張玉琴，孫業(yè)平，齊建勛

（中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101）

從18世紀末英國醫(yī)生愛德華·詹納發(fā)現(xiàn)接種牛痘可保護人類免受天花病毒感染開始，疫苗學正式誕生。在路易斯·巴斯德等科學家們的推動下，疫苗的概念得到進一步的推廣。經(jīng)過200多年的發(fā)展，疫苗接種已成為當今防控傳染病最為經(jīng)濟有效的方式之一。迄今為止，疫苗可以預防30多種傳染病，是人類醫(yī)學史上最重要的里程碑[1]。盡管如此，在疫苗研發(fā)過程中仍面臨挑戰(zhàn)：艾滋病、肺結核等疾病仍然嚴重威脅全人類的生命財產(chǎn)安全；流感病毒、新型冠狀病毒的突變速度之快，嚴重影響了原有疫苗的保護效果。這再一次使人們認識到，盡快研發(fā)出一款對新出現(xiàn)的和可能再次出現(xiàn)的病毒均有效果的通用疫苗是十分重要的。此外，現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗存在缺陷，例如減毒活疫苗雖然保留了較高的免疫原性，但存在逆轉為高致病性病原的風險[2]。滅活疫苗在制作過程中往往需要加入抗原以外的復雜成分，存在引發(fā)未知風險的可能性，且在滅活過程中疫苗會喪失大部分抗原表位，只能誘導機體產(chǎn)生較弱的免疫反應，通常需要多次給藥或使用佐劑輔助?？贵w依賴性增強（antibody dependent enhancement ，ADE）也是減毒活疫苗和滅活疫苗需要解決的另一個問題[3]。亞單位疫苗在近幾年的研究中獲得較多的關注。亞單位疫苗通過體外蛋白純化獲得病毒抗原，與其他疫苗相比，它不含任何遺傳物質，因此具有更高的安全性；但亞單位疫苗的缺點是免疫原性差，需要佐劑輔助和重復接種。納米技術的出現(xiàn)彌補了亞單位疫苗的不足。基于納米顆粒所研發(fā)的納米顆粒疫苗不僅保持了亞單位疫苗的安全性，還提高了免疫原性和穩(wěn)定性，這就解決了傳統(tǒng)疫苗的大部分局限性，因此納米顆粒疫苗被認為是極具潛力的疫苗研發(fā)平臺。

納米顆粒疫苗主要通過3種方法遞呈所攜帶的抗原（見圖1），分別是共價結合、吸附（在納米顆粒表面）和包封（在納米顆粒內）。納米顆粒疫苗的優(yōu)勢主要在于其尺寸，其納米級的大小可匹配大多數(shù)感染性病毒，因此無需佐劑，其免疫原性就接近天然病毒。同時在給藥時，納米顆粒疫苗可輕易穿透毛細血管和黏膜細胞表面，這使疫苗的給藥方式不再局限于注射，還可以通過鼻腔給藥，這可有效激活黏膜免疫，大大提高了免疫效率。除尺寸大小外，隨著化學技術和生物工程的進步，納米顆粒的形狀、溶解度、表面性質和親水性等均可調節(jié)和控制，從而制備具有特定生物特性的納米顆粒，最終達到增強抗原遞呈和獲得強大的免疫原性的目的。研究表明，納米顆粒可起到暫時的抗原存儲作用，一方面可防止抗原在誘導機體產(chǎn)生免疫反應之前被蛋白酶降解，另一方面可確保將抗原持續(xù)地遞呈給免疫細胞。最重要的是，攜帶抗原的納米顆粒疫苗可調節(jié)個體的免疫反應以獲得理想的效果，這是納米顆粒疫苗研發(fā)的基礎[4]，也是所有疫苗研發(fā)的最終目的。目前，超過26種候選納米顆粒疫苗已進入臨床試驗階段，另有60種處于臨床前開發(fā)階段[5]。本文重點介紹納米顆粒疫苗的優(yōu)勢，比較全面地總結目前應用較多的納米顆粒疫苗研發(fā)載體，旨在為新型抗病毒疫苗的研發(fā)提供參考。

圖1 納米顆粒疫苗遞呈病毒抗原的3種方法Figure 1 Three ways to present viral antigens in nanoparticle vaccines

