李倩倩，黃維金，王佑春*

（1. 江蘇瑞科生物技術(shù)股份有限公司研發(fā)規(guī)劃與預(yù)研部，江蘇 泰州 225300；2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院艾滋病性病病毒疫苗室 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629）

病毒的數(shù)量龐大、種類(lèi)多樣，可通過(guò)呼吸道途徑、消化道途徑、身體接觸或體液等方式進(jìn)行傳播。病毒的感染可引起人體多種疾病，甚至腫瘤的發(fā)生。天花病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、登革熱病毒（DENV）、狂犬病毒（RABV）、流感病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）、馬爾堡病毒（MARV）、埃博拉病毒（EBOV）、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV-1）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）等在人際間傳播，均導(dǎo)致人類(lèi)罹患嚴(yán)重疾病甚至死亡[1]。近年來(lái)新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的出現(xiàn)和2019冠狀病毒?。–OVID-19）在世界范圍的暴發(fā)和流行，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康?；仡櫲祟?lèi)病毒感染史和傳染病暴發(fā)史，可以發(fā)現(xiàn)疫苗在人類(lèi)與傳染病的斗爭(zhēng)中發(fā)揮了極其重要的作用[2-3]。疫苗的研發(fā)和使用為人類(lèi)健康構(gòu)筑了一道免疫屏障，從而保護(hù)人類(lèi)免受病毒的感染，甚至能在全球范圍內(nèi)消滅傳染性極強(qiáng)的天花病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等[4]。目前，已有多種類(lèi)型的疫苗上市，可用來(lái)保護(hù)多種病毒的感染。然而，仍有部分病毒沒(méi)有研發(fā)出相應(yīng)的疫苗，而且部分已上市的疫苗也需要利用新平臺(tái)、新技術(shù)進(jìn)行更新?lián)Q代[5-6]。

1 病毒疫苗的類(lèi)型及其新技術(shù)

病毒疫苗的類(lèi)型包括滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等[7]。不同的疫苗類(lèi)型誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度、廣泛性、持久性，以及免疫效應(yīng)發(fā)揮的部位等均存在差異。其中，基因工程重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等類(lèi)型具有可人工改造、快速構(gòu)建等優(yōu)勢(shì)，在應(yīng)對(duì)新突發(fā)傳染病的暴發(fā)，以及高變異、多型別病原體的再感染方面，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。不同類(lèi)型的疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程有所差異，總體上包括了抗原選擇和設(shè)計(jì)、表達(dá)、純化以及佐劑選擇等，在此過(guò)程中新技術(shù)和新方法被廣泛應(yīng)用。未來(lái)病毒疫苗的設(shè)計(jì)，需要將病毒特性、機(jī)體免疫反應(yīng)等前沿理論與新佐劑、新劑型、新技術(shù)方法等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)新病毒疫苗的開(kāi)發(fā)和迭代[9]。

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗是一種傳統(tǒng)的疫苗類(lèi)型，通過(guò)化學(xué)或物理學(xué)方法處理天然病毒，從而得到?jīng)]有感染能力，但保留病毒天然抗原表位的疫苗。通過(guò)離心和層析技術(shù)對(duì)滅活疫苗進(jìn)行純化和組分分離，滅活疫苗可進(jìn)一步分為全微生物體滅活疫苗、裂解疫苗和病毒純化亞單位疫苗。滅活疫苗具有安全性好、研發(fā)速度快、可同時(shí)遞呈多個(gè)抗原等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)具有免疫原性較弱、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱、存在抗體依賴(lài)的感染增強(qiáng)（ADE）風(fēng)險(xiǎn)等局限性。在我國(guó)上市和在研的滅活疫苗，包括甲型肝炎（HAV）滅活疫苗、Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（IPV）、乙型腦炎（JEV）滅活疫苗、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗、腸道病毒EV71型滅活疫苗、四價(jià)流感病毒裂解疫苗、RABV疫苗、森林腦炎滅活疫苗、SARS-CoV-2滅活疫苗、帶狀皰疹（VZV）滅活疫苗等。

在滅活疫苗的研發(fā)過(guò)程中，新技術(shù)和新方法主要集中于病毒滅活技術(shù)和純化技術(shù)等方面。病毒的滅活一般采用化學(xué)法，常用滅活劑為甲醛和β-丙內(nèi)酯。此外，雙氧水和烷化劑（二乙烯亞胺、乙酰乙烯亞胺）等新的滅活技術(shù)，目前處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。病毒懸液的澄清、超濾濃縮，以及各種層析純化技術(shù)的發(fā)展，可進(jìn)一步去除雜蛋白和DNA殘留，從而提高疫苗純度。

