王麗珍 周雪穎 韓沙如拉 袁瑞 楊志甫○☆

血栓調節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）具有抗凝、促進纖溶、抗炎、保護血管內皮等生理功能，在預防心腦血管疾病和血栓形成性疾病方面發(fā)揮重要作用[1-4]。DNA 甲基化是目前影響基因轉錄表達最常見的表觀遺傳方式。TM 啟動子區(qū)異常高甲基化與多種疾病相關[5-7]。高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）是心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素[8]。升高的Hcy 能夠通過影響DNA 的甲基化而參與心腦血管疾病的發(fā)生[9]。FA參與Hcy 經再甲基化途徑的代謝過程，補充FA 可顯著降低HHcy患者血漿Hcy水平；EGCG是綠茶中主要的活性部分，屬于新型DNMT；二者均能通過逆轉異常的DNA 甲基化狀態(tài)發(fā)揮作用[10-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者TM 基因啟動子區(qū)呈異常高甲基化狀態(tài)，且其甲基化水平與其mRNA表達水平呈負相關，與血漿Hcy 水平呈正相關，推斷HHcy 可能通過對TM 異常甲基化調控而下調其mRNA 表達，進而參與腦梗死的發(fā)生發(fā)展[6]?？紤]到DNA 甲基化調控存在組織、細胞特異性，本實驗以主要合成分泌TM 的HUVECs 為研究對象，觀察不同濃度Hcy 對HUVECs TM 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及mRNA 表達的影響，以體外實驗的方法驗證上述研究結果，并進一步探究Hcy 影響TM 啟動子區(qū)甲基化水平的具體機制，以及FA 與EGCG 對Hcy所引起的上述變化的干預作用及機制。

1 材料與方法

1.1 HUVEC 培養(yǎng)與分組無菌條件下復蘇HUVECs（銳賽生物醫(yī)藥有限公司惠贈，中國），采用常規(guī)條件培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（Gibco，美國）。間隔48 h給予換液操作，細胞長滿視野后傳代，直至每個培養(yǎng)皿細胞數(shù)達106以上進行下一步干預實驗。實驗分組：對照組（正常生長的HUVECs）、Hcy（Sigma公司，美國）干預組（分別為50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy+HUVECs）、Hcy+FA（Sigma 公司，美國）干預組（100 μmol/L Hcy+100 μmol/L FA+HUVECs）與Hcy+EGCG（Sigma 公司，美國）干預組（100 μmol/L Hcy+25 mmol/L EGCG+ HUVECs），每組3個樣本，各組均干預24 h。

1.2 流式細胞技術檢測HUVECs 的凋亡情況各組細胞用0.25% 胰酶消化1 min，用預冷4℃的DPBS 漂洗2 次，每管加入400 μL Binding Bμffer 重懸細胞，使細胞濃度調整為1×106/mL。取100 μL細胞懸液到5 mL 細胞培養(yǎng)管中，加入5 μL FITC 和PI(BD Biosciences Pharmingen，美國)輕搖混勻，室溫避光15 min，經流式細胞儀檢測細胞凋亡率，以百分比表示。

1.3 巢式甲基化特異性PCR 法檢測TM 基因啟動子區(qū)甲基化水平用基因組DNA 提取試劑盒（Axygen，美國）提取各組細胞DNA，用EZ DNA Methylation-GoldTMKit 試劑盒（Zymo Rearch，美國）對各組細胞DNA 進行修飾（亞硫酸氫鈉）與純化。為了增加目的片斷的產量，本研究采用巢式甲基化特 異 性PCR（nestler methylation specific PCR ，nMSP）法，即先以修飾后的DNA 為模板，用外側引物（TM-P）進行擴增；然后再用TM-P擴增的產物為模板，用甲基化特異性引物（TM-M）和非甲基化特異性引物（TM-U）分別進行擴增。同時，為了增加目的片斷的特異性，本研究使用降落PCR（Touchdown-PCR），即在擴增過程中將每個循環(huán)的退火溫度降低1℃。最后將PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果并拍照，經Image J 進行灰度分析。引物合成委托上海生工生物工程有限公司完成，引物序列參照本課題組前期研究[6]，詳見表1。

