張輝，劉建陽，毛群穎，梁爭論，徐苗

（中國食品藥品檢定研究院，北京 102629）

信使RNA（messenger RNA，mRNA）疫苗是將編碼外源目的基因序列通過轉(zhuǎn)錄、合成等工藝制備的mRNA通過特定遞送系統(tǒng)導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，利用機(jī)體細(xì)胞蛋白質(zhì)合成機(jī)制表達(dá)目的蛋白、刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，獲得免疫保護(hù)的一種核酸制劑[1]。1961年，Brenner等[2]首次發(fā)現(xiàn)mRNA是一種中間遺傳物質(zhì)。1989年，Malone等[3]提出基于mRNA的藥物相關(guān)概念。1990年，Wolff等[4]將體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA直接注射入小鼠骨骼肌細(xì)胞中，首次在動物體內(nèi)成功表達(dá)外源mRNA。2005年，Karikó等[5]發(fā)現(xiàn)mRNA修飾可降低機(jī)體對外源mRNA的免疫反應(yīng)。近年來，在mRNA修飾[6]、mRNA疫苗遞送系統(tǒng)[7-8]等方面研究取得了關(guān)鍵性進(jìn)展，顯著地提升了mRNA翻譯效率和穩(wěn)定性、提高了mRNA疫苗的免疫原性和安全性[9]。和傳統(tǒng)疫苗相比，mRNA疫苗具有以下優(yōu)勢：1）mRNA及其遞送系統(tǒng)可通過正常細(xì)胞代謝實現(xiàn)降解，不會整合到機(jī)體細(xì)胞基因組中[10]。生產(chǎn)過程中不涉及活病毒的操作，生物安全風(fēng)險低。2）各種修飾和遞送系統(tǒng)可促使mRNA更穩(wěn)定和實現(xiàn)更高效翻譯[7]。mRNA具有自佐劑的效應(yīng)，具有較強(qiáng)的免疫原性[11-12]。3）完成序列設(shè)計和驗證后，可直接體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，具備快速擴(kuò)大生產(chǎn)至數(shù)十億劑疫苗的能力，可滿足重大新發(fā)突發(fā)傳染病暴發(fā)時疫苗接種需要[11,13-14]。2021年8月23日，mRNA新冠病毒疫苗BNT162b2（Comirnaty?）獲美國食品和藥品管理局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市，成為全球首個被正式獲批上市的新冠病毒疫苗[15]。目前，全球共34款mRNA新冠病毒疫苗進(jìn)入臨床試驗，其中我國7款，數(shù)量位居全球前列[16]。

全球?qū)RNA新冠病毒疫苗大量的需求也對疫苗質(zhì)控提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[17]。mRNA疫苗的生產(chǎn)涉及多個生物過程和原材料的加工處理，如大量體外轉(zhuǎn)錄（in vitrotranscribed，IVT）、mRNA加工修飾、mRNA脂質(zhì)體包裹等，生產(chǎn)過程中面臨著污染和引入雜質(zhì)的風(fēng)險，需研究建立多個和疫苗特性相關(guān)的如鑒別、含量、完整性和包封率等全新關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)及其檢測方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而殘留模板DNA、不完全mRNA、脂質(zhì)組分降解等檢測方法難度較大[18-19]。此外，已上市疫苗需低溫保存，疫苗穩(wěn)定性也為疫苗重要風(fēng)險之一[20]。我國mRNA疫苗發(fā)展迅速，然而疫苗質(zhì)控方面仍缺乏統(tǒng)一的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，影響疫苗的研發(fā)進(jìn)程。本文通過梳理mRNA疫苗質(zhì)控現(xiàn)有國內(nèi)外有限的指南文件和文獻(xiàn)，總結(jié)歸納疫苗質(zhì)控的考慮要點(diǎn)，以期為mRNA疫苗質(zhì)量控制提供參考。