1 納米顆粒疫苗給藥方式

傳統(tǒng)疫苗通常采用的給藥方式為肌肉或皮下注射，因為能夠誘導血清免疫球蛋白G（IgG）的產(chǎn)生。然而對于呼吸道病毒感染來說，最好的給藥方式是鼻腔或肺部黏膜給藥，這是由于呼吸道病毒或細菌是通過肺黏膜感染人類。黏膜免疫系統(tǒng)是人體內免疫系統(tǒng)的第一道防線，是人體免疫網(wǎng)絡的重要組成部分，在抗擊感染方面發(fā)揮重要作用，因此有效激活黏膜免疫，誘導分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的產(chǎn)生是對抗呼吸道病毒的最佳方法。然而黏膜給藥要求疫苗不含任何可能會在給藥部位引起炎癥反應的佐劑，傳統(tǒng)疫苗通常無法滿足這一要求。納米顆粒疫苗由于大小接近天然病毒，免疫原性較高，無需佐劑就能刺激機體產(chǎn)生免疫反應，且納米級顆粒可輕易穿透毛細血管和黏膜細胞表面（見圖2A），因此是作為黏膜給藥的首選疫苗。Kurosaki等[6]將納米顆粒疫苗經(jīng)肺給藥成功誘導小鼠產(chǎn)生黏膜免疫。Zhao等[7]的研究也證明，通過鼻腔給藥的殼聚糖納米顆粒能夠增強雞的黏膜免疫應答。

2 納米顆粒疫苗誘導機體產(chǎn)生免疫應答的調節(jié) 機制

疫苗接種的主要目的是激活個體或群體免疫系統(tǒng)的先天免疫和適應性免疫反應，以獲得長期的保護性免疫[8]，因此是否能夠誘導體液免疫和細胞免疫反應的產(chǎn)生是疫苗開發(fā)的一個關鍵參考因素。與其他疫苗相比，納米顆粒疫苗在刺激機體產(chǎn)生免疫應答方面具有許多理論優(yōu)勢，包括增強抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）對納米顆粒的捕獲、通過受體交聯(lián)激活抗原特異性B細胞的活化，以及通過淋巴循環(huán)將抗原定位在濾泡樹突狀細胞（follicular dendritic cell，F(xiàn)DC）處，促進抗原遞呈。

2.1 增強抗原遞呈細胞對納米顆粒的捕獲

病原體進入人體內首先被巨噬細胞（macrophage，Mφ）等APC捕獲，之后APC將病原體樣本遞呈給T細胞，并攜帶病原體樣本至淋巴結，被B細胞識別，最終激活機體免疫應答，清除病原體。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）作為重要的APC在這個過程中發(fā)揮著核心作用，因此DC是疫苗接種的主要靶細胞。納米顆粒疫苗通過影響DC在抗原遞呈中的功能，來影響適應性免疫反應，這主要得益于納米技術的進步。通過納米技術可將納米顆粒改造成需要的尺寸、形狀、表面特性等，而這些特性會影響DC對納米顆粒的攝取程度，最終達到免疫調節(jié)的目的[9]。尺寸約為100 nm的納米顆粒非常有利于DC的攝取。這是由于大小在100 nm左右的納米顆粒可以自由流入淋巴結，并暴露給在此常駐的DC[10]。此外，納米顆粒的表面電荷和形狀也會影響DC對納米顆粒的攝取。由于細胞膜的陰離子特性，帶正電的納米顆粒更易被DC攝取。相對于棒狀或其他形狀的納米顆粒，球形的納米顆粒更易被DC攝取[11]。此外，也可以在納米顆粒疫苗的制作過程中加入模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）激動劑，如Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）等，誘導APC的成熟。研究表明，在納米顆粒疫苗配方中添加PRR激動劑可顯著增強機體的免疫應答和疫苗的效力[12]。

2.2 刺激B細胞的活化，增強體液免疫

納米顆粒疫苗主要是通過模擬天然病毒入侵機體的形式來啟動免疫反應，將免疫原密集地排列在納米顆粒表面通常能有效地提高其免疫原性，但抗原的表面排列密度很重要。有研究表明，在納米顆粒表面展示人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的包膜糖蛋白（envelope，Env）三聚體，能夠誘導產(chǎn)生較天然Env三聚體更有效的中和抗體反應。同時，當單個B細胞受體（B cell receptor，BCR）能夠識別2個表面抗原時，抗原與受體之間的結合親和力最高[13]。小鼠實驗也證明，納米顆粒表面抗原的密度與小鼠對呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）免疫原的中和反應強度相關[14]。納米顆粒疫苗還可同時將多個抗原遞呈給單個B細胞。有研究發(fā)現(xiàn)，在單個納米顆粒上近距離展示多種菌株的流感血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白有利于B細胞的擴增，B細胞通過識別不同菌株之間保守的抗原表位，產(chǎn)生對不同菌株均有預防效果的中和抗體[15]，這也為流感通用疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