1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗指的是將病毒經(jīng)過(guò)基因工程改造或其他方式處理和誘導(dǎo)，使得病毒的毒性基因缺失或改變，從而得到保留原有免疫原性，且能夠復(fù)制的毒力減弱或缺失的疫苗[10]。根據(jù)減毒活疫苗的獲得方法不同，減毒活疫苗包括來(lái)源于動(dòng)物的弱毒病毒的減毒疫苗、經(jīng)細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)傳代獲得的減毒疫苗、經(jīng)冷適應(yīng)獲得的減毒疫苗[11]、經(jīng)過(guò)基因工程改造的病毒毒力基因缺失的減毒疫苗、基因重配病毒疫苗等。其中，基因重配病毒疫苗指的是將野生病毒和弱毒病毒一起感染細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中野生病毒的表面抗原基因與弱毒病毒的毒力基因等進(jìn)行基因重組，從而得到含野生病毒的免疫原性和弱毒病毒的毒力的基因重配病毒，適用于基因組分節(jié)段的病毒如流感病毒、輪狀病毒（RV）等。減毒活疫苗具有可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫等全面的免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫原性好，免疫力持久等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)具有重組發(fā)生表型逆轉(zhuǎn)而恢復(fù)其致病性等局限性。在我國(guó)上市和在研的減毒活疫苗，包括脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（OPV）、麻風(fēng)腮聯(lián)合減毒活疫苗、JEV減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗、五價(jià)RV減毒活疫苗、黃熱（YFV）減毒活疫苗、麻風(fēng)腮-水痘聯(lián)合減毒活疫苗、流感減毒活疫苗、HAV減毒活疫苗等。

在減毒活疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于病毒減毒方法的改進(jìn)。使用基因工程技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)減毒活疫苗可控的定向改造。在流感減毒疫苗的研究中，研究人員利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，通過(guò)對(duì)流感病毒基因組進(jìn)行重組、對(duì)NS1基因進(jìn)行截?cái)郲12]和密碼子去優(yōu)化[13]等方式，實(shí)現(xiàn)了流感病毒的定向改造。在OPV的研究中，為了降低減毒活疫苗神經(jīng)毒力回復(fù)的可能性，研究人員對(duì)Sabin2病毒基因組進(jìn)行了5處修飾和改造，從而得到遺傳穩(wěn)定的安全有效的2 型脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株（nOPV2）[14]。nOPV2的5處修飾和改造，包括5' 非編碼區(qū)的2個(gè)修飾（cre5的重新定位和 S15domV的添加）、病毒2C編碼區(qū)內(nèi)部cre的同義突變、病毒3D聚合酶基因的2個(gè)突變（D53N和K38R），通過(guò)降低病毒的突變率和重組頻率的方式，限制病毒毒力回復(fù)的可能性[14]。

1.3 基因工程重組蛋白疫苗

基因工程重組蛋白疫苗指的是通過(guò)基因工程方法，在原核和真核在內(nèi)的各種表達(dá)細(xì)胞中，將病毒抗原蛋白進(jìn)行表達(dá)和組裝，從而得到的病毒蛋白疫苗。根據(jù)疫苗抗原成分和組裝的差異，基因工程重組蛋白疫苗包括多肽疫苗、重組亞單位疫苗和病毒樣顆粒（VLP）疫苗等。

多肽疫苗的研發(fā)依賴(lài)于對(duì)誘導(dǎo)病毒免疫原性的潛在靶點(diǎn)的清晰認(rèn)識(shí)，其中重要的免疫原性位點(diǎn)包括T細(xì)胞抗原表位、B細(xì)胞抗原表位及病毒抗原決定簇等。在此前提下，使用基因工程方法，構(gòu)建多肽片段的表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)不同多肽片段的表達(dá)和組合[15]。多肽疫苗的表達(dá)技術(shù)成熟，產(chǎn)品質(zhì)量可控，但由于其氨基酸數(shù)量較少，誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可能較弱。目前，雖然有多個(gè)病毒多肽疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但尚未批準(zhǔn)上市[16]。

重組亞單位疫苗利用重組DNA技術(shù)，將病毒抗原基因插入到表達(dá)載體后，在細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等原核或真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)[15]。重組亞單位疫苗具有成分單一，生物安全性好，研發(fā)流程成熟，易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。然而，重組蛋白的免疫原性較弱，需要在配合佐劑使用的情況下，通過(guò)多次注射來(lái)完成免疫程序。在我國(guó)上市和在研的重組亞單位疫苗，包括重組VZV疫苗、SARS-CoV-2重組蛋白疫苗（刺突蛋白或受體結(jié)合域蛋白）、重組流感病毒亞單位疫苗、重組呼吸道合胞病毒（RSV）亞單位疫苗等。

