陽性；②妊娠期或哺乳期婦女；③計劃6個月內(nèi)妊娠者。本研究獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)[NO.2022-KY-E(194)]，患者均簽署知情同意書。

1.2分組根據(jù)治療效果分為RAIR-DTC組(碘難治患者，n=37)和NRAIR-DTC組(非碘難治患者，n=35)。RAIR-DTC的診斷標(biāo)準(zhǔn)為在無外源性碘負(fù)荷干擾的情況下，TSH刺激狀態(tài)(>30mIU/L)時，參照文獻(xiàn)[5]的方法出現(xiàn)下列情形之一即可界定為RAIR-DTC：①轉(zhuǎn)移灶在清甲成功后的首次131I治療后全身顯像中即表現(xiàn)為不攝碘，致其無法從后續(xù)的131I治療中獲益。②原本攝碘的功能性轉(zhuǎn)移灶經(jīng)131I治療后逐漸喪失攝碘能力。③部分轉(zhuǎn)移灶攝碘，而部分轉(zhuǎn)移灶不攝碘。④攝碘轉(zhuǎn)移灶在經(jīng)過多次131I治療后，雖然保持?jǐn)z碘能力但仍在1年內(nèi)出現(xiàn)病情進(jìn)展。NRAIR-DTC的判斷標(biāo)準(zhǔn)包括治愈和好轉(zhuǎn)；治愈：無臨床證據(jù)支持患者為帶瘤狀態(tài)；即患者已達(dá)到臨床無瘤生存狀態(tài)；好轉(zhuǎn)：影像學(xué)提示復(fù)發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶縮小、數(shù)量減少，血清甲狀腺球蛋白水平下降。

1.3免疫組化染色手術(shù)切除的DTC組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋后切片，采用IHC鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase, SP)法檢測Atg14表達(dá)情況，IHC染色步驟按說明書進(jìn)行。Atg14抗體購于GeneTex公司，通用SP法試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。由兩位以上副主任病理科醫(yī)師讀片并分析IHC染色結(jié)果。在高倍鏡下每張切片隨機(jī)攝取6個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，計算每張切片的平均光密度值(Average Optical Density, AOD)。

1.4血清學(xué)檢測所有患者131I治療前采集血液樣本，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測sTg水平，檢測范圍為0～462.00 μg/L，超出此范圍記為462.00 μg/L。計算sTg同比下降率，公式如下：

sTg同比下降率=(sTgbaseline-sTg)/sTgbaseline×100%

sTgbaseline為首次131I治療前的sTg，sTg為再次131I治療前的sTg。

1.5131I全身顯像半定量分析患者均于131I治療后第5天行131I全身顯像。利用SPECT Region-of-interest軟件對患者治療性131I全身顯像中病灶的131I攝取勾畫感興趣區(qū)(region of interest，ROI)進(jìn)行半定量分析，公式如下：

病灶靶區(qū)攝取量/本底攝取量(tumor/background，T/B)=病灶最大放射性計數(shù)/本底最大放射性計數(shù)

其中本底攝取量以正面額骨的攝取量為準(zhǔn)。為了避免殘余甲狀腺組織對病灶131I攝取的影響，我們選取兩次131I治療后的全身掃描圖像進(jìn)行分析，分別記錄為T1/B1、T2/B2。本研究中，同一患者有多個病灶時選取病灶最大放射性計數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后組織標(biāo)本中癌組織Atg14的表達(dá)情況131I治療前，RAIR-DTC組癌組織中Atg14相對表達(dá)量(0.079±0.020)較NRAIR-DTC組(0.034±0.006)明顯升高(P=0.001)。免疫組織化學(xué)染色情況如下圖1所示，棕黃色染色為Atg14染色陽性。

a:RAIR-DTC組;b:NRAIR-DTC組

2.2Atg14的診斷價值ROC曲線分析結(jié)果顯示：Atg14的AUC為0.995，診斷閾值為0.047，靈敏性為94.6%，特異性為100%，95%CI：0.987～1.000(P<0.01)。提示Atg14可成為碘難治性分化型甲狀腺癌的診斷生物標(biāo)志物。見圖2。

圖 2 患者Atg14水平的ROC曲線

2.3Atg14表達(dá)量與血清sTg、影像學(xué)T/B的關(guān)系兩次131I治療前，與NRAIR-DTC組血清學(xué)sTg水平相比，RAIR-DTC組更高(P<0.05)。RAIR-DTC組sTg同比下降率分別為(0.114±0.759)和(0.900±0.191)，明顯低于NRAIR-DTC組(P<0.05)。兩次131I治療后，RAIR-DTC組T1/T2均高于NRAIR-DTC組(P<0.05)。見表1。

表 1 兩組患者癌組織中sTg及T/B水平的比較[M(P25,P75)]

2.4RAIR-DTC患者Atg14表達(dá)水平與sTg同比下降率、T/B的相關(guān)性分析經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，RAIR-DTC組癌組織中Atg14的表達(dá)量與首次sTg、再次sTg、血清sTg同比下降率、T1/B1、T2/B2均無相關(guān)性(r=-0.13、-0.09、0.12、-0.08、-0.20，P>0.05)。