抗原的重復排列是病原體表面的一種自然特征，它比隨機聚集的抗原更能刺激B細胞反應。這說明對稱性也是刺激B細胞產(chǎn)生抗體的一個重要因素。Kanekiyo等[15]的研究顯示，在納米顆粒上以八面體對稱排列流感病毒血凝素抗原，證實了病毒的幾何特征在刺激細胞產(chǎn)生免疫應答方面發(fā)揮著重要作用。此外，納米顆粒還可增強其表面抗原的穩(wěn)定性，維持其所需的天然構象。

2.3 改變抗原在淋巴結內的遷移和定位，促進抗原遞呈

APC在識別和捕獲抗原后，可遷移至局部淋巴結，其遷移的部位不同，對之后的免疫反應產(chǎn)生的影響也不同。對于體液免疫而言，抗原主要定位在濾泡和生發(fā)中心（germinal center，GC），這是由于體液免疫所需要的B細胞需要在此增殖和突變。FDC在生發(fā)中心中發(fā)揮著重要作用，它將特定抗原持續(xù)性遞呈給B細胞。因此，將抗原定位于淋巴結的FDC處是有效啟動體液免疫的重要步驟?？茖W家們在研究可溶性和顆粒性HIV-Env免疫原的淋巴結定位時發(fā)現(xiàn)，以納米顆粒形式展現(xiàn)的Env三聚體免疫原會改變其在淋巴結內的遷移和定位?？扇苄訦IV gp120或gp140三聚體抗原主要定位于濾泡間區(qū)域，集中在表達SIGN-R1（識別病毒的多種突變，指導機體的免疫反應，消除病毒）的巨噬細胞上。然而納米顆粒形式的gp120或Env三聚體在免疫后幾天內主要集中在FDC上，并與新生的GC共定位[16]。此外，納米顆粒的大小也會影響其定位。直徑小于15 nm的納米顆粒在免疫后可迅速進入淋巴結濾泡間區(qū)，但48 h后就會被清除。相比之下，直徑為50 ～ 100 nm的納米顆粒在免疫后12 h內進入濾泡，但可在此處持續(xù)數(shù)周。組織學染色也證實這些納米顆粒在后期可以與FDC和GC共定位[17]。這表明在未來的疫苗研發(fā)過程中，可以考慮通過構建納米顆粒的形式來促進抗原向FDC的遷移。

3 納米顆粒疫苗有助于抗原的遞呈和藥物的遞送

在向人體內輸送抗原或藥物的過程中，由于其自身溶解度、吸收率、靶向性以及易降解等特性的限制，抗原或藥物通常很難高效率地到達需要其發(fā)揮作用的地方，尤其是病毒核酸。與蛋白質不同，核酸高度不穩(wěn)定，在體內易被核酸酶降解。例如mRNA是一種帶負電荷的大分子，不能通過細胞膜擴散，但它必須進入細胞內才能被翻譯為蛋白質，從而發(fā)揮疫苗的防御效果。納米顆粒技術的發(fā)展在一定程度上改善了這些問題，這主要得益于納米顆粒的穩(wěn)定性以及其制備的多樣性，尤其是通過調節(jié)納米顆粒的電荷屬性來幫助疫苗和藥物內體逃逸。

納米顆粒在進入人體后，通過細胞胞吞作用進入細胞。被包裹在內體中的納米顆粒面臨著2種命運，一種是通過胞吐作用被排出細胞，另一種是囊泡被溶酶體中的酶降解，納米顆粒進入細胞。為了發(fā)揮疫苗的作用，必須要通過溶酶體途徑將納米顆粒轉移至細胞質中。提示，納米顆粒內體逃逸的重要性[18]。帶正電的納米顆粒可以通過靜電相互作用與帶負電的mRNA形成復合體，包裹mRNA，保護mRNA不被核酸酶降解。此外，陽離子納米顆粒在破壞內體膜的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用。在低PH值的內體內，帶正電的納米顆?？梢酝ㄟ^誘導非雙層脂質結構的形成來破壞內體膜，從而使藥物或抗原進入到細胞質中（見圖2B）。