1 mRNA疫苗成分和生產(chǎn)工藝

mRNA疫苗由編碼抗原的活性成分mRNA和輔料組成。輔料包括遞送載體、緩沖液、糖類和分散劑[21]。脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles，LNP）是最常用的遞送系統(tǒng)，可包裹mRNA后遞送到細(xì)胞內(nèi)。為避免mRNA降解，mRNA-LNP通常低溫儲存和運(yùn)輸，其中糖類作為冷凍保護(hù)劑，可避免mRNALNP結(jié)構(gòu)遭到破壞[21]。mRNA疫苗生產(chǎn)過程包括DNA模板的制備、mRNA原液制備、mRNA疫苗制劑及灌裝3個階段[22-24]，其具體步驟（見圖1）：1）種子活化。從種子庫中取出凍存的種子，活化后接種發(fā)酵。2）質(zhì)粒大量提取純化。大腸埃希菌大批量發(fā)酵培養(yǎng)、完成質(zhì)粒的提取和純化。3）DNA模板制備。通過對質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA純化獲得線性DNA模板。4）mRNA的體外轉(zhuǎn)錄和加工。以線性DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工或共轉(zhuǎn)錄的方法獲得大量mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。5）mRNA純化。體外轉(zhuǎn)錄加工的產(chǎn)物經(jīng)純化后獲得mRNA原液。6）mRNA-LNP制劑制備。采用沖擊式射流混合法、微流控混合法等技術(shù)將mRNA原液和LNP按一定比例進(jìn)行精確混合后形成粒徑均一的包裹mRNA的納米脂質(zhì)體，經(jīng)超濾換液等步驟，去除雜質(zhì)后制成mRNA-LNP制劑中間產(chǎn)物。7）mRNA疫苗灌裝。mRNA-LNP制劑中間產(chǎn)物通過質(zhì)量檢測后進(jìn)行無菌灌裝，獲得mRNA疫苗成品[23-24]。

圖1 mRNA疫苗生產(chǎn)工藝流程圖Figure 1 Flow chart of mRNA vaccine manufacturing processes

2 mRNA疫苗質(zhì)量控制

2.1 mRNA疫苗質(zhì)量控制相關(guān)指南文件

2020年8月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（Center for Drug Evaluation，CDE）發(fā)布了《新型冠狀病毒預(yù)防性疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，用于指導(dǎo)特殊應(yīng)急狀態(tài)下mRNA疫苗的研發(fā)[1]。2020年12月2日，輝瑞和BioNTech公司合作研發(fā)的mRNA新冠病毒疫苗BNT162b2在英國獲批緊急使用，同月世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布了“評估基于RNA的傳染病預(yù)防性疫苗的質(zhì)量、安全性和有效性：監(jiān)管考慮因素”的指南文件[25-26]。近期，美國藥典委員會（United States Pharmacopeia，USP）為幫助研發(fā)者及企業(yè)免于將大量精力和資源用于自建檢測方法，同時提升監(jiān)管部門對企業(yè)疫苗進(jìn)行有效質(zhì)控的信心，頒布了針對疫苗鑒別、含量、完整性、純度以及安全性和其他6類關(guān)鍵質(zhì)量屬性的通用檢測方法和操作細(xì)則[27]。現(xiàn)有的各指南均基于目前mRNA疫苗公開發(fā)布的信息，許多候選mRNA疫苗的細(xì)節(jié)如檢測項目以及分析方法和接受標(biāo)準(zhǔn)并未公開[28-29]，這影響了mRNA疫苗質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)化和一致性研究，以及具體的國際指南制定[30-31]。

2.2 質(zhì)控項目和標(biāo)準(zhǔn)制定

2.2.1 質(zhì)控項目mRNA疫苗核酸結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)體包裹制劑的特性決定了該類疫苗質(zhì)控的特點(diǎn)。mRNA序列和完整性、含量及純度、加帽率和包封率是疫苗特有的決定有效性和安全性的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)[31-33]。目前指南文件和文獻(xiàn)報道疫苗質(zhì)控項目主要包括如下幾個方面。1）原材料質(zhì)控：WHO指南要求對以DNA模板為主的原材料應(yīng)進(jìn)行檢定和簽發(fā)，應(yīng)提供有關(guān)其來源、質(zhì)量控制、穩(wěn)定性等相關(guān)信息；要求確保包裝材料不會對疫苗的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，作為質(zhì)量控制的一部分，需要對包裝材料進(jìn)行封閉完整性測試和可提取物和（或）可分離物的評估[26]。CDE指導(dǎo)原則要求如DNA模板制備涉及質(zhì)粒構(gòu)建及工程菌的使用應(yīng)建立種子庫系統(tǒng)，并需獲得國家藥檢機(jī)構(gòu)的檢定報告。CDE要求提供工程菌以外的生產(chǎn)用其他原材料和輔料的來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢定報告，要求提供直接接觸制品的包裝材料和容器的來源、選擇依據(jù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等研究材料[1]。2）原液質(zhì)控：除安全性指標(biāo)外，mRNA疫苗原液階段質(zhì)控主要包括mRNA鑒定和雜質(zhì)控制2個部分。mRNA鑒定包括外觀、鑒別、pH值、序列長度、序列完整性及準(zhǔn)確性、含量、加帽率、加尾結(jié)構(gòu)或長度和純度等指標(biāo)。疫苗雜質(zhì)包括產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（如不完整mRNA、雙鏈RNA等）和工藝相關(guān)雜質(zhì)（如殘留蛋白酶、DNA模板殘留、金屬離子殘留等）。3）成品質(zhì)控：成品階段除常規(guī)的疫苗外觀、裝量、pH值、安全性和效力項目外，質(zhì)控項目主要針對mRNA鑒定（鑒別、含量、純度、完整性），遞送系統(tǒng)各組分鑒定（鑒別、含量），制劑特性項目[包封率、納米顆粒粒徑、分散系數(shù)（PDI）、Zeta電位]以及工藝相關(guān)雜質(zhì)殘留（有機(jī)溶劑等）3個部分。