VLP疫苗是由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白在表達(dá)平臺(tái)中共表達(dá)或由體外混合的多個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，自發(fā)組裝形成不含病毒遺傳物質(zhì)的病毒樣蛋白顆粒[17]。VLP疫苗與病毒的立體構(gòu)象相同或相似，表現(xiàn)出與天然病毒類(lèi)似的抗原表位，因此可以通過(guò)與病毒感染相同的方式將抗原提呈給免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)出高效的特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫保護(hù)。然而，由于只有個(gè)別病毒的抗原蛋白可以自組裝出VLP，因此VLP疫苗類(lèi)型的適用范圍較差。同時(shí)和其他蛋白疫苗相同，VLP疫苗也需要在佐劑的配合下，通過(guò)多次注射來(lái)完成免疫程序。在我國(guó)上市和在研的VLP疫苗，包括乙型肝炎病毒（HBV）疫苗、人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、重組戊型肝炎病毒（HEV）疫苗[18]、SARS-CoV-2 VLP疫苗等。

在基因工程蛋白疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于基于病毒結(jié)構(gòu)的抗原設(shè)計(jì)、納米顆粒疫苗技術(shù)、蛋白表達(dá)平臺(tái)的選擇和優(yōu)化等。近年來(lái)，隨著病毒結(jié)構(gòu)組學(xué)的發(fā)展，疫苗的抗原可根據(jù)病毒的結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。以RSV疫苗為例，RSV的表面融合糖蛋白（F）作為主要抗原，具有融合前構(gòu)象（pre-F）和融合后構(gòu)象（post-F）。前十幾年開(kāi)發(fā)的RSV疫苗的抗原為post-F構(gòu)象，研究表明該構(gòu)象的疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果較差，而基于pre-F構(gòu)象設(shè)計(jì)的疫苗誘導(dǎo)的中和抗體水平提高，為開(kāi)發(fā)有效的RSV疫苗帶來(lái)希望[19]。此外，納米顆粒疫苗作為一種新興的技術(shù)，不僅可顯著提高疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性，還可實(shí)現(xiàn)靶向遞送和緩釋[20]。研究表明，含20個(gè)DS-Cav1三聚體的納米顆粒RSV疫苗誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)比三聚體DS-Cav1高10倍[19]。另外，蛋白表達(dá)平臺(tái)的不同會(huì)影響病毒蛋白的修飾，尤其是糖基化修飾的差異，從而導(dǎo)致基因工程蛋白疫苗的免疫原性有較大差異。高產(chǎn)酵母重組蛋白表達(dá)平臺(tái)和昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)平臺(tái)被認(rèn)為是低成本的可快速制造疫苗的技術(shù)[21]，其中基于酵母表達(dá)平臺(tái)制造了HBV疫苗和HPV疫苗（Gardasil），基于昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)平臺(tái)制造了重組流感疫苗（Flublok）和HPV疫苗（Cervarix）。此外，值得關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)和無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)作為疫苗生產(chǎn)的新技術(shù)，被應(yīng)用于HIV疫苗[22]、流感病毒疫苗[23]、HAV疫苗的研究中。

1.4 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗是一種新興的疫苗類(lèi)型，其病毒顆粒內(nèi)部基因組經(jīng)過(guò)基因工程技術(shù)改造，包含了一個(gè)或多個(gè)目的病毒的抗原基因[24]。病毒載體疫苗感染人體后，通過(guò)表達(dá)目的病毒的抗原蛋白，來(lái)誘導(dǎo)針對(duì)目的病毒的免疫反應(yīng)。根據(jù)是否保留病毒載體復(fù)制相關(guān)的基因片段，病毒載體疫苗可以分為復(fù)制型病毒載體疫苗和非復(fù)制型病毒載體疫苗[25]。目前，多種病毒載體被應(yīng)用于疫苗開(kāi)發(fā)[26]，包括無(wú)包膜雙鏈DNA病毒載體[腺病毒（AdV）、痘病毒、皰疹病毒等]、無(wú)包膜單鏈DNA病毒載體[腺相關(guān)病毒（AAV）等]、有包膜的單股正鏈RNA病毒載體（甲病毒、黃病毒等）、有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒載體[麻疹病毒（MV）和水泡性口炎病毒（VSV）等][27]，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體等[28]。病毒載體疫苗具有良好的安全性和遺傳可塑性，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，制備周期短，可實(shí)現(xiàn)快速放大。同時(shí)，病毒載體疫苗可用于呼吸道黏膜接種，從而有效抵御呼吸道病毒的侵襲。然而，機(jī)體可能預(yù)存有針對(duì)病毒載體的抗體，從而影響疫苗的免疫效果和適用人群。因此，病毒載體疫苗只適用于單次接種，而且可能會(huì)影響相同病毒載體的其他病毒疫苗的免疫效果。已上市和在研的病毒載體疫苗，包括新冠腺病毒載體疫苗[26]、埃博拉腺病毒載體疫苗[29]等。

