王賽 劉曉燕

(1 青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266071；2 山東省青島衛(wèi)生學校；3 青島市第六人民醫(yī)院)

白細胞介素12(IL-12)是一種多效性細胞因子，主要發(fā)揮免疫刺激作用，已被證明可以調(diào)節(jié)腫瘤治療中的先天性(自然殺傷細胞)和適應性(細胞毒性T淋巴細胞)免疫[1]。研究證明IL-12在血液腫瘤中的抗腫瘤作用高于實體瘤，因為實體瘤往往在腫瘤組織內(nèi)部形成免疫抑制微環(huán)境，使IL-12難以發(fā)揮作用[2]。目前實體瘤的常用治療手段是手術切除，但部分患者手術后可能殘留微小瘤灶[3]，患者術后多需進行放化療，以消除殘余的微小瘤灶，但現(xiàn)有的放化療手段往往毒副反應較大，對患者造成較大的負擔[4]，低毒性的免疫治療成為研究的熱點。由于實體瘤切除后破壞了腫瘤組織微環(huán)境，免疫細胞能夠進入腫瘤組織發(fā)揮殺傷作用，其中IL-12作為免疫刺激因子，可以對殘余瘤灶的清除發(fā)揮積極作用[5]?；谏鲜霰尘埃狙芯繀⒖枷嚓P文獻[6]，建立小鼠術后殘瘤模型，用以評價IL-12作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

重組鼠源IL-12(rmIL-12)購自美國Peprotech公司(編號：210-12)；注射用長春新堿購自浙江海正藥業(yè)有限公司；肉瘤細胞S180、人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC由青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈；鼠源性腹腔巨噬細胞Ana-1、人源性肺癌細胞A549購自中國科學院上海細胞研究所。RPMI 1640、高糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2 實驗動物

選取4～6周齡雌性Nu/Nu裸鼠55只，體質(zhì)量18.0～22.0 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于IVC籠中，喂飼專門配制的消毒飼料，自由飲用純凈水。4～6周齡雌性BALB/C小鼠55只，體質(zhì)量18.0～21.0 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養(yǎng)于SPF級動物房中，喂飼普通飼料。兩種小鼠均置于溫度25 ℃、相對濕度40%～70%的動物實驗室內(nèi)，每日光照12 h。

1.3 小鼠殘瘤模型的建立

肉瘤細胞S180在含體積分數(shù)0.10胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次,細胞達對數(shù)生長期后收集到離心管中，以1 000 r/min離心后以生理鹽水重懸，將約5.0×106個細胞皮下注射到每只BALB/C小鼠和裸鼠右前肢腋部[7]。待腫瘤體積生長達到500～800 mm3時[8]，將小鼠麻醉后固定于手術臺上。在腫瘤組織下方剪開直徑約0.5 cm的創(chuàng)口，切除部分腫瘤組織，殘余體積大約為50 mm3，然后縫合皮膚[9]。

1.4 小鼠的分組和處理

建立殘瘤模型術后24 h，將BALB/C小鼠隨機分為5組，每組11只，模型對照組(A組)右前肢腋部皮下注射0.1 mL生理鹽水，陽性對照組(B組)尾靜脈注射長春新堿溶液10 mg/kg，IL-12低、中、高劑量組(C～E組)分別右前肢腋部皮下注射25、50、100 ng/kg的rmIL-12，均每2 d給藥1次，共給藥15 d，每2 d測量1次小鼠體質(zhì)量。術后24 h，裸鼠隨機分為F～J組，每組11只，分組方式及每組小鼠的處理方式同BALB/C小鼠。觀察受試小鼠進食、飲水及活動情況。

1.5 IL-12對各組小鼠主要臟器和腫瘤組織的影響

末次給藥24 h后麻醉各組裸鼠，處死后剝離腫瘤組織并稱質(zhì)量。于末次給藥24 h之后麻醉各組BALB/C小鼠，腹主動脈取血后處死，剝離腫瘤組織并稱質(zhì)量，部分腫瘤組織研磨成勻漿，離心后取上清液，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；取BALB/C小鼠心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺及部分腫瘤組織于10 g/L多聚甲醛中固定48 h以后，沖水過夜，按照不同方案梯度脫水[10]，石蠟包埋[11]，切片后置于55 ℃烘箱中烘烤3 h，按照蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號D006-1-1)說明書要求，將各組織切片分別進行脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色，最后封片鏡檢。