CDE建議在研發(fā)早期階段檢測疫苗體內(nèi)效力，上市后通過足夠批次的體內(nèi)和體外效力數(shù)據(jù)及其與臨床批次的對比分析，再評價體外效力代替體內(nèi)效力的可行性[1]。WHO指南明確指出應(yīng)考慮建立適當(dāng)?shù)捏w外替代方法來進(jìn)行效力評價，在產(chǎn)品放行時建立體外方法和動物模型中效力的橋接是非常重要的。對安全性指標(biāo)，CDE認(rèn)為安全性指標(biāo)通常包括異常毒性檢查，而WHO則不要求進(jìn)行異常毒性檢查[1,26]。

2.2.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究時需從產(chǎn)品的設(shè)計目標(biāo)著手，全面考慮安全性、有效性、工藝、檢測方法、穩(wěn)定性等內(nèi)容，依據(jù)所使用檢測方法總誤差、多批次、臨床批次和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)綜合制定[34]。

WHO認(rèn)為在研發(fā)早期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可寬松，最終標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)基于臨床試驗中已被證明安全有效的批次檢測結(jié)果制定，如疫苗效力標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)基于臨床試驗中證明療效的最低劑量以及人類免疫原性數(shù)據(jù)設(shè)定，同時要求提供分析方法和接受限度的描述。CDE要求疫苗申報臨床時可根據(jù)工藝確認(rèn)資料，初步確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；上市階段應(yīng)按照相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行風(fēng)險控制分析，并結(jié)合工藝驗證情況提供完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1,26]。

2.3 檢測方法

2.3.1 檢測方法建立和驗證mRNA疫苗是全新的疫苗種類，檢測方法是疫苗質(zhì)控的基礎(chǔ)；針對mRNA、脂質(zhì)體和制劑的特性以及相關(guān)雜質(zhì)等mRNA疫苗關(guān)鍵質(zhì)量屬性，研發(fā)企業(yè)應(yīng)建立檢測方法[35]。近期頒布的美國藥典通則<1220>將生命周期管理理念應(yīng)用到檢測方法中，使方法設(shè)計、確認(rèn)、轉(zhuǎn)移和驗證活動整合到檢測方法生命周期過程中，并將其視為一個連續(xù)動態(tài)而非割裂的不同獨(dú)立階段的活動，以提升分析方法的質(zhì)量水平[36]。ICHQ2（R2）及Q14征求意見稿進(jìn)一步明確了對檢測方法建立和驗證的技術(shù)要求[37-38]。

CDE要求申報臨床時提供的方法學(xué)驗證資料應(yīng)能初步證實檢測方法的適用性，對關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如包封率、加帽率、效力等）的檢測方法，應(yīng)提供驗證與研發(fā)階段控制及重要性相符或適用的資料，在上市階段應(yīng)提供全面的方法學(xué)驗證資料。對產(chǎn)品安全性相關(guān)的質(zhì)控指標(biāo)（如微生物污染控制指標(biāo)、有害物質(zhì)殘留等），建議盡早進(jìn)行方法學(xué)驗證，至少對適用性進(jìn)行確認(rèn)研究。WHO則要求檢測方法應(yīng)定義可接受限，并具有驗證材料[1,26]。

2.3.2 參考檢測方法對鑒別實驗，WHO建議可選擇直接測序、逆轉(zhuǎn)錄-PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）測序和二代測序（next generation sequencing，NGS），檢測純度可采用凝膠電泳、毛細(xì)管電泳和（或）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）；CDE建議鑒別實驗方法除測序外，可選擇電泳、HPLC等方法，而對含量檢測（包括核酸濃度及包封率）以及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢測，可采用紫外光譜法或熒光分析，以及質(zhì)譜、核磁及HPLC等適宜方法[1,26]。