在病毒載體疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于病毒載體的選擇和改造[30]，目前最常用的病毒載體為AdV和VSV。其中，AdV作為疫苗載體，具有宿主范圍廣，可選擇血清型多，可誘導(dǎo)強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及可誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫等優(yōu)勢(shì)[31]，被廣泛應(yīng)用于SARS-CoV-2疫苗[26]和EBOV疫苗[29]的研究中。為了規(guī)避腺病毒載體的預(yù)存抗體問(wèn)題，新冠病毒載體疫苗還選擇了罕見(jiàn)的人腺病毒載體26型，以及非人類(lèi)腺病毒如黑猩猩腺病毒載體等[32]。此外，VSV為單負(fù)鏈RNA病毒，基因組約11 kb，可外源插入4.5 kb的基因片段。通過(guò)基因重排或基因刪除技術(shù)可制備出減毒VSV，同時(shí)外源插入基因穩(wěn)定，表達(dá)水平較高，因此VSV病毒載體被廣泛應(yīng)用于EBOV[33]、MARV[34]、SARSCoV-2（VSV-ΔG-spike）[35]、RSV[36-37]、尼 帕 病 毒（NiV）[38]、拉沙病毒（LASV）[39]、基孔肯尼亞熱病毒（CHIKV）[40]、寨卡病毒（ZIKV）[40]、HIV[41]等疫苗的研究中[42]。

1.5 核酸疫苗

核酸疫苗是一種新興的疫苗類(lèi)型，被稱(chēng)為第3代疫苗技術(shù)，包括DNA疫苗和RNA疫苗。核酸疫苗需要通過(guò)脂質(zhì)體或電刺激方法，將疫苗有效導(dǎo)入到宿主細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)行蛋白翻譯及翻譯后修飾。核酸疫苗的抗原以天然形式進(jìn)行呈遞，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效的體液免疫和細(xì)胞免疫?？乖ㄟ^(guò)主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類(lèi)分子途徑激活CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CLT），產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答?？乖ㄟ^(guò)MHCⅡ類(lèi)分子途徑激活CD4+T細(xì)胞，同時(shí)刺激活化B細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體和體液免疫應(yīng)答。核酸疫苗開(kāi)發(fā)和更新所需時(shí)間短，并且沒(méi)有病毒載體感染風(fēng)險(xiǎn)。然而，核酸疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性較差，對(duì)遞送技術(shù)和產(chǎn)品運(yùn)輸環(huán)節(jié)的溫度要求較高，并且技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)尚不成熟，安全性有待進(jìn)一步評(píng)估。

DNA疫苗的研發(fā)過(guò)程，包括表達(dá)載體的優(yōu)化和構(gòu)建，目的基因的改造和密碼子優(yōu)化，佐劑的選擇，制劑過(guò)程的優(yōu)化等。目前只有動(dòng)物DNA疫苗上市，如馬用預(yù)防西尼羅河病毒感染的DNA疫苗、H5亞型禽流感DNA疫苗等。目前尚無(wú)人用DNA疫苗上市，但在研的DNA病毒疫苗種類(lèi)很多，包括SARS-CoV-2（INO-4800）[43]、流 感 病 毒[44]、SARS-CoV[45]、MERS-CoV[46]、HIV[47]、ZIKV[48]、裂谷熱病毒（RVF）[49]等。

在DNA疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于DNA表達(dá)載體的選擇和改造，以及遞送系統(tǒng)的改進(jìn)。DNA表達(dá)載體可以在大腸埃希菌中大量繁殖，其中抗生素抗性基因使得質(zhì)?？梢苑€(wěn)定遺傳。然而由于抗性基因?qū)τ谌祟?lèi)來(lái)說(shuō)是非功能性序列，因此新一代的DNA疫苗表達(dá)載體刪除或替換了抗性基因元件[50-51]。此外，研究人員還構(gòu)建了不含細(xì)菌骨架的最小DNA表達(dá)載體，如半合成的小環(huán)DNA[52]和全合成的Doggybone載體[53]等。DNA疫苗必須通過(guò)內(nèi)吞或胞飲作用穿過(guò)細(xì)胞膜，同時(shí)不被胞質(zhì)內(nèi)體、溶酶體和核酸酶降解，從而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。因此，DNA疫苗常規(guī)肌肉注射的效力很低，高效的遞送系統(tǒng)對(duì)DNA疫苗在宿主體內(nèi)的表達(dá)以及疫苗的免疫原性強(qiáng)度至關(guān)重要。目前，DNA疫苗使用最多的遞送方法是利用基因槍、微針、體內(nèi)電穿孔進(jìn)行注射。此外，新興的納米顆粒技術(shù)具有良好的生物相容性、生物降解性，可包封DNA疫苗靶向宿主細(xì)胞，從而提高DNA疫苗的轉(zhuǎn)染效率和免疫原性。納米顆粒常用的材料包括含有陽(yáng)離子脂質(zhì)和膽固醇的脂質(zhì)體，聚乳酸-乙醇酸共聚物、殼聚糖等可生物降解材質(zhì)，以及聚乙烯亞胺聚合物等高分子聚合物[54]。

