陳成 項(xiàng)蕭楠 劉治坤 王建國(guó) 徐驍

(1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬湖州醫(yī)院肝膽胰外科，浙江 湖州 313000；2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院;3 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科;4 浙江省腫瘤融合研究與智能醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;5 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院肝膽胰外科)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，5年總體生存率不足20%[1]。手術(shù)切除是HCC的主要治療手段[2]，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，嚴(yán)重影響患者預(yù)后生存。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)HCC術(shù)后患者預(yù)后并及時(shí)早期干預(yù)，可以有效延長(zhǎng)HCC患者的生存時(shí)間。微血管侵犯(MVI)是HCC主要轉(zhuǎn)移方式之一[3-4]，是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素，常常與預(yù)后不良相關(guān)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)FAM123B可通過(guò)Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移[7]。另有研究顯示CR1和NFκB/p65可形成促進(jìn)HCC侵襲的正反饋環(huán)[8]，這些因子也許可以作為預(yù)測(cè)切除術(shù)后HCC復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物，但目前仍缺乏具有較高靈敏度和特異度的MVI分子標(biāo)志物的報(bào)道，因此探索新型HCC的MVI標(biāo)志物，對(duì)其術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)警具有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)分析借助于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記及同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)，目前已廣泛用于新的腫瘤生物標(biāo)志物研究探索之中[9-10]。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析MVI相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，探討基于蛋白質(zhì)組學(xué)的HCC復(fù)發(fā)預(yù)警模型對(duì)HCC患者預(yù)后預(yù)測(cè)的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 HCC患者腫瘤組織樣本的收集和蛋白質(zhì)組學(xué)分析

收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院術(shù)后病理確診為HCC患者的腫瘤組織樣本6例，其中MVI陽(yáng)性患者3例，MVI陰性患者3例，MVI的診斷依據(jù)術(shù)后病理報(bào)告結(jié)果。樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)和分析委托北京博奧生物科技有限公司進(jìn)行，按照串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽試劑盒(90064,Thermo公司，美國(guó))的說(shuō)明進(jìn)行樣品制備和標(biāo)記。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析獲得腫瘤組織中蛋白的平均表達(dá)水平，將P<0.05及Log2差異倍數(shù)>1.20或<0.83蛋白質(zhì)定義為MVI陽(yáng)性與陰性腫瘤組織的顯著差異表達(dá)蛋白。

1.2 顯著差異表達(dá)蛋白與HCC患者預(yù)后相關(guān)性的分析

HCC患者臨床信息和腫瘤組織與癌旁組織的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cbioportal.org/)[11]下載，隨后使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)[12]分析顯著差異表達(dá)蛋白在基因表達(dá)水平與HCC患者生存預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 HCC組織芯片制作

收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2015年1月—2018年10月病理確診為HCC患者的腫瘤組織及其癌旁正常組織樣本200例，委托上海芯超生物科技有限公司制作組織芯片并命名為T(mén)MA-1，同時(shí)收集這200例HCC患者的生存信息。

1.4 顯著差異表達(dá)蛋白的免疫反應(yīng)評(píng)分測(cè)定及其與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性分析

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)顯著差異表達(dá)蛋白在TMA-1中的表達(dá)情況，按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒的操作要求對(duì)TMA-1進(jìn)行染色。將4 μm組織芯片TMA-1徹底脫蠟，并在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行熱抗原修復(fù)。然后在室溫下采用0.5%過(guò)氧化氫孵育20 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用正常山羊血清在37 ℃下阻斷40 min，然后與適當(dāng)稀釋的一抗在4 ℃下孵育18 h。抗體孵育后，用TBST緩沖液沖洗3次(每次5 min)。然后，用HRP偶聯(lián)二抗(購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)ZSGB-Bio公司)在37 ℃下孵育30 min。TBST徹底清洗后，對(duì)載玻片進(jìn)行DAB染色和蘇木精重新染色。用相同稀釋倍數(shù)的鼠或兔IgG替代一抗獲得陰性對(duì)照切片。

