黃招君 萬琛宜 王萍△ 黃鵬程 彭云 吁亞慶 朱敏 鄧建文 王朝霞 洪道俊○☆

神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病（neuronal intranuclear inclusion disease, NIID）是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，該命名源于在大腦神經(jīng)元內(nèi)發(fā)現(xiàn)嗜酸性核內(nèi)包涵體的病理改變特征[1]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在周圍神經(jīng)系統(tǒng)，及體內(nèi)絕大部多數(shù)器官組織的細(xì)胞內(nèi)都可存在嗜酸性包涵體[2]。NOTCH2NLC基因5'不翻譯區(qū)（5'-untranslated region,5'UTR）的CGG 重復(fù)序列的異常擴增是NIID 的致病原因[3-6]。此外研究顯示該種基因變異還存在于少數(shù)的帕金森病[7]、特發(fā)性震顫[8]、多系統(tǒng)萎縮[9]、運動神經(jīng)元病[10]、周圍神經(jīng)病[11]、眼咽遠(yuǎn)端型肌病[12]等患者群體中，因此目前將這些表型統(tǒng)稱為NOTCH2NLC重復(fù)擴增性疾病（NOTCH2NLCrepeat expansion disorders,NREDs）[13]。其中NIID 為最主要的臨床亞型，其臨床表現(xiàn)如發(fā)作性意識障礙、認(rèn)知障礙、癲癇發(fā)作、震顫、瞳孔縮小和排尿功能障礙等[14-16]。該病臨床表型和基因型之間的關(guān)系復(fù)雜且不確定，因此病理檢查對該病的正確和及時診斷具有至關(guān)重要的作用[17]。皮膚活檢可在汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)包涵體，已成為診斷NIID 的重要病理手段[18]。然而，皮膚活檢屬于有創(chuàng)檢查，而基因檢測不適合國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院的推廣運用。因此，有必要尋找一種無創(chuàng)和經(jīng)濟的檢查方法，幫助NIID患者的診斷。本研究總結(jié)10例NIID 患者的臨床、影像、病理和基因的改變規(guī)律，并在住院急性期收集這些患者的尿液，擬探究尿液的細(xì)胞沉渣是否能幫助NIID的診斷。

1 對象與方法

1.1 研究對象納入2021 年1 月至2022 年2 月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的10例NIID 患者。收集患者臨床癥狀和影像資料，其家族史和家系成員癥狀從受試者及其親屬處獲得的。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?；颊叩慕M織樣本均在遵守中國生物倫理法律和《赫爾辛基宣言》的前提下，由患者或家屬簽署書面同意書后獲得。

1.2 基因檢查抽取患者外周血3 mL 提取DNA。用重復(fù)引物聚合酶鏈反應(yīng)（repeatprimerPCR, RPPCR）定性NOTCH2NLC基因5'UTR 區(qū)CGG 重復(fù)，3 種引物為：NOTCH2NLC-F-5'-FAM-GGCATTTG CGCCTGTGCTTCGGACCGT-3'; M13-(GGC)4(GGA)2R-5'-CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCCGCCGC CGCCGCC-3' ; M13-linker-R-5'-CAGGAAACAG CTATGACC-3'。用熒光擴增長度分析PCR（fluorescence amplicon length analysis-PCR, AL-PCR）定量NOTCH2NLC基因5'UTR 區(qū)CGG 重復(fù)次數(shù)，引物包括NOTCH2NLC-AL-F-5'-FAM- GGCATTTGC GCCTGTGCTTCGGACCGT-3'和NOTCH2NLC-ALR-5'-AGAGCGGCGCAGGGCGGGCATCTT-3'。將反應(yīng)產(chǎn)物使用3500 xl 基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離并使用GeneMapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 皮膚活檢病理檢查選取下肢遠(yuǎn)端（外踝上方10 cm）進(jìn)行開放式皮膚活檢，切取深度達(dá)脂肪結(jié)締組織，皮膚組織分為兩部分。一部分4%福爾馬林溶液固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin, HE）和p62（Abcam, ab56416）免疫組化染色。另一部分2.5%戊二醛溶液固定，環(huán)氧樹脂包埋切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)病理改變（JEOL-1230,日本）。