mRNA疫苗作為創(chuàng)新型疫苗類(lèi)型，其制備工藝簡(jiǎn)單快速，易規(guī)?；a(chǎn)，且免疫原性強(qiáng)，在應(yīng)對(duì)COVID-19疫情中發(fā)揮了其他疫苗類(lèi)型不可比擬的優(yōu)勢(shì)[55]。mRNA疫苗的構(gòu)建、生產(chǎn)、純化、佐劑等對(duì)于不同病原體是通用的，因此在一個(gè)成熟的設(shè)施中可以生產(chǎn)多種病原體疫苗，從而顯著降低疫苗生產(chǎn)的成本和時(shí)間[56]。根據(jù)是否含有亞基因組啟動(dòng)子和編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的開(kāi)放讀碼框（ORF），mRNA疫苗包括非復(fù)制型mRNA疫苗和自我復(fù)制型mRNA疫苗。mRNA疫苗的基因序列包含5'端帽結(jié)構(gòu)、5' 非翻譯區(qū)（UTR）、目的基因ORF、3'UTR和3' 端的poly A尾等基本元件，這些元件對(duì)于產(chǎn)生穩(wěn)定的成熟mRNA、延長(zhǎng)mRNA的半衰期、增強(qiáng)mRNA的翻譯等具有重要作用[24]。目前，已上市和在研的mRNA病毒疫苗，包括SARSCoV-2疫 苗（mRNA-1273、BNT162b2）[57-58]、流感病毒疫苗（HA mRNA-LNP）[59]、RSV疫苗[60]、ZIKV疫苗[61]、EBOV疫苗[62]和HIV疫苗[63]等。

在RNA疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于mRNA序列元件的改造、編碼序列的修飾、遞送系統(tǒng)的選擇和改進(jìn)，以及新型RNA疫苗的研發(fā)[64]。使用抗反向帽類(lèi)似物（ARCA）修飾5'端帽結(jié)構(gòu)，可提高蛋白翻譯的效率和正確性[65]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)mRNA疫苗的核苷酸進(jìn)行硫代尿嘧啶、甲基胞嘧啶、假尿嘧啶等化學(xué)修飾，可減少固有免疫激活并增加mRNA的翻譯[66]。此外，對(duì)mRNA疫苗的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可提高mRNA翻譯的蛋白質(zhì)質(zhì)量[67]。目前，已有多種新型的納米遞送技術(shù)用于mRNA疫苗的遞送，包括魚(yú)精蛋白陽(yáng)離子多肽遞送技術(shù)、聚乙烯亞胺高分子聚合物遞送技術(shù)、脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)（LNPs）、基于MF59的納米乳劑技術(shù)等[68-70]。然而，納米遞送技術(shù)的作用機(jī)制、安全性、質(zhì)量可控性等仍需進(jìn)一步明確和規(guī)范。除mRNA外，環(huán)狀RNA（circRNA）也正在被探索作為疫苗的可能性[71]。在SARS-CoV-2疫苗的研究中，高度穩(wěn)定的circRNA疫苗可誘導(dǎo)有效的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且產(chǎn)生的中和抗體水平較高[72]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用脂質(zhì)體包裹的circRNA疫苗免疫，可為小鼠和恒河猴提供針對(duì)SARS-CoV-2的強(qiáng)大保護(hù)[72]?；贒elta變異株RBD區(qū)設(shè)計(jì)的circRNA疫苗，可提供針對(duì)SARS-CoV-2變異株的廣譜保護(hù)[72]。

2 病毒疫苗的研發(fā)難點(diǎn)

對(duì)人類(lèi)有重大影響的流行性病毒疫苗和新突發(fā)傳染病病毒疫苗的研發(fā)，以及現(xiàn)有病毒疫苗的更新?lián)Q代，均存在各自的研究難點(diǎn)或瓶頸。研究人員可通過(guò)深入探究病毒的限制、機(jī)體免疫反應(yīng)的限制、疫苗類(lèi)型的限制、接種途徑和遞送系統(tǒng)的限制和佐劑的限制等，從中尋找出解決病毒疫苗研發(fā)瓶頸的有效突破口，從而實(shí)現(xiàn)新疫苗的研發(fā)和現(xiàn)有疫苗的更新。