圖2 納米顆粒疫苗穿透黏膜細胞及內體逃逸Figure 2 Nanoparticle vaccines penetrate mucosal cells and escape from endosomes

4 常用的納米顆粒疫苗載體

4.1 脂質納米顆粒

脂質納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）是由磷脂、膽固醇和其他分子組成的單層或多層的球形囊泡，LNP可被用于在表面呈現(xiàn)病毒抗原或在內部包裹病毒抗原。通過改變LNP合成過程中使用的每種脂質的類型和比例，可以調整LNP的性質以滿足不同的要求[19]。LNP通常直徑為80 ～ 200 nm，這與大部分病毒大小一致，因此其自身就具有強大的免疫原性，無需額外的佐劑[20]。通過微流控設備也能夠快速有效地混合LNP成分，以生成尺寸可控的LNP。LNP在低pH值下帶正電，可以包裹帶負電的mRNA，這在協(xié)助納米顆粒內體逃逸方面發(fā)揮重要作用。LNP的優(yōu)點在于可以在體外合成和制造，而不需要活細胞的參與。LNP已被廣泛應用于mRNA-LNP疫苗的制作，有些mRNA-LNP疫苗已進入臨床階段。例如，由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的S蛋 白mRNA與LNP共 同 制 成 的BNT162b2 mRNA-LNP疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，與未接種該疫苗的受試者相比，接種2針劑該疫苗可保護受試者免受SARS-CoV-2（Wuhan-Hu-1株）的感染，其有效率可超過90%，且發(fā)生嚴重不良反應的概率較低[21]。同樣的研究結果在以色列的研究中也被觀察到[21]。在美國，mRNA-LNP疫苗可保護超過94%的65歲以上的老人避免因2019新型冠狀病毒病（COVID-19）相關疾病而住院[22]。Ⅰ期臨床試驗顯示，經(jīng)mRNALNP疫苗免疫后的中和抗體反應持久，在所有健康成人參與者體內可存在6個月[23]。通過LNP在表面展示HIV包膜蛋白Env制成的HIV納米顆粒疫苗也被證明有良好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，HIV脂質體納米顆粒疫苗在B細胞活化方面優(yōu)于可溶性Env三聚體。當給恒河猴注射脂質體納米顆粒疫苗后，生發(fā)期卵泡輔助性T細胞和生發(fā)中心增殖性B細胞的數(shù)量明顯增加，這在可溶性Env三聚體未見[3]。此外，與可溶性Env三聚體相比，Env-LNP疫苗誘導機體產(chǎn)生中和抗體（neutralizing antibody，NAb）的反應較可溶性Env三聚體要高[24]。然而，LNP疫苗仍存在一些缺點，例如通過非共價連接抗原時，該疫苗在體內不穩(wěn)定，無法有效保留其表面的抗原蛋白。抗原偶聯(lián)效率、大小、顆粒完整性和均一性仍是需要解決的問題（見表1）。此外，mRNA-LNP疫苗需要冷鏈儲存（＜ －20℃），這限制了其在基礎設施不發(fā)達地區(qū)的部署。

4.2 有機聚合物納米顆粒

有機聚合物納米顆粒是由有機單體單元構成的大分子固體顆粒。與無機納米顆粒相比，有機聚合物納米顆粒具有更高的免疫原性、更好的靶向性和可降解性，因此在疫苗的開發(fā)中具有特別重要的意義。由于有機聚合物納米顆粒具有優(yōu)異的生物相容性和較大的比表面積，可輕松地將病毒抗原裝入其核心或吸附在其表面，從而實現(xiàn)誘導機體產(chǎn)生高強度的免疫反應的目的[25]，因此有機聚合物很早就被廣泛應用于納米顆粒疫苗的制備。根據(jù)來源不同，有機聚合物可分為天然聚合物、半合成聚合物及合成聚合物，它們各有優(yōu)勢。例如，天然聚合物納米材料具有比合成聚合物納米材料更好的生物相容性，因為前者是在自然界中天然存在的，例如，殼聚糖、海藻酸鈉和纖維素等。然而合成聚合物納米顆粒具有可定制的化學、生物特性，比天然聚合物納米顆粒更能滿足需求，例如聚乳酸-乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）和聚乙二醇（polyethylene glycol ，PEG）等。