1.4 尿液沉渣病理檢查留取患者晨尿500 mL，標(biāo)本收集后立即以1500 r/min 離心5 min，摒棄上清液，將尿沉渣收集至細(xì)胞凍存管中。吸取少量沉渣用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）混懸后，吸取100 μL 液體滴于玻片圈定區(qū)域，自然晾干后分別行瑞氏姬姆薩染色和p62 免疫熒光染色。剩余尿沉渣標(biāo)本5000 r/min 離心5 min，吸取上清液后，在細(xì)胞凍存管中加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定，環(huán)氧樹脂包埋切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)病理改變（JEOL-1230,日本）。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點10 例患者中5 例有家族史（僅選取了先證者），5 例散發(fā)，男4 例，女6 例。起病年齡54～73 歲，平 均（65.9±4.95）歲，病 程 時 間0.5～20 年，中位數(shù)3（2，15.5）年。就診癥狀表現(xiàn)為發(fā)作性意識障礙（4/10），發(fā)作性頭痛（2/10）、震顫（2/10）、認(rèn)知障礙（1/10）、發(fā)作性精神障礙（1/10）。發(fā)作性意識障礙或精神障礙的發(fā)作持續(xù)數(shù)小時至數(shù)周不等，基本能恢復(fù)到發(fā)病前狀態(tài)。發(fā)作性頭痛類似于偏頭痛發(fā)作，持續(xù)時間數(shù)小時至數(shù)天不等，多在1 d內(nèi)緩解。就診時的主要神經(jīng)系統(tǒng)臨床癥狀包括：認(rèn)知功能障礙（7/10）、震顫（4/10）、肢體無力（4/10）、行動遲緩（2/10）精神癥狀（2/10）、感覺障礙（2/10）、視力障礙（2/10）、癲癇發(fā)作（1/10）等。其他系統(tǒng)癥狀包括：排尿功能障礙（4/10）、干咳（3/10）、發(fā)作性發(fā)熱（3/10）、便秘（3/10）、發(fā)作性腹痛（2/10）、發(fā)作性惡心/嘔吐（2/10）、糖尿?。?/10）等。查體發(fā)現(xiàn)4 例有感覺異常、4 例下肢反射減弱、4 例有肌力減低、3 例有肌張力升高、3 例病理征陽性、2例共濟失調(diào)、1例瞳孔縮小。見表1。

表1 10例神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病患者的臨床資料

神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定顯示所有患者均存在不同程度的周圍神經(jīng)受累，其中脫髓鞘型感覺運動神經(jīng)病變6 例（6/10）、脫髓鞘型感覺神經(jīng)病3 例（3/10）、混合型感覺運動神經(jīng)病1 例（1/10）。頭顱磁共振成像顯示10 例患者中9 例出現(xiàn)彌散加權(quán)成像（diffusion weighted imaging, DWI）皮髓質(zhì)交界區(qū)異常曲線樣高信號（9/10）（圖1A），2 例患者累及胼胝體（2/10）（圖1B）。T2/FLAIR 像上9 例患者放射冠、半卵圓中心、側(cè)腦室旁的白質(zhì)可見高信號改變（9/10）（圖1C）。1 例患者頭顱MRI 顯示左側(cè)顳枕葉皮層水腫，增強掃描明顯強化（圖1D）。

圖1 NIID 患者頭顱MRI 表現(xiàn) DWI顯示皮髓質(zhì)交界區(qū)異常曲線樣高信（A）；DWI 示病灶累及胼胝體（B）；T2加權(quán)顯示對稱的白質(zhì)病變（C）；T1增強示左側(cè)顳枕葉皮層水腫伴明顯強化（D）。

2.2 皮膚病理特征所有10 例患者均行皮膚活檢，皮膚的構(gòu)筑結(jié)構(gòu)未見異常，皮下脂肪也沒有見到萎縮或者炎性細(xì)胞浸潤?？梢栽诔衫w維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞等細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)嗜酸性核內(nèi)包涵體（圖2A），部分包涵體周圍呈現(xiàn)空暈改變，特別是在汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞核內(nèi)較易發(fā)現(xiàn)，個別細(xì)胞核內(nèi)的包涵體可以多個出現(xiàn)。對皮膚組織進(jìn)行p62 抗體的免疫組化染色，在所有患者皮膚組織的汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等細(xì)胞核內(nèi)均發(fā)現(xiàn)p62 陽性的核內(nèi)包涵體（圖2B）。電鏡下可見核內(nèi)包涵體呈細(xì)絲狀纏繞，周邊或者其內(nèi)沒有膜成分，部分可以出現(xiàn)空暈（圖2C）。