2.1 病毒的限制

不同病毒發(fā)揮抗原作用的蛋白有巨大差異，例如冠狀病毒的主要抗原為Spike蛋白，流感病毒的主要抗原為HA蛋白，RABV的主要抗原為G蛋白，RSV的主要抗原為F蛋白，HPV、EV71、脊髓灰質(zhì)炎病毒等病毒的主要抗原為病毒的衣殼蛋白等。因此，合適的抗原決定了免疫應(yīng)答的特異性和靶向性，對(duì)疫苗研發(fā)的成敗具有決定性的作用。然而自然界中的病毒十分復(fù)雜，抗原的選擇和設(shè)計(jì)具有很大難度。一些病毒高度變異，不斷進(jìn)化造成對(duì)現(xiàn)有疫苗的免疫逃逸，如HIV、SARS-CoV-2等[73]。一些病毒具有多個(gè)亞型，并且各亞型之間的交叉保護(hù)較差，如HPV、DENV、流感病毒等[74]。其中，DENV的4個(gè)血清型之間無(wú)交叉免疫，同型別感染可實(shí)現(xiàn)終身免疫，由DENV引起的疾病在首次感染時(shí)具有自限性，但抗體依賴(lài)性增強(qiáng)效應(yīng)會(huì)增加異型病毒第2次感染的死亡率，從而加大了疫苗的研發(fā)難度[75]。此外，一些病毒的抗原具有2個(gè)構(gòu)象，如RSV的F蛋白具有pre-F和post-F構(gòu)象，不同構(gòu)象誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不同，也加大了疫苗的研發(fā)難度[76]。此外，黃病毒和冠狀病毒疫苗免疫可能造成機(jī)體產(chǎn)生ADE效應(yīng)，嚴(yán)重阻礙和減緩了疫苗的研發(fā)進(jìn)展[77]。因此，加強(qiáng)對(duì)病毒抗原的結(jié)構(gòu)、功能、致病性、型別差異等基礎(chǔ)研究，突破病毒抗原認(rèn)識(shí)不清的限制，是病毒疫苗研發(fā)首先要解決的問(wèn)題。

2.2 機(jī)體免疫反應(yīng)的限制

機(jī)體的免疫反應(yīng)是疫苗發(fā)揮作用的第一步，不同機(jī)體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)類(lèi)型和強(qiáng)度的差異，也導(dǎo)致了疫苗保護(hù)效果的差異。嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚不成熟，在成人中免疫原性很好的疫苗，可能在嬰幼兒中無(wú)法誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)[78]。在聯(lián)合疫苗的設(shè)計(jì)時(shí)，要考慮嬰幼兒免疫系統(tǒng)的可承受范圍。另外，老年人的免疫系統(tǒng)退化，一些疫苗能在兒童或成年人中發(fā)揮保護(hù)作用，但卻無(wú)法保護(hù)老年人群[79]。同時(shí)，疫苗研發(fā)過(guò)程中還應(yīng)充分考慮免疫缺陷人群和過(guò)敏人群，避免疫苗接種給機(jī)體帶來(lái)的免疫受損或過(guò)激[80]。因此，深入研究不同人群的免疫系統(tǒng)差異，在疫苗研發(fā)過(guò)程中將目標(biāo)人群的免疫系統(tǒng)特點(diǎn)加以考慮，是病毒疫苗研發(fā)成功至關(guān)重要的一步。

2.3 疫苗類(lèi)型的限制

疫苗類(lèi)型、疫苗表達(dá)系統(tǒng)均對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響，也會(huì)誘導(dǎo)出差異巨大的免疫反應(yīng)。疫苗的有效保護(hù)需要機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性的中和抗體和細(xì)胞免疫，而非結(jié)合抗體和非特異性的細(xì)胞免疫?，F(xiàn)有的疫苗類(lèi)型均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)[81]。滅活疫苗和重組蛋白亞單位疫苗僅能誘導(dǎo)體液免疫，而CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)較差。減毒活疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)較為全面，但是存在毒力回復(fù)的可能性，而且接種免疫缺陷人群免疫后可能不會(huì)較快被清除，在機(jī)體內(nèi)存在較長(zhǎng)時(shí)間。病毒載體疫苗能夠誘導(dǎo)較為全面的免疫反應(yīng)，但會(huì)產(chǎn)生病毒載體相應(yīng)的抗體，影響相同病毒載體疫苗的再次使用。DNA疫苗的開(kāi)發(fā)周期短、無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，但其免疫原性較差。RNA疫苗具有較好的免疫原性，但是疫苗穩(wěn)定性差、遞送系統(tǒng)復(fù)雜、質(zhì)控難度較大。隨著mRNA疫苗在應(yīng)對(duì)COVID-19真實(shí)世界中的良好表現(xiàn)，mRNA疫苗被認(rèn)為是最有前景的疫苗開(kāi)發(fā)平臺(tái)。一些病毒使用傳統(tǒng)疫苗類(lèi)型無(wú)法開(kāi)發(fā)出有效疫苗，目前也正在嘗試mRNA疫苗類(lèi)型，期待mRNA疫苗能夠帶來(lái)更多安全性和保護(hù)性滿(mǎn)意的病毒疫苗[55]。因此，在病毒疫苗研發(fā)的初期，需要根據(jù)病毒感染、傳播和致病特性的差異，選擇和設(shè)計(jì)合適的疫苗類(lèi)型，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生能夠遏制病毒感染的免疫反應(yīng)。