1.6 細胞培養(yǎng)

將鼠源腹腔巨噬細胞Ana-1(巨噬細胞組)、人源性肺癌細胞A549(腫瘤細胞組)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC(正常細胞組)分別置于含體積分數(shù)為0.10胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基、RPIM 1640培養(yǎng)基和RPIM 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2細胞培養(yǎng)箱中行無菌培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，細胞達到對數(shù)生長期后用于后續(xù)實驗。

1.7 MTT法檢測細胞的增殖能力

取處于對數(shù)生長期的上述三組細胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔3 000個細胞，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每組細胞均依次加入0、1、10、100、1 000、10 000 μg/L濃度的rmIL-12，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每個濃度設置3個復孔。取巨噬細胞組的細胞上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆?，腫瘤細胞組和正常細胞組細胞棄去培養(yǎng)基。上述三種細胞分別用PBS輕柔沖洗3次，每孔加入100 μL新鮮配制的MTT工作液(碧云天生物技術有限公司，貨號C0009S)，37 ℃孵育4 h，每孔加入200 μL DMSO，酶標儀測定570 nm波長處各孔的吸光度(A)值[12]。

1.8 ELISA法檢測細胞因子γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度

BALB/C小鼠血清稀釋20倍，BALB/C小鼠腫瘤組織上清液稀釋10倍，按小鼠IFN-γ試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司，貨號CME0003)說明書要求進行IFN-γ檢測。將巨噬細胞組細胞上清液稀釋2倍后，按照小鼠TNF-α ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司，貨號CME0004)說明書的要求檢測TNF-α的水平。實驗重復3次，結果取均值。

2 結 果

2.1 IL-12對小鼠術后殘余腫瘤生長的影響

給藥15 d后，A～J組小鼠殘余腫瘤質(zhì)量分別為(2.14±0.44)、(0.86±0.27)、(1.17±0.32)、(1.18±0.45)、(1.01±0.28)、(2.83±0.58)、(1.07±0.26)、(1.96±0.65)、(1.74±0.53)、(1.98±0.64)g，析因設計方差分析結果顯示，小鼠種類對殘余腫瘤質(zhì)量有影響(F小鼠種類=52.75，P<0.05)，分組對殘余腫瘤質(zhì)量有影響(F分組=31.08，P<0.05)，小鼠種類和分組無交互作用(P>0.05)。單獨效應結果顯示，A～E組各組間比較差異具有顯著意義(F=20.35,P<0.05)，其中A組與B～E組間比較差異具有顯著性(q=8.83～11.83，P<0.05)，B～E組間差異無顯著性(P>0.05)。F～J組各組間比較差異具有顯著性(F=12.94，P<0.05)，其中F與G～J組、G組與H～J組間比較差異均有顯著性(q=5.12～10.62，P<0.05)，H～J組組間比較差異無顯著意義(P>0.05)。除A組外，BALB/C小鼠相應時間點殘余腫瘤質(zhì)量都低于裸鼠(F=7.92～24.07，P<0.05)。

2.2 IL-12對BALB/C小鼠體質(zhì)量的影響

重復測量設計的方差分析結果顯示，分組對小鼠體質(zhì)量有明顯影響(F分組=7.46，P<0.05)，時間、時間和分組的交互作用對小鼠的體質(zhì)量無明顯影響(P>0.05)，單獨效應結果顯示，不同時間點各組小鼠體質(zhì)量比較，差異均具有顯著性(F=2.81～5.48，P<0.05)。見表1。

2.3 IL-12對BALB/C小鼠主要臟器的影響

HE染色結果顯示，與A組比較，B～E組的BALB/C小鼠肺、脾、肝、腎、心等主要臟器未見明顯病理變化(圖1)。

2.4 IL-12對BALB/C小鼠腫瘤免疫微環(huán)境影響

A～E組BALB/C小鼠血清中IFN-γ的濃度分別為(40.31±8.55)、(41.34±6.42)、(38.32±12.22)、(47.72±14.84)、(48.44±19.81)ng/g，各組之間比較，差異不具有顯著性(P>0.05)。A～E組BALB/C小鼠的腫瘤組織當中IFN-γ濃度分別為(117.48±20.75)、(145.71±55.64)、(240.30±37.06)、(321.50±68.40)、(305.08±72.52)ng/g，各組間比較，差異有顯著性(F=31.32，P<0.05)，其中A組與C～E組、B組與C～E組、C組與D組比較，差異有顯著性(q=4.94～12.42，P<0.05)。