殼聚糖是一種天然陽離子多糖，通過靜電相互作用與質粒DNA或其他帶負電的蛋白質結合。同時，帶正電的殼聚糖可以與帶負電的唾液酸產(chǎn)生靜電相互作用，促進鼻腔給藥后納米顆粒在氣道上皮細胞表面的黏附。殼聚糖納米顆粒的表面可用甘露糖修飾。甘露糖的先天免疫識別可能有助于更多的納米顆粒穿梭于FDC網(wǎng)絡，并遷移至淋巴結的生發(fā)中心[16]。Zhang等[26]研究了殼聚糖納米顆粒疫苗的抗RSV感染的效果。該研究采用殼聚糖納米顆粒攜帶靶向NS1基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）制成RSV納米顆粒疫苗，通過鼻內給藥，注射到被RSV感染的小鼠體內。結果顯示，在注射疫苗后，小鼠體內RSV復制明顯減少，Ⅰ型干擾素含量升高，CD4+T細胞向輔助性T細胞Ⅰ型分化，這表明殼聚糖納米顆?？杀Ｗo小鼠抵御RSV感染。PLGA是一種高度可生物降解的合成聚合物，可在體內水解成無毒的乙醇酸鹽和乳酸，安全地被排出體外。此外，PLGA還可被定制成各種所需要的大小和形狀，控制抗原釋放速率。因此，PLGA納米顆粒也被用于抗病毒納米顆粒疫苗的研發(fā)。Dhakal等[27]已研發(fā)出包裹滅活豬流感病毒H1N2抗原KAg的PLGA納米顆粒疫苗，并在豬模型中評估了其免疫原性。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻接種PLGA-KAg疫苗的豬表現(xiàn)出免疫細胞增殖增強的現(xiàn)象，與存在發(fā)熱的對照組豬相比，接種PLGA-KAg疫苗的豬未表現(xiàn)出臨床流感癥狀。Galloway等[28]的研究還證明，與單獨的可溶性抗原制成的疫苗相比，裝載流感病毒抗原的PLGA納米顆粒疫苗更安全，同時誘導機體產(chǎn)生更高的免疫反應。總之，有機聚合物納米顆粒因其生物相容性、有效的黏附性和生物可降解性及可修飾的物理化學性質（見表1），成為疫苗研發(fā)的有力平臺。然而由于此類疫苗研究主要集中在流感病毒上，對其他呼吸道病毒如SARS-CoV-2、RSV等病毒的研究有限，因此還需進一步研究。

4.3 病毒樣顆粒

病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）通常是由病毒結構蛋白自組裝形成的非復制性結構。病毒結構蛋白，如包膜糖蛋白和衣殼蛋白，均可在體外細胞培養(yǎng)中共表達并自組裝成顆粒形態(tài)的VLP。VLP可以由重復的病毒抗原單體自組裝形成，也可以由幾種病毒結構蛋白自組裝形成，由于不含病毒遺傳物質，VLP疫苗在保留了重組亞單位疫苗的優(yōu)勢的同時，還消除了減毒疫苗可能發(fā)生感染的風險。VLP可以在細菌、哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系、酵母和植物細胞中產(chǎn)生。與哺乳動物細胞表達的VLP疫苗相比，重組桿狀病毒衍生結構產(chǎn)生的VLP表現(xiàn)出更高和更廣泛的免疫反應。VLP的形態(tài)特征與大小模擬了天然病毒的特征，其表面有病毒抗原的重復結構和自然保留的抗原構象，這使得VLP具有較高的免疫原性（見表1），可誘導機體產(chǎn)生先天性和適應性免疫反應。葛蘭素史克（Glaxo Smith Kline）公司開發(fā)的首款乙型肝炎病毒VLP疫苗于1986年商業(yè)化。隨后，其他VLP疫苗也被相繼開發(fā)并商業(yè)化，例如葛蘭素史克公司的人乳頭瘤病毒疫苗Cervarix、默克（Merck & Co. Inc）公司的乙型肝炎病毒疫苗Recombivax HB和人乳頭瘤病毒疫苗Gardasil。此外，流感病毒的VLP疫苗也在研發(fā)中。研究顯示，H1N1或H3N2流感病毒的VLP疫苗可針對同源和異源流感病毒抗原產(chǎn)生保護效果[29]，在小鼠和雪貂模型中流感病毒VLP疫苗針對同源和異源病毒能夠產(chǎn)生有效的血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）滴度。Geng等[30]研發(fā)了一種針對SARS-CoV-2的VLP疫苗，在顆粒表面顯示120個單位的抗原表位即受體結合結構域（receptor binding domain，RBD），與普通RBD疫苗相比，VLPRBD疫苗在小鼠體內誘導產(chǎn)生的中和抗體是普通RBD疫苗的5倍，且這些中和免疫反應可持續(xù)2個月。這些結果表明，VLP疫苗也是有潛力的疫苗研發(fā)平臺，但目前針對VLP疫苗的結果均是在小鼠模型中得到，在人類體內是否會產(chǎn)生同樣的效果尚未知，因此還需要進一步的研究。