2.4 接種途徑和遞送系統(tǒng)的限制

疫苗接種途徑多種多樣，包括肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、口服、鼻腔吸入、經(jīng)皮免疫[82]等。不同的接種途徑誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度、廣度、部位等有很大差異，原則上疫苗接種途徑與自然感染途徑越相似，疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果就越理想。黏膜免疫是抵御呼吸道病毒和腸道病毒侵襲的第一道防線(xiàn)，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用[83]，機(jī)體能否產(chǎn)生足夠的黏膜免疫是呼吸道病毒和腸道病毒研發(fā)的重點(diǎn)。因此，雖然現(xiàn)有的疫苗接種途徑多為注射方式，但腸道病毒的減毒活疫苗通常通過(guò)口服途徑接種，呼吸道病毒的減毒活疫苗和病毒載體疫苗通常通過(guò)鼻腔吸入途徑接種。目前，HBV疫苗、RABV疫苗、HPV疫苗等通過(guò)肌肉注射接種，MV疫苗、JEV疫苗等通過(guò)皮下注射接種，卡介苗、牛痘疫苗通過(guò)皮內(nèi)注射或劃痕接種，OPV疫苗、口服RV疫苗等通過(guò)口服途徑接種[84]，鼻噴流感病毒疫苗等通過(guò)鼻腔吸入途徑接種。注射接種途徑可能造成疼痛、交叉污染等問(wèn)題，因此非侵入性免疫接種是目前的研究熱點(diǎn)[85]。非侵入性免疫接種途徑可減輕或消除疼痛，但是也有很多限制因素。疫苗口服接種后，需要經(jīng)過(guò)胃的酸性環(huán)境，然后在腸道中發(fā)揮免疫作用。在此過(guò)程中，很多抗原失去功能，可能導(dǎo)致抗原濃度過(guò)低，不足以誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)的情況[84]。鼻腔吸入可通過(guò)干粉吸入器和噴射霧化器來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此對(duì)噴入器械、霧化方式、加壓系統(tǒng)等有較高的要求[86]。

納米顆粒遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和研究，促進(jìn)了重組蛋白疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗的使用[87]。目前用于疫苗的納米顆粒，包括脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）[88]、聚合物納米顆粒（含殼聚糖、葡聚糖等）[89]、蛋白質(zhì)納米顆粒（含鐵蛋白、丙酮酸脫氫酶等）[90]、無(wú)機(jī)納米顆粒（含金、鐵、二氧化硅等）[91-92]和仿生納米顆粒（含細(xì)胞膜、精氨酰甘氨酰天冬氨酸修飾等）[93-94]等。不同類(lèi)型的納米載體在體內(nèi)具有不同的物理化學(xué)特征和行為，從而相應(yīng)地影響疫苗的免疫效果。其中，LNPs遞送系統(tǒng)的成熟，使得新冠病毒mRNA疫苗的批準(zhǔn)使用成為現(xiàn)實(shí)。此外，微針遞送系統(tǒng)的發(fā)展使經(jīng)皮免疫途徑成為可能，通過(guò)微針免疫的體液免疫與皮下注射相當(dāng)[85]。目前的微針類(lèi)型包括實(shí)心針、空心針、藥物涂層針、溶解針和微針陣列等，被應(yīng)用于MV疫苗[95]、腺病毒載體ZIKV疫苗[96]、滅活RV疫苗[97]、IPV疫苗[98]、天花DNA疫苗[99]中。因此，疫苗接種途徑的選擇和遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，可實(shí)現(xiàn)病毒疫苗的最優(yōu)免疫保護(hù)效果。

2.5 佐劑的限制

佐劑可增強(qiáng)和調(diào)節(jié)疫苗引起的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度、廣度和持久性，對(duì)于提高滅活疫苗、重組蛋白疫苗等免疫原性較差的疫苗類(lèi)型的保護(hù)力至關(guān)重要[100]。佐劑通過(guò)促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞緩釋和攝取、激活注射部位的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、激活Toll樣受體、調(diào)節(jié)輔助T（helper T，Th）細(xì)胞（Th1/Th2/Th17）免疫應(yīng)答的平衡等方式，觸發(fā)和調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[101]。然而佐劑的作用機(jī)制尚不完全清楚，目前僅有氫氧化鋁佐劑（HBV、HPV疫苗等）、MF59佐劑（三價(jià)流感滅活疫苗Fluad）、AS01佐劑（VZV疫苗Shingrix）、AS03佐劑（大流行性流感疫苗Pandemrix）、AS04佐劑（HPV疫苗Cervarix）、CpG1018佐劑（HBV疫苗Heplisav-B）等應(yīng)用于疫苗中[101]。因此，佐劑作用機(jī)制的基礎(chǔ)研究，以及低毒性、高效力的佐劑使用許可，是病毒疫苗研究的瓶頸之一。