A～E組BALB/C小鼠腫瘤組織HE染色結果顯示，與A組比較，B～E組腫瘤組織切片中均出現(xiàn)大量空泡；與A組和B組相比，C～E組小鼠腫瘤組織中炎性浸潤區(qū)域明顯增多(圖2)。

2.5 IL-12對巨噬細胞的影響

MTT檢測結果顯示，不同濃度rmIL-12處理的巨噬細胞組細胞增殖能力比較差異具有顯著性(F=111.30，P<0.05)。其中0 μg/L與1、10、100、1 000、10 000 μg/L組間比較，1 μg/L與10、100、1 000、10 000 μg/L組間比較，10 μg/L與100、1 000、10 000 μg/L組間比較，差異均有顯著性(q=8.63～24.42，P<0.05)。不同濃度rmIL-12處理的腫瘤細胞組和正常細胞組細胞增殖能力比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

表1 IL-12對BALB/C小鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effect of IL-12 on the body weight of BALB/C mice(m/g, n=11,

A～E:A～E組，HE染色，100倍圖1 各組BALB/C小鼠主要臟器HE染色結果Fig.1 HE staining results of the main visceral organs of BALB/C mice in each group

A～E:A～E組，黑色箭頭指向炎性浸潤區(qū)域，HE染色，100倍圖2 BALB/C小鼠腫瘤組織HE染色結果Fig.2 HE staining results of the tumor tissue of BALB/C mice

2.6 IL-12對巨噬細胞TNF-α分泌的影響

經(jīng)ELISA方法檢測后結果顯示,0、1、10、100、1 000、10 000 μg/L濃度的rmIL-12處理后，巨噬細胞組中TNF-α濃度分別為(27.48±6.91)、(59.59±12.36)、(73.14±6.52)、(97.01±7.65)、(126.21±9.30)、(128.23±17.07) ng/g，不同組間比較差異具有顯著的意義(F=55.11，P<0.05)。其中0 μg/L與1、10、100、1 000、10 000 μg/L組間比較，1 μg/L與100、1 000、10 000 μg/L組間比較，10 μg/L與1 000、10 000 μg/L組間比較，100 μg/L與1 000、10 000 μg/L組間比較，差異均有顯著性(q=4.49～18.93，P<0.05)。

表2 不同濃度IL-12對3組細胞系增殖能力的影響Tab.2 Effect of different concentrations of IL-12 on the proliferative capacity of the three cell lines (n=3,

3 討 論

腫瘤患者在行手術切除實體瘤后，破壞了腫瘤微環(huán)境，影響免疫細胞功能，造成機體免疫功能下降；另一方面，手術也對腫瘤造成刺激，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，且由于機體免疫功能的下降，殘余腫瘤的生長速度更快。本實驗建立小鼠術后殘瘤模型，經(jīng)細胞因子藥物IL-12治療后，探討IL-12通過免疫調(diào)節(jié)作用抑制腫瘤生長的作用及可能機制。