4.4 自組裝蛋白

自然界中有許多天然存在的可自組裝成納米顆粒的蛋白質，其所含有的自組裝基序使可溶性蛋白自組裝成蛋白質納米顆粒。自組裝蛋白通常由多個重復的亞單位結構組成，形狀不一，如籠狀、管狀、線狀和環(huán)狀等，由于其獨特的結構特征、對稱性和相對易于修飾的特點，它們可以很容易地與蛋白質、肽和合成分子等相融合，因此此類蛋白質已被廣泛應用于生物分子工程和生物醫(yī)學領域[31]。自主裝蛋白最大的特點是可以在表面同時展示不同種類的抗原表位（見表1），因此其可被用于制備抵御多種病毒感染的多價疫苗。鐵蛋白（ferritin）是細胞內具有儲存鐵功能的蛋白質，在許多組織中均有表達。鐵蛋白能夠自組裝成具有對稱結構和有序矩陣的球狀納米籠。鐵蛋白納米顆粒自排列為八面體，由8個三聚體單元組成，允許三聚體抗原在納米顆粒表面以天然構象呈現(xiàn)。由于鐵蛋白具有耐熱和耐化學應力的特點，其被廣泛應用于疫苗研發(fā)。在HIV疫苗的研發(fā)過程中，He等[32]和Sliepen等[33]的研究均表明，與普通Env三聚體疫苗相比，裝載Env三聚體的鐵蛋白納米顆粒疫苗能夠在家兔體內誘導產(chǎn)生更多的中和抗體。Joyce等[34]利用鐵蛋白研發(fā)的SARS-CoV-2納米顆粒疫苗也被證明能夠產(chǎn)生較強的中和抗體滴度。此外，其他自組裝蛋白如熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）、E2蛋白等，也是納米顆粒疫苗研發(fā)的有效載體。

除天然存在的自組裝蛋白外，基于計算設計產(chǎn)生的體外自組裝蛋白也在疫苗研發(fā)過程中得到廣泛應用。體外組裝的納米顆?？梢愿玫乜刂瓶乖鞍椎馁|量，因為在組裝之前可以對抗原蛋白進行純化[35]。目前應用較多的體外組裝納米顆粒有通過SpyCatcher和SpyTagged共價偶聯(lián)的蛋白質，以及I53-50納米顆粒。尤其是后者，有研究證明SARSCoV-2和RSV的I53-50納米顆粒疫苗能有效誘導中和抗體產(chǎn)生[36]。對家兔模型的免疫研究表明，通過I53-50展示HIV包膜蛋白的納米顆粒（Env-I53-50NPs）的免疫原性與普通Env相比顯著增強。此外，Env-I53-50NPs在促進機體產(chǎn)生中和抗體方面優(yōu)于Env鐵蛋白納米顆粒[35]。因此可以推測，體外組裝的納米顆粒將對下一代疫苗產(chǎn)生越來越大的影響。無論是體內組裝還是體外組裝的納米顆粒，均可能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對其自身的抗體反應。鐵蛋白納米顆粒疫苗和I53-50納米顆粒疫苗均能夠引發(fā)機體產(chǎn)生針對其自身的中和抗體的反應[37]，這不會影響其針對RSV和流感病毒的中和抗體反應，但可能會干擾抗HIV-1的中和抗體反應[38]。

肽自組裝是一個涉及化學、生命科學和材料科學的跨學科研究領域。肽可以通過計算從頭設計，也可以從天然蛋白質序列中提取，是制備納米結構的一類重要分子構件[39]。由于肽本身在生物合成過程中和生物合成后易于修飾的特點，肽也被用來研發(fā)納米顆粒疫苗。自組裝肽水凝膠作為一種可注射的多功能支架材料在藥物釋放和組織再生方面顯示出巨大的發(fā)展前景[40]。人工合成的β-折疊自組裝肽能夠起到穩(wěn)定抗原并增強免疫反應的作用。研究人員合成了一種自組裝的嵌合肽，該嵌合肽為十聚體，每個單體包含一個β-折疊序列和甲型流感病毒的高度保守表位M2e，最終形成一個100～200 nm的均勻納米棒（nanorods，NR），M2e表位位于其表面。結果顯示，M2e-NRs被抗原遞呈細胞有效攝取，在小鼠體內顯示出強烈的M2e特異性IgG反應[40]。