通過(guò)半定量方法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS)[13]。IRS為細(xì)胞染色強(qiáng)度(0～3分)與陽(yáng)性百分比(0～4分)的乘積[14]。IRS大于6分被定義為蛋白高表達(dá)，采用電話隨訪獲取200例HCC患者預(yù)后信息，采用Kaplan-Meier方法分析顯著差異表達(dá)蛋白與HCC患者預(yù)后相關(guān)性。

1.5 復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖模型構(gòu)建及臨床驗(yàn)證

對(duì)TMA-1中200例HCC患者的臨床病理特征基線和顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行單因素Cox回歸分析，對(duì)單因素分析中P<0.05的因素進(jìn)行多因素COX回歸分析，獲得HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。采用所有獨(dú)立危險(xiǎn)因素構(gòu)建復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖，并根據(jù)列線圖計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)為截?cái)嘀祵⒒颊叻譃楦唢L(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，比較兩組的生存預(yù)后情況。采用自助抽樣驗(yàn)證方法對(duì)復(fù)發(fā)預(yù)警模型進(jìn)行臨床驗(yàn)證。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用R軟件(版本3.6.3)和SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析。采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。采用一致性指數(shù)(C-index)評(píng)價(jià)列線圖的預(yù)測(cè)能力，校準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)列線圖的預(yù)測(cè)符合度，采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)列線圖模型的預(yù)后預(yù)測(cè)效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC患者腫瘤組織樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，與MVI陰性腫瘤組織對(duì)比，MVI陽(yáng)性腫瘤組織中顯著上調(diào)蛋白16個(gè)，顯著下調(diào)蛋白23個(gè)。

2.2 顯著差異表達(dá)蛋白與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性分析

通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載HCC患者數(shù)據(jù)，采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析上述39個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白在HCC組織與癌旁組織中基因表達(dá)水平的差異，并進(jìn)一步分析這些顯著差異表達(dá)蛋白的基因表達(dá)水平與HCC患者預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果顯示在HCC組織中共7個(gè)蛋白表達(dá)基因(U2SURP、RFC4、NUTF2、BCAP31、CRELD2、EEF1E1和GBA2)顯著上調(diào)，3個(gè)蛋白表達(dá)基因(ADH4、HRG、FABP1)顯著下調(diào)。進(jìn)一步生存分析的結(jié)果顯示，HCC組織之中ADH4和HRG高表達(dá)的患者的總生存率(OS)顯著高于低表達(dá)的患者(P<0.05)，而HCC組織中U2SURP、RFC4以及NUTF2高表達(dá)的患者OS顯著低于低表達(dá)的患者(P<0.05)，上述5個(gè)顯著差異性表達(dá)蛋白的基因表達(dá)水平與患者的預(yù)后具有密切相關(guān)。

2.3 顯著差異表達(dá)蛋白的IRS及其與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性分析

采用免疫組織化學(xué)方法在TMA-1中對(duì)上述5個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行染色，結(jié)果顯示(表1)，U2SURP、RFC4和NUTF2在腫瘤組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織(t=7.17～15.18，P<0.001)，而ADH4的表達(dá)顯著低于癌旁組織(t=-19.18，P<0.001)。HRG在腫瘤組織和癌旁組織中陽(yáng)性百分比較低，分別為5%和4%，故后續(xù)沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。

采用Kaplan-Meier方法對(duì)上述4個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白與HCC患者預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，腫瘤組織中ADH4高表達(dá)患者的OS和無(wú)復(fù)發(fā)生存率(RFS)顯著高于ADH4低表達(dá)患者，腫瘤組織中U2SURP低表達(dá)患者的OS和RFS顯著高于U2SURP高表達(dá)患者(P<0.05)。而NUTF2和RFC4的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表1 顯著差異表達(dá)蛋白的IRSTab.1 IRS of significantly differentially expressed proteins