3 需加快研發(fā)的病毒疫苗

3.1 對(duì)人類(lèi)有重大影響的流行病毒疫苗

世界范圍內(nèi)許多廣泛傳播和流行的病毒，如HIV、RSV、DENV等，對(duì)人類(lèi)社會(huì)造成了重大影響，但利用傳統(tǒng)方法尚未研制出針對(duì)上述病毒有效的預(yù)防性或治療性疫苗，因此研究人員正嘗試研發(fā)基因工程蛋白疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗等新型疫苗類(lèi)型。其中，HIV疫苗設(shè)計(jì)的目標(biāo)是誘導(dǎo)產(chǎn)生能夠識(shí)別一系列不同毒株的廣譜中和抗體和功能性T細(xì)胞免疫反應(yīng)[102]。利用生物信息學(xué)設(shè)計(jì)的多價(jià)嵌合馬賽克疫苗[103]、新型病毒載體疫苗（Ad26、Ad35、CMV）、重組可溶性Env三聚體蛋白疫苗[104]、基于Env gp120和Gag結(jié)構(gòu)蛋白設(shè)計(jì)的mRNA疫苗[105-106]等在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出巨大潛力，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)[107]。同時(shí)，RSV的發(fā)現(xiàn)已超過(guò)60年，但目前仍無(wú)有效的疫苗來(lái)預(yù)防RSV的感染[108]。目前，基于RSV pre-F蛋白的mRNA疫苗[60]、重組Ad26病毒載體疫苗[109]、重組亞單位疫苗[110]等的臨床試驗(yàn)顯示出了良好的安全性和耐受性，以及對(duì)F蛋白特異的體液免疫和細(xì)胞免疫。另外，全世界每年均有上千萬(wàn)人感染DENV，波及全球100多個(gè)國(guó)家。唯一獲批的四價(jià)嵌合黃熱病毒-登革熱減毒活疫苗（CYD-TDV）的長(zhǎng)期隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，DENV未感染人群接種后發(fā)生嚴(yán)重登革熱和住院的風(fēng)險(xiǎn)均有所增加，因此迫切需要更安全、更有效的第2代登革熱疫苗。目前，候選疫苗的研究主要集中于四價(jià)減毒活疫苗、滅活疫苗和mRNA疫苗[111-112]。除了預(yù)防性疫苗外，對(duì)于那些容易引起慢性、持續(xù)性感染和誘發(fā)腫瘤相關(guān)的病毒，應(yīng)加快研發(fā)針對(duì)此類(lèi)病毒的治療性疫苗，如：乙肝治療性疫苗[113]、宮頸癌治療性疫苗[114]、艾滋病治療性疫苗[115]、鼻咽癌治療性疫苗[116]等。

3.2 新突發(fā)傳染病病毒疫苗

近些年來(lái)，許多傳染性疾病由野生動(dòng)物宿主外溢到人類(lèi)群體中，給人類(lèi)社會(huì)帶來(lái)了巨大的公共衛(wèi)生壓力。盡管已研制出許多人類(lèi)疫苗并投入使用，但傳染病仍然威脅著人們的健康，尤其是新突發(fā)傳染病的暴發(fā)[77]。在對(duì)抗新發(fā)突發(fā)病毒中，重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等新型疫苗平臺(tái)，比傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗的研制快捷，并且通常誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更具有保護(hù)效力。一旦疫苗平臺(tái)滿(mǎn)足了安全性和有效性要求，針對(duì)新突發(fā)病毒只需替換相應(yīng)抗原基因，便可用相同的系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)和純化，進(jìn)一步簡(jiǎn)化疫苗的研發(fā)進(jìn)程。因此，為了應(yīng)對(duì)絲狀病毒（EBOV[117]和MARV[118]）、沙粒病毒（LASV[119]）、副黏病毒（NiV[120]和亨德拉病毒）、黃病毒（DENV[121]、西尼羅河病毒W(wǎng)NV[122]、ZIKV[123]）、披膜病毒（CHIKV[124]）和冠狀病毒（SARS-CoV、MERS-CoV[125]、SARS-CoV-2）[126]等的突發(fā)和流行，亟待相應(yīng)病毒的疫苗儲(chǔ)備。

4 結(jié)語(yǔ)

目前，伴隨著生物工程新技術(shù)和疫苗研發(fā)新平臺(tái)的發(fā)展和應(yīng)用，以及前沿技術(shù)的交叉融合和多平臺(tái)的協(xié)作共進(jìn)，病毒疫苗的設(shè)計(jì)思路和病毒載體等得到了快速發(fā)展和更新。同時(shí)，病毒疫苗的研發(fā)取得許多重要的突破，也推進(jìn)了創(chuàng)新型病毒疫苗的研究進(jìn)展。本文歸納總結(jié)了病毒疫苗的眾多類(lèi)型以及病毒疫苗面臨的諸多困難和挑戰(zhàn)，指出了需加快對(duì)人類(lèi)有重大影響的流行病毒疫苗和新突發(fā)傳染病病毒疫苗的研制。因此，加強(qiáng)和加快對(duì)病原體、機(jī)體免疫反應(yīng)、疫苗類(lèi)型和新技術(shù)、佐劑等的基礎(chǔ)研究，是應(yīng)對(duì)新發(fā)、突發(fā)、高變異、高難度病毒疫苗研制的破解之道。