4.5 無機納米顆粒

目前有許多無機納米顆粒被應用于生物醫(yī)學。然而，由于顆粒聚集的特性，普通無機納米顆粒本身不適合用于生物流體。因此，在醫(yī)療領域，這些納米顆粒通常通過吸附或化學反應被有機分子包裹，故稱其為具有無機核和有機外殼的混合納米顆粒。在無機納米顆粒中，最常用于疫苗接種的是金納米顆粒（Au nanoparticle，AuNP）。AuNP很容易被Mφ和DC內化，并誘導抗原遞呈細胞的激活。包括佐劑和抗原等多種分子，均可以高密度結合在AuNP上，從而提高納米顆粒的免疫原性和抗原遞呈效率。AuNP可經(jīng)鼻內給藥，擴散至淋巴結，觸發(fā)強烈的抗原特異性細胞毒性T細胞免疫反應[41]。盡管AuNP構成了一個有吸引力的疫苗研發(fā)平臺，但它們可在肝和脾等器官中長期積累，可能具有毒性。用生物相容性材料涂層可降低其毒性，但這可能會導致納米顆粒物理化學和生物特性的改變。因此，AuNP的安全問題仍然需要解決（見表1）。除AuNP外，銀納米顆粒（Ag nanoparticle，AgNP）也被用于疫苗的研發(fā)。Pilaquinga等[42]的研究表明，AgNP在治療SARS-Cov-2方面有效，且在通過吸入給藥時副作用最小。

4.6 噬菌體蛋白質外殼

噬菌體是一類可感染細菌但不感染人類的病毒。每種噬菌體均有自己獨特的大小和形狀，但通常呈對稱結構，因此其可被開發(fā)用作某些病毒疫苗的載體，預防多種傳染病。P22噬菌體由一個60 nm的二十面體衣殼和一個尾部區(qū)域組成。研究人員利用P22噬菌體開發(fā)了一種流感病毒PR8特異性疫苗，將血凝素蛋白的球狀頭部結構域通過連接酶連接到P22噬菌體外殼上，將該疫苗對小鼠進行免疫，然后用PR8甲型流感病毒對小鼠進行攻擊，最終接種疫苗的小鼠存活率為100%，而未接種的小鼠存活率為50%。此外，與對照組相比，該疫苗誘導產(chǎn)生的抗原特異性IgG抗體水平提高了一倍[43]。Qβ是一種具有二十面體外殼的噬菌體，長約25 nm。Qβ已被用作傳染病和癌癥的疫苗支架[44]，如流感、瘧疾等。在最近的一項研究中，研究人員通過基因工程和化學結合的方法，開發(fā)了幾種在Qβ外殼上展示HIV-1抗原的方法。經(jīng)過為期6個月的家兔實驗后，該研究發(fā)現(xiàn)在Qβ外殼上展示全長HIV-1抗原，可產(chǎn)生更高的中和抗體滴度[45]。噬菌體T4目前也被用于應對SARS-CoV-2，其為核酸疫苗提供載體，保護病毒核酸不被降解，并模擬天然病毒入侵機制確保核酸的有效遞送，但也存在病毒載體本身可能引發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應的缺點（見表1）。