皮下移植瘤模型是目前腫瘤藥物體內(nèi)研究的常用模型，一般是將腫瘤細胞注射到小鼠皮下或直接移植腫瘤組織，但這種模型存在忽視腫瘤微環(huán)境的缺陷[13]。本實驗在皮下移植瘤的基礎上，切除部分腫瘤組織后縫合皮膚，建立手術后殘瘤模型，以更好地研究IL-12對腫瘤微環(huán)境的影響。本研究結果顯示，各組BALB/C小鼠體質(zhì)量隨時間沒有發(fā)生明顯變化，而不同時間點各組小鼠體質(zhì)量有顯著差異；另外與模型對照組(A、F組)比較，rmIL-12低、中、高給藥組(C～E組、H～J組)均顯著降低BALB/C小鼠與裸鼠殘余腫瘤質(zhì)量，提示IL-12對兩種小鼠均具有抑制術后殘瘤生長的作用。本研究結果還顯示，除模型對照組外，BALB/C小鼠殘余腫瘤質(zhì)量均明顯低于裸鼠，提示IL-12對缺乏胸腺T細胞的裸鼠抗腫瘤作用低于BALB/C小鼠，說明IL-12發(fā)揮抗腫瘤的作用可能需要有T細胞的參與，在IL-12抗腫瘤時，T細胞扮演著重要的角色，與既往文獻報道的結果一致[14]。陳麗娜等[15]指出IL-12通過誘導T細胞產(chǎn)生IFN-γ從而發(fā)揮抗腫瘤作用，IFN-γ可以激活免疫細胞對腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用，也可以直接作用于腫瘤細胞，促進腫瘤細胞凋亡[16]。本研究中檢測了各組BALB/C小鼠腫瘤組織和血清中IFN-γ的濃度變化，結果顯示IL-12各給藥組腫瘤組織中的IFN-γ濃度明顯升高，但血清中IFN-γ的濃度無顯著變化，提示IL-12可能只針對腫瘤組織發(fā)揮作用，而不會引起全身反應。由此推測術后殘余腫瘤組織的免疫原性較高，在腫瘤組織附近聚集了較多的免疫細胞，IL-12主要通過免疫細胞發(fā)揮作用，因此可以靶向免疫原性高的腫瘤組織，且不易引起全身反應，并減少了毒副作用。本研究對A～E組BALB/C小鼠主要臟器(肺、脾、肝、腎、心)進行HE染色后結果顯示，與A組比較，B～E組小鼠的主要臟器均未見明顯病理變化，提示IL-12對BALB/C小鼠主要臟器無明顯影響，具有良好的臨床應用價值。本研究對BALB/C小鼠的腫瘤組織進行了HE染色，結果顯示，與A組相比較，各給藥組腫瘤組織切片中均出現(xiàn)大量空泡，說明IL-12對腫瘤細胞產(chǎn)生了一定的殺傷作用，但A組和B組腫瘤組織的炎癥浸潤區(qū)域較小且不明顯，而IL-12各給藥組炎性浸潤區(qū)域則明顯增多，進一步說明IL-12可能是通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，促進腫瘤組織炎癥反應，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。

本研究進一步對鼠源腹腔巨噬細胞Ana-1、人源性肺癌細胞A549和人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC在體外以不同濃度的rmIL-12進行處理，結果顯示rmIL-12濃度依賴性促進巨噬細胞Ana-1細胞增殖，但對肺癌細胞A549細胞和內(nèi)皮細胞HUVEC細胞增殖沒有明顯影響，提示IL-12可促進巨噬細胞增殖，提高免疫反應，而不是直接對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用，并且IL-12對正常細胞無明顯影響。再進一步通過ELISA方法檢測不同濃度IL-12對巨噬細胞TNF-α分泌的影響，結果顯示，rmIL-12可促進巨噬細胞分泌TNF-α，且隨著rmIL-12濃度升高，巨噬細胞中TNF-α濃度增加。TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的主要促炎細胞因子，參與正常炎癥反應和免疫反應，在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。綜合本研究上述結果提示，IL-12可通過促進巨噬細胞分泌TNF-α發(fā)揮抗腫瘤的作用。

綜上所述，本研究表明，IL-12對腫瘤細胞本身不具有直接殺傷作用，其可能是通過作用于T細胞和巨噬細胞等免疫細胞，促進TNF-α、IFN-γ等腫瘤殺傷因子的分泌而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。本研究結果為IL-12在腫瘤中的作用提供了實驗依據(jù)，其在抗腫瘤中的應用價值值得進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均嚴格按照國家動物衛(wèi)生研究院《實驗動物飼養(yǎng)與使用規(guī)定》和青島大學倫理委員會的指導進行(動物福利保障編號：140027)。

EthicsApprovalandAnimalRight： All animal experiments protocols in this study were conducted in strict accordance with the Provisions for the Feeding and Use of Laboratory Animals of the National Institute of Animal Health and the guidelines of The Ethics Committee of Qingdao University (Animal Welfare Guarantee Number: 140027).

作者貢獻：王賽參與了研究設計；王賽和劉曉燕參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byWANGSai. The manuscript was drafted and revised byWANGSaiandLIUXiaoyan. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.