1.4 熒光實時定量PCR 法檢測TM mRNA 表達水平使用RNAiso PLUS（TaKaRa，日本）提取各組細胞總RNA，逆轉錄試劑盒（Monad，中國）合成cDNA。然后以cDNA 為模板，加入TM 與內參基因β-actin引物與Mix進行熒光實時定量PCR（real-time quantitative PCR，Q-PCR）反應，共40 循環(huán)，具體反應條件：95℃預變性5min、95℃變性10s、55℃退火20s、72℃延伸20s。根據(jù)各基因Ct值計算PCR 結果：TM基因的表達量用2-ΔCt描述，△Ct=CtTM基因- Ctβ-actin。引物合成委托上海生工生物工程有限公司完成，引物序列參照本課題組前期研究[6]，詳見表1。

表1 試驗中使用的引物

1.5 Western Blot 檢測DNMT1 蛋白表達提取各組樣品總蛋白，并測定其濃度。加上樣緩沖液混合均勻，并在95 ℃條件下變性5 min。每組取總蛋白15 μg 經SDS-PAGE 凝膠80V 電泳30 min、120 V 電泳60 min，90 V 電轉膜90 min，用膜封閉液封閉1 h，加入DNMT1 和內參Tubulin 一抗（Novus，美國）4℃過夜，加入相應二抗，室溫孵育1 h，TBST 漂洗4 次，將發(fā)光液均勻滴在膜上，曝光顯影，經凝膠圖像成像系統(tǒng)掃描成像，經Image J進行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學方法使用SPSS 26.0 分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，多組間計量資料均數(shù)的比較，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Kruskal-WallisH檢驗；計數(shù)資料以百分數(shù)表示，組間均數(shù)比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Hcy 對HUVECs 凋亡的影響及FA、EGCG 的干預作用流式細胞技術檢測不同濃度Hcy對各組HUVECs 凋亡的影響，細胞凋亡率=Q2+Q4。結果顯示，與對照組相比較，各濃度Hcy 組細胞凋亡率明顯升高，且隨著Hcy 干預濃度的增加，HUVECs凋亡率呈逐漸上升的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=1411.74，P＜0.01）（見圖1，表2）。與100 μmol/L Hcy組相比，100 μmol/L Hcy+FA 組、100 μmol/L Hcy+EGCG 組HUVECs 凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=196.05，P＜0.01）（見圖1，表3）。

表2 不同濃度Hcy干預后各指標結果

表3 在Hcy干預同時加用FA、EGCG后各指標結果

圖1 流式細胞技術檢測各組HUVECs凋亡率結果圖

2.2 Hcy 對HUVECs TM 啟動子區(qū)甲基化水平的影響及FA、EGCG 的干預作用nMSP 法檢測各組HUVECs TM 啟動子區(qū)甲基化水平。結果顯示，各組HUVECs DNA經TM-M和TM-U擴增均有目的條帶，分別為圖2A 和2C 中的M 和U 條帶。經Image J對M 和U 條帶分別進行灰度分析，TM 基因的甲基化水平=M 條帶灰度值/U 條帶灰度值。結果顯示，與對照組相比，各濃度Hcy 組TM 基因甲基化水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=161.05，P＜0.01）（見圖2A，表2）。50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy 組HUVECs TM 基因甲基化水平分別為對照組的2.19、9.35、4.61、4.19、2.94 倍。Hcy 對HUVECs TM 基因甲基化水平的影響并非完全呈劑量依賴關系，以100 μmol/L Hcy 組TM 基因甲基化水平最高，而200、500、1000 μmol/L Hcy 組TM 基因甲基化水平反而較100 μmol/L Hcy 組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（見圖2B）。與100 μmol/L Hcy 組相比，100 μmol/L Hcy+FA 組、100 μmol/L Hcy+EGCG 組TM 基因甲基化水平顯著降低，分別為100 μmol/L Hcy 組的65.73%、51.75%，差異有統(tǒng)計學意義（F=255.37，P＜0.01）（見圖2B，表3）。