4.7 去溶劑化納米顆粒

蛋白質溶液中物理化學條件的變化可以驅動蛋白質納米顆粒的形成。脫溶劑化形成的納米顆粒的尺寸為50～300 nm。由于物理化學條件的變化是動態(tài)過程，因此以這種方式組裝的納米顆粒通常大小不均勻，但可顯示出正態(tài)分布的大小范圍。通過乙醇去溶劑化可將流感病毒抗原M2e或流感病毒HA自組裝成蛋白質納米顆粒。由于這些去溶劑化納米顆粒完全是由抗原成分組裝的，且為完全可溶的結構，因此在所有蛋白質納米顆粒中，這種納米顆粒的抗原載量最高（見表1）。去溶劑化納米顆粒的另一個優(yōu)點是，可與不同的抗原蛋白質一起經(jīng)歷多個顆粒組裝過程周期。由于不同的抗原蛋白質穩(wěn)定性不同及理化性質差異，脫溶劑化可使它們在納米顆粒核心外形成不同的片層，產(chǎn)生多層納米顆粒，從而將抗原蛋白組裝到顆粒周圍的不同片層中。研究人員已利用乙醇將流感病毒抗原M2e脫溶劑化形成的納米顆粒作為核心，并在外層通過化學交聯(lián)連接結構穩(wěn)定的流感病毒HA柄，制備了雙層蛋白質納米顆粒。這種分層的蛋白質納米顆?？梢宰畲笙薅鹊匕l(fā)揮不同抗原的不同免疫作用。小鼠皮膚免疫實驗表明，這種蛋白質納米顆粒疫苗可以對各種流感病毒產(chǎn)生普遍免疫，且免疫效果能維持4個月[46]。

表1 各類納米顆粒疫苗優(yōu)缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various nanoparticle vaccines

5 針對SARS-CoV-2的納米顆粒疫苗的臨床進展

自2019年COVID-19疫情暴發(fā)至今，有各類針對SARS-CoV-2的納米顆粒疫苗正在研發(fā)過程中，如mRNA-LNP疫苗、病毒樣顆粒疫苗和自組裝納米顆粒疫苗等。有部分疫苗已進入臨床階段并取得優(yōu)異的結果。除前文已述的BNT162b2 mRNA-LNP疫 苗 外，Baden等[20]研 發(fā) 的mRNA-1273新 冠 病毒疫苗，也是一種LNP疫苗。該試驗共招募了30420名志愿者，以1∶1的比例隨機分配，分別注射疫苗或安慰劑。最終結果證明，該疫苗預防SARSCoV-2的有效率達到94.1%，且暫未發(fā)現(xiàn)任何安全問題。Keech等[47]研發(fā)的NVX-CoV2373是一種由SARS-CoV-2的三聚體全長S蛋白與Matrix-M1佐劑共同組成的納米顆粒疫苗。臨床試驗結果顯示，該疫苗的安全性良好，注射該疫苗后大部分受試者無明顯不良反應或只表現(xiàn)出輕微不良反應；該疫苗有效性良好，在注射2針劑5 μg該疫苗后，受試者體內均產(chǎn)生有效的免疫反應。

6 結語與展望

盡管病原體各不相同，但傳染性病毒均有共同的特點：已知病毒重新出現(xiàn)的不可預測性，以及未知病毒導致新疾病出現(xiàn)的不可預測性、高發(fā)病率和深刻的社會經(jīng)濟影響，這也強調了研發(fā)通用疫苗的重要性。納米技術的發(fā)展為盡早解決這一問題提供了新的思路。納米顆粒疫苗因其具有與天然病毒類似的結構、安全性好、免疫原性良好、結構穩(wěn)定以及獨特的顯示外源蛋白的能力，被廣泛應用于生物醫(yī)學領域中[48]。基于納米顆粒的疫苗可刺激機體產(chǎn)生針對病毒的更強大的保護性抗體，因此納米顆粒疫苗是一種強大而靈活的疫苗研發(fā)平臺。然而，盡管納米顆粒疫苗已展示出巨大的發(fā)展前景，仍有一些缺點不可忽視。首先關于納米顆粒疫苗的設計尚未探索到最有效的設計方案，其靶向、生物分布和代謝清除等還需進一步研究。其次，實現(xiàn)納米顆粒疫苗大規(guī)模的生產(chǎn)及可持續(xù)、可重復性的問題仍待解決。再次，目前世界上針對病毒的疫苗的部署仍存在不公平的現(xiàn)象，就以SARS-CoV-2疫苗的部署來說，在高收入和中等收入國家的覆蓋率較高，而低收入國家的部署才剛剛開始。因此在疫苗的研發(fā)過程中，成本是必須要考慮的問題。此外，納米顆粒疫苗研發(fā)平臺需要專業(yè)的生產(chǎn)設施和高技能的勞動力，這對一些資源有限的國家也是一項挑戰(zhàn)。最后是疫苗的運輸與存儲問題，目前大部分疫苗都需要冷鏈儲存，這也使疫苗的生產(chǎn)、分銷變得復雜。然而隨著科技的進步，這些問題也在逐漸解決。總之，納米顆粒疫苗是對抗傳染性病毒的有效手段，相信在不久的將來，能夠通過其改善全人類的生命健康。