美國USP提供了mRNA疫苗鑒別實驗、完整性檢測和純度檢測方法及操作細(xì)則，為研發(fā)企業(yè)統(tǒng)一疫苗關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)的檢測方法以及相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之間可比奠定了基礎(chǔ)。USP規(guī)定mRNA疫苗鑒別實驗檢測方法為NGS、一代測序（sanger sequencing，桑格法測序）或RT-PCR；含量檢測方法為逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）和逆轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR（reverse transcription digital PCR，RT-dPCR），紫外光譜法（ultraviolet spectroscopy，UV）；完整性檢測包括完整mRNA和片段mRNA的百分比、5'加帽率、3'poly(A)加尾和mRNA完整性，完整mRNA和片段mRNA的百分比通過毛細(xì)管凝聚電泳法檢測（capillary gel electrophoresis，CGE）、mRNA 5'加 帽率 通 過離子對反相高效液相色譜法檢測（ion pair reversedphase high performance liquid chromatography，IPRP-HPLC）、3'poly(A)加尾通過反相高效液相色譜法檢測（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、mRNA完整性通過凝膠電泳法檢測（gel electrophoresis）；純度包括雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）和 DNA模板殘留檢測，分別采用免疫印跡法（immunoblot）和定量PCR（quantitative PCR，qPCR）法檢測[27]。

近期BioNTech公司開發(fā)出一種體外轉(zhuǎn)錄mRNA加帽率測定方法，通過核酶在獨(dú)特位置切割體外轉(zhuǎn)錄mRNA，釋放出長約30 nt的5'加帽或未加帽切割產(chǎn)物，純化后經(jīng)變性膠或液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography–mass spectrometry，LCMS）定量分析檢測mRNA加帽率[39]。

2.4 疫苗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

WHO要求企業(yè)建立疫苗內(nèi)部參考品用于檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，在申請上市許可時提供參考品信息，選擇充分表征結(jié)構(gòu)、純度和生物活性，經(jīng)過臨床試驗評估的批次作為候選參考原料。在前期開發(fā)中可應(yīng)用中試批的mRNA疫苗批次作為參考品，后期確定并表征適宜的臨床試驗批次用于商業(yè)批生產(chǎn)。為比較不同實驗室和不同企業(yè)疫苗的檢測結(jié)果，WHO已計劃制備并提供以國際單位（international unit，IU）表示的國際標(biāo)準(zhǔn)品（international standard，IS）。目前WHO已建立新冠病毒抗體檢測IS[40]。

CDE要求企業(yè)在申報臨床階段應(yīng)建立核酸含量、純度和生物活性等檢測的參考品或?qū)φ掌?，提供參考品或?qū)φ掌返膩碓?、制備、檢定結(jié)果、標(biāo)定過程及穩(wěn)定性研究等的初步研究資料。我國近期也完成新冠病毒中和抗體檢測國家標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定，可用于mRNA疫苗的體內(nèi)效價檢測方法質(zhì)控以及臨床評價[41]。

3 結(jié)語

全球新冠疫情極大加速了mRNA疫苗的研發(fā)和應(yīng)用進(jìn)程[42]。作為一種全新類型的疫苗，mRNA疫苗由于其可編輯、快速大量生產(chǎn)及較易質(zhì)控等特點(diǎn)，迅速成為預(yù)防性和治療性等疫苗研發(fā)的熱點(diǎn)[43]。然而，該類疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和質(zhì)控方面仍缺乏經(jīng)驗，相關(guān)的法規(guī)和指南文件也有待進(jìn)一步完善和配套。我國進(jìn)入臨床的mRNA新冠病毒疫苗數(shù)量居世界前列，同時也啟動了多個治療性疫苗項目，但至今仍無疫苗批準(zhǔn)上市。目前我國mRNA疫苗質(zhì)控方面仍缺乏統(tǒng)一的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不同研發(fā)企業(yè)的質(zhì)控等信息難以共享，如何整合疫苗監(jiān)管、研發(fā)和生產(chǎn)的資源，建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控體系，是目前我國mRNA疫苗行業(yè)發(fā)展面臨的關(guān)鍵問題。企業(yè)應(yīng)依據(jù)風(fēng)險管理的理念設(shè)計、研發(fā)生產(chǎn)疫苗，科學(xué)合理設(shè)置質(zhì)控項目和可接受標(biāo)準(zhǔn)，建立符合預(yù)期目的的簡便、準(zhǔn)確的檢測方法。監(jiān)管部門應(yīng)推動質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一和標(biāo)準(zhǔn)化方法的應(yīng)用，為推動mRNA疫苗發(fā)展，研發(fā)安全有效的疫苗提供基礎(chǔ)。