圖2 nMSP 法檢測各組HUVECs TM 啟動子區(qū)甲基化水平電泳圖 A.不同濃度Hcy 干預HUVECs 后nMSP 法檢測TM 啟動子區(qū)甲基化水平電泳圖；B.在100 μmol/L Hcy 干預基礎上加用FA、EGCG后nMSP 法檢測TM 啟動子區(qū)甲基化水平電泳圖。M：經TM-M 擴增后的目的條帶，U：經TM-U擴增后的目的條帶。

2.3 Hcy 對HUVECs TM mRNA 表達的影響及FA、EGCG 的干預作用Q-PCR 法 檢 測 各 組HUVECs TM mRNA 表達水平。結果顯示，與對照組相比，各濃度Hcy 組TM mRNA 表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=892.05，P＜0.01）（見表2）。隨著Hcy 干預濃度的增加，TM mRNA 表達水平呈逐漸下降的趨勢，50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy 組HUVECs TM mRNA 表達水平分別降低至對照組的10.48%、4.13%、2.40%、1.95%、1.64%。與100 μmol/L Hcy 組相比，100 μmol/L Hcy+FA 組、100 μmol/L Hcy+EGCG 組TM mRNA 表達水平顯著升高，分別為100 μmol/L Hcy 組的6.17 倍、20.78倍，差異有統(tǒng)計學意義（F=48.02，P＜0.01）（見表3）。

2.4 Hcy 對HUVECs DNMT1 蛋白表達水平的影響及FA、EGCG 的干預作用WB 法檢測各組HUVECs 的DNMT1 蛋白表達水平。結果顯示，與對照組相比，各濃度Hcy 組DNMT1 蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=35.56，P＜0.01）（見表2）。50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy 組DNMT1蛋白表達水平分別為對照組的1.72、2.55、2.57、1.86、1.93 倍。Hcy 對HUVECs DNMT1 蛋白表 達水平的影響也并非呈完全劑量依賴關系，以100、200 μmol/L Hcy 組DNMT1 蛋白表達水平最高；而500、1000 μmol/L Hcy 組DNMT1蛋白表達水平反而較100 μmol/L Hcy 組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與100 μmol/L Hcy 組相比，100 μmol/L Hcy+FA、100 μmol/L Hcy+EGCG 組DNMT1 蛋白表達水平顯著下降，分別為100 μmol/L Hcy 組的54.94%、41.42%，差 異 有 統(tǒng)計 學意 義（F=54.24，P＜0.01）（見表3）。

圖3 WB法檢測各組HUVECs DNMT1蛋白表達

3 討論

TM 是凝血酶的特異性受體，與凝血酶結合形成凝血酶-TM 復合物，進一步激活蛋白C 系統(tǒng)，發(fā)揮抗凝、促纖溶、抗炎、抗血管內皮細胞凋亡的作用。正是由于TM 具有上述生理作用，使其在預防心腦血管疾病及血栓性疾病方面尤為重要。ISERMANN 等[13]研究顯示，血管內皮TM 功能缺失的小鼠出生時就容易在動脈和靜脈系統(tǒng)中自發(fā)形成致死性血栓。