2.5RAIR-DTC患者Atg14表達(dá)水平與其臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)tg14表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤直徑、有無局部浸潤、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移部位、分期、危險度分層均無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表 2 RAIR-DTC組癌組織Atg14表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

絕大多數(shù)DTC患者經(jīng)甲狀腺切除術(shù)+131I治療+激素抑制替代治療預(yù)后良好，但部分患者會發(fā)展為RAIR-DTC，其治療一直是核醫(yī)學(xué)亟待攻克的難題。因此，能夠盡早診斷RAIR-DTC，對識別高風(fēng)險患者及個體化治療具有重要的臨床價值。

2015年ATA指南提出，術(shù)后Tg是持續(xù)性或復(fù)發(fā)性疾病的獨立預(yù)測因子[5]。對于RAIR-DTC患者，由于“清甲和/或清灶”治療無效，甲狀腺病灶組織或轉(zhuǎn)移病灶一直存在，導(dǎo)致Tg水平處于較高的狀態(tài)，本研究中131I治療前，RAIR-DTC組血清sTg水平相對更高，且sTg同比下降率明顯低于NRAIR-DTC組的結(jié)論與之相一致。131I全身顯像是臨床上用于探查不攝碘病灶最有效的手段，在本研究中，RAIR-DTC組T1/B1低于NRAIR-DTC組，而T2/B2高于NRAIR-DTC組，表明RAIR-DTC患者再次接受131I治療時病灶攝取131I能力明顯降低，即使病灶攝取131I，但可能由于對射線的敏感性較差，導(dǎo)致病灶輻射吸收劑量不足，進(jìn)而致使131I對病灶治療無效。由于Tg值的測定受到多種內(nèi)/外在因素的顯著影響，且部分腫瘤細(xì)胞去分化、Na/I轉(zhuǎn)運能力失衡影響131I的攝取而導(dǎo)致131I全身顯像出現(xiàn)假陰性結(jié)果從而影響判斷，故尚不能將sTg、T/B作為獨立預(yù)測RAIR-DTC的診斷指標(biāo)，兩者結(jié)合可能會有更好的診斷效果。因此，為了更早期的預(yù)測RAIR-DTC，尋找更為敏感的分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

自噬是一種II型程序性細(xì)胞死亡，在大多數(shù)情況下，自噬促進(jìn)腫瘤發(fā)生，自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的潛在能力使其成為癌癥的治療靶點[17]。III型磷脂酰肌醇-3激酶復(fù)合物(PI3KC3)是自噬的核心復(fù)合物，其主要由含有Atg14的PI3K-CI以及PI3K-CII組成，通過產(chǎn)生 PI3P 促進(jìn)自噬的啟動和進(jìn)展，PI3P 正調(diào)控自噬體的形成，PI3KC3通過形成蛋白質(zhì)復(fù)合物和直接翻譯后修飾調(diào)節(jié)自噬[18-19]。自噬相關(guān)蛋白Atg14又稱Atg14L/Barkor，是PI3KC3的重要組成部分，其在自噬中至少有兩種功能：①作為連接物形成PI3K-CI，作為吞噬細(xì)胞成核的關(guān)鍵成分。②通過將PI3K-CI靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來引導(dǎo)其在自噬中發(fā)揮作用[20]。Atg14的Barkor/Atg14(L)自噬體靶向序列/BATS結(jié)構(gòu)域是將PI3KC3靶向吞噬細(xì)胞和/或omegasome膜以及啟動自噬體形成所必需的。Atg14 作為一種自噬相關(guān)蛋白，已被證明通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，Atg14在肝癌(HCC)組織樣本和細(xì)胞中均異常高表達(dá)，其與HCC患者的腫瘤分期相關(guān)；同時通過體外細(xì)胞實驗，發(fā)現(xiàn)抑制Atg14水平可減弱HCC細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞侵襲能力[21]。本研究通過IHC法分析腫瘤組織中Atg14表達(dá)水平與RAIR-DTC發(fā)生的相關(guān)性結(jié)果顯示，RAIR-DTC組患者Atg14表達(dá)水平明顯高于NRAIR-DTC組，診斷閾值為0.047，靈敏性為94.6%，特異性為100%，表明癌組織中Atg14的高表達(dá)可能與DTC向RAIR-DTC進(jìn)展有關(guān)，其機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究證明。本研究中，RAIR-DTC組的一般臨床資料與Atg14的表達(dá)關(guān)系差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此尚不能得出Atg14與腫瘤侵襲性存在關(guān)聯(lián)。

綜上所述，RAIR-DTC患者癌組織中Atg14的表達(dá)水平明顯高于NRAIR-DTC組，其可能是診斷DTC向RAIR-DTC進(jìn)展的重要腫瘤標(biāo)志物，有助于早期診斷RAIR-DTC，為RAIR-DTC患者提供更精準(zhǔn)的治療。