2.4 復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖模型構(gòu)建及臨床驗(yàn)證

對(duì)TMA-1中200例HCC患者的臨床病理特征基線指標(biāo)和顯著差異表達(dá)蛋白進(jìn)行單因素COX回歸分析，結(jié)果表明腫瘤直徑≥5 cm(HR=2.214，95%CI=1.342～3.653)，年齡>50歲(HR=1.095，95%CI=1.016～1.227)，AFP≥20 μg/L(HR=2.347，95%CI=1.575～3.499)，MVI陽(yáng)性(HR=2.044，95%CI=1.434～2.916)，腫瘤分化程度為中-低分化(HR=1.709，95%CI=1.200～2.433)，U2SURP高表達(dá)(HR=1.880，95%CI=1.307～2.706)以及ADH4低表達(dá)(HR=2.225，95%CI=1.442～3.442)是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，性別和腫瘤數(shù)目對(duì)HCC術(shù)后的復(fù)發(fā)無(wú)顯著影響(P>0.05)。將上述因素納入多因素COX回歸分析并用森林圖展示，結(jié)果顯示U2SURP高表達(dá)、ADH4低表達(dá)、腫瘤直徑≥5 cm和AFP≥20 μg/L是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1A。以這4個(gè)參數(shù)構(gòu)建列線圖模型并在HCC患者(n=200)中驗(yàn)證(圖1B)，結(jié)果顯示，HCC患者RFS預(yù)測(cè)值一致性指數(shù)(C-index)為0.71(95%CI=0.67～0.76)，見(jiàn)圖2A、B。高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后生存分析結(jié)果顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組的RFS和OS顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組(P<0.05)(圖2C和D)。ROC曲線顯示，列線圖預(yù)測(cè)HCC患者術(shù)后1、3年RFS的曲線下面積(AUC)分別為0.75(95%CI=0.68～0.81)和0.76(95%CI=0.69～0.83)，見(jiàn)圖3。上述結(jié)果顯示該復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖模型可以預(yù)測(cè)HCC復(fù)發(fā)情況。

A：風(fēng)險(xiǎn)比森林圖，B：HCC復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖圖1 HCC復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖Fig.1 Recurrence warning nomogram of hepatocellular carcinoma

A、B分別為HCC患者1年和3年RFS預(yù)測(cè)的校準(zhǔn)曲線，C、D分別為HCC患者RFS和OS的Kaplan-Meier分析圖2 HCC患者的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier analysis of hepatocellular carcinoma

圖3 HCC患者的ROC分析Fig.3 ROC analysis of hepatocellular carcinoma

3 討 論

HCC是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種病理類(lèi)型，約占原發(fā)性肝癌的75%～85%[15]。由于HCC早期診斷困難且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，患者的預(yù)后生存情況普遍不理想[16]。以往研究表明，HCC患者的MVI陽(yáng)性與預(yù)后不良顯著相關(guān)[17]，但是目前尚無(wú)理想的MVI分子標(biāo)志物可應(yīng)用于臨床實(shí)踐。蛋白質(zhì)組學(xué)研究可比較不同細(xì)胞、組織間蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，有助于探索疾病診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，具有重要應(yīng)用價(jià)值。

本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示了MVI陽(yáng)性的HCC中差異表達(dá)的蛋白分子標(biāo)志物，共篩選出16個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)蛋白和23個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)蛋白。初步采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)去驗(yàn)證上述39個(gè)差異表達(dá)蛋白的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其中有10個(gè)差異表達(dá)蛋白在基因水平存在顯著差異，其中ADH4、U2SURP等5個(gè)差異表達(dá)蛋白與患者生存預(yù)后顯著相關(guān)，并進(jìn)一步進(jìn)行了免疫組織化學(xué)驗(yàn)證和預(yù)后生存分析。