研究表明，HHcy 除了通過增加氧化應激、損傷血管內皮功能等經典機制外，還可通過調控DNA甲基化而致病[9,14]。Hcy 在體內經蛋氨酸代謝途徑可生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）和S -腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl- homocysteine ，SAH）。SAM 是DNA 甲基化調控過程中唯一的甲基供體，而高濃度的SAH是體內DNMT有效的競爭性抑制劑[15]。DNMT 是DNA 甲基化過程的關鍵酶，其中屬于維持甲基化酶的DNMT1 最為重要。本研究顯示，Hcy 干預可通過升高HUVECs DNMT1 的蛋白表達水平而上調TM 啟動子區(qū)的甲基化水平，且這種影響并非完全呈劑量依賴關系，于100 μmol/L Hcy 組最高。BEHERA 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 可通過激活Jun/JNK 信號通路增加DNMT1基因的轉錄表達。我們前期的病例對照研究結果顯示，腦梗死患者外周血TM 甲基化水平與血漿Hcy 濃度呈正相關，且腦梗死患者血漿Hcy 濃度很少能超過100 μmol/L。本次體外實驗發(fā)現(xiàn)，當Hcy干預濃度≤100 μmol/L 時，HUVECs TM 基因甲基化水平隨著Hcy 干預濃度的增加而增加，與上述病例-對照結果基本一致。當Hcy干預濃度大于100 μmol/L時，HUVECs TM 啟動子區(qū)甲基化水平反而回落。我們推測，隨著Hcy水平的增高，當TM 基因甲基化水平升高到一定程度時，作為機體的代償，去甲基化可能會被同時啟動。正如MOHAMMAD 等[17]研究顯示，用高糖和Hcy 干預視網膜血管內皮細胞后，可同時激活DNMTs 和羥甲基化（一種去甲基化機制）的關鍵酶10-11 易位蛋白（ten-eleven translocations,TETs）。

發(fā)生在基因啟動子區(qū)的異常高甲基化可下調其轉錄表達[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy 干預可明顯降低HUVEC TM mRNA 表達水平，且表現(xiàn)出隨著Hcy 干預濃度的增加，其表達水平逐漸降低的趨勢。之所以不同濃度Hcy 調控HUVEC TM mRNA 表達水平的規(guī)律與對TM 基因甲基化調控的規(guī)律不完全對應，考慮Hcy 調控TM 基因轉錄表達仍有其它機制參與的可能。且本研究結果顯示，Hcy 可以引起HUVECs 的凋亡增加，與既往文獻報告一致[19]。TM與凝血酶結合后激活蛋白C，生成活化蛋白C；后者可進一步通過激活蛋白酶激活受體1（protease activated receptor 1，PAR1）信號通路發(fā)揮對血管內皮細胞的保護作用[4]。因此，我們推測Hcy 可能通過下調TM 的轉錄表達而誘導HUVECs 的凋亡增加。

FA 可 通 過降低Hcy 水平；抑 制MTHFR 的 活性，減少甲基供體SAM 的生成；下調DNMT3a、DNMT1 的表達等機制逆轉DNA 的異常高甲基化[20-22]。EGCG 屬于兒茶酚-O-甲基轉移酶的抑制劑，而DNMT 和兒茶酚-O-甲基轉移酶同屬于SAM依賴甲基轉移酶超家族，二者催化中心的結構相似，因此EGCG 能夠通過抑制DNMT 的活性逆轉DNA異常高甲基化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A與EGCG均可通過降低HUVECs DNMT1 蛋白表達，逆轉Hcy引起的TM啟動子區(qū)高甲基化，恢復其mRNA表達，進而減輕Hcy所引起的HUVECs損傷。

綜上所述，Hcy 可能通過上調HUVECs DNMT1蛋白表達水平，引起TM基因啟動子區(qū)高甲基化，進而下調TM mRNA 表達，誘導HUVECs 凋亡。而FA和EGCG 可以逆轉Hcy 所引起的上述改變。我們推測，Hcy 通過DNA 甲基化調控機制下調TM 轉錄表達，降低TM的抗凝、促纖溶、抗炎、抗血管內皮細胞凋亡等作用，進而參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而FA 和EGCG 有望成為預防與治療心腦血管疾病的有效方法。