ADH4是ADH家族成員，可作為多種底物的代謝酶。ADH4在卵巢癌、喉癌、食管癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，并且參與了大部分癌癥相關(guān)生理過(guò)程[18-19]。有研究報(bào)道，與正常肝臟相比，HCC組織中ADH4的表達(dá)顯著下調(diào)[20-22]，提示ADH4和乙醇代謝失調(diào)可能參與了HCC的發(fā)生，HCC組織中ADH4低表達(dá)與患者較低的OS相關(guān)，ADH4表達(dá)水平可以作為患者OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[20]。然而，HCC中ADH4與MVI的相關(guān)性尚無(wú)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，ADH4低表達(dá)與MVI陽(yáng)性顯著相關(guān)，并且ADH4高表達(dá)HCC患者OS和RFS顯著高于低表達(dá)患者。

研究示U2SURP是U2 snRNP相關(guān)蛋白[23]，其與RBM17以及CHERP相互作用，調(diào)節(jié)彼此的穩(wěn)定性，并調(diào)控下游RNA結(jié)合蛋白[24]。在癌癥研究領(lǐng)域，U2SURP參與了結(jié)腸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并對(duì)患者的預(yù)后有重要影響[25]。然而，尚無(wú)研究報(bào)道U2SURP與HCC之間關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)U2SURP高表達(dá)與MVI陽(yáng)性相關(guān)，且U2SURP低表達(dá)HCC患者OS和RFS顯著高于高表達(dá)患者，提示U2SURP可能是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)警的分子標(biāo)志物。

本研究進(jìn)一步建立了包含U2SURP、ADH4、腫瘤直徑以及AFP值4個(gè)參數(shù)的列線圖模型，并在HCC肝切除隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)組患者的RFS和OS顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組患者。近年來(lái)，關(guān)于HCC患者的預(yù)后相關(guān)特征和生存風(fēng)險(xiǎn)模型已有相關(guān)研究報(bào)道。如，有研究通過(guò)多組學(xué)分析建立了一個(gè)8基因模型(ACADS、HSD17B13、PON3、AMDHD1、CYP2C8、CYP4A11、SLC27A5以及CYP2E1)來(lái)預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后情況，該模型之中基因的高表達(dá)與較低的HCC分期/風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)[26]。LI等[27]亦建立了基于年齡、性別、分期和6個(gè)基因特征等4個(gè)獨(dú)立因素的列線圖模型來(lái)預(yù)測(cè)HCC術(shù)后患者的OS。上述研究可能有助于臨床醫(yī)生對(duì)HCC術(shù)后患者的個(gè)體化治療方案進(jìn)行選擇。然而，這些預(yù)測(cè)預(yù)后的模型在很大程度上都是依賴(lài)于從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的數(shù)據(jù)，這些模型是否能夠應(yīng)用于臨床尚無(wú)定論。因此，本研究所建立的預(yù)后模型可能成為HCC術(shù)后患者OS和RFS預(yù)測(cè)的可靠工具，或有助于臨床醫(yī)生篩選HCC術(shù)后高危復(fù)發(fā)患者并選擇合理的個(gè)性化治療方案。

本研究中也存在著一定的局限性：①ADH4和U2SURP兩個(gè)蛋白標(biāo)志物在HCC的MVI中的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探究；②本研究構(gòu)建的復(fù)發(fā)預(yù)警列線圖模型采用了內(nèi)部驗(yàn)證，后續(xù)需收集多中心大樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本研究建立的模型整合了MVI相關(guān)的蛋白標(biāo)志物(ADH4和U2SURP)、腫瘤直徑和AFP值，經(jīng)HCC肝切除隊(duì)列驗(yàn)證后具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)效果，對(duì)HCC術(shù)后患者的復(fù)發(fā)預(yù)警和早期干預(yù)可能具有重要的參考價(jià)值。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：陳成、王建國(guó)、徐驍參與了研究設(shè)計(jì)；陳成、項(xiàng)蕭楠、劉治坤、王建國(guó)、徐驍參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byCHENCheng,WANGJianguo, andXUXiao. The manuscript was drafted and revised byCHENCheng,XIANGXiaonan,LIUZhikun,WANGJianguo, andXUXiao. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.