圖2 NIID 患者皮膚病理結(jié)果 HE 染色顯示皮膚汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性核內(nèi)包涵體（A，箭頭）；p62 免疫組化染色顯示陽性的核內(nèi)包涵體（B）；電鏡下可見核內(nèi)包涵體呈細(xì)絲狀纏繞（C）。

2.3 基因檢查結(jié)果NOTCH2NLC基因5'UTR 區(qū)的RP-PCR 擴增，結(jié)果顯示所有患者的色譜圖均呈現(xiàn)出鋸齒狀逐步降低的峰圖，提示存在CGG 重復(fù)擴增突變（圖3A）。進(jìn)一步AL-PCR 擴增顯示這些患者的CGG 重復(fù)次數(shù)96～158 次，平均（119±23）次（圖3B）。

圖3 NOTCH2NLC 基因的動態(tài)突變 患者1 的RP-PCR 結(jié)果色譜圖呈現(xiàn)出鋸齒狀逐步降低的峰圖，提示存在CGG 重復(fù)擴增突變（A）；ALPCR顯示CGG擴增次數(shù)為102次。

2.4 尿沉渣病理改變所有患者的尿沉渣姬姆薩染色光鏡下可見不同程度的白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、細(xì)菌、管型，偶見腎小管上皮細(xì)胞，但有核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)沒有觀察到包涵體。10 例患者中，5 例患者在住入院前或者住院期間行留置導(dǎo)尿，有3 例患者尿常規(guī)提示存在尿路感染，因此從這3 例患者收集的尿沉渣較多，光鏡下有核細(xì)胞數(shù)顯著增多。所有患者的尿沉渣涂片均進(jìn)行p62 的免疫熒光染色，所有的患者都可以觀察到部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)p62 陽性物質(zhì)沉積，然而僅在3 例尿路感染的患者中觀察到核內(nèi)p62 陽性物質(zhì)的沉積（圖4A～C）。尿沉渣電鏡觀察在1 例患者的尿中性粒細(xì)胞核內(nèi)觀察到細(xì)絲纏結(jié)的包涵體結(jié)構(gòu)（圖5）。

圖4 尿細(xì)胞沉渣涂片p62 免疫熒光 患者F1（A）、患者F4（B）、患者S2（C）p62免疫熒光染色顯示細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)陽性物質(zhì)的沉積。

圖5 尿沉渣細(xì)胞電鏡 電鏡顯示在變性的單核細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)細(xì)絲狀纏繞的包涵體結(jié)構(gòu)（A），在對照中未見異常（B）。

3 討論

NIID 的臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性。在以病理形態(tài)為主要診斷手段的時期，我們對該病的認(rèn)識局限在神經(jīng)系統(tǒng)，然而隨著NIID 致病基因的被克隆，目前對該病的認(rèn)識早已超越了早期的疾病范疇[19-21]。該組10 例NIID 患者同樣表現(xiàn)出了顯著的臨床異質(zhì)性，然而仔細(xì)分析患者的臨床表型譜，能夠發(fā)現(xiàn)一些有價值的診斷線索。首先，發(fā)作性癥狀在本組患者中非常常見，有7 例患者的就診癥狀表現(xiàn)為發(fā)作性癥狀，包括發(fā)作性意識障礙、發(fā)作性精神障礙，發(fā)作性頭痛，而且部分患者在病程中多次出現(xiàn)發(fā)作性發(fā)熱、惡心嘔吐、腹痛等，這些發(fā)作性癥狀持續(xù)時間長短不一，但是經(jīng)過對癥治療基本都是可逆的。其次，這組患者都出現(xiàn)不同程度的周圍神經(jīng)病變，多數(shù)患者臨床上并無周圍神經(jīng)病變的癥狀或者體征，但是電生理檢查顯示存在臨床下的電生理改變，而且以感覺神經(jīng)的脫髓鞘性損害為主[22]。再次，這組患者除了突出的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀之外，表現(xiàn)出了很多其他系統(tǒng)癥狀，比如干咳、發(fā)作性腹痛、發(fā)作性惡心嘔吐等，這些癥狀在既往的NIID 患者中往往不被重視，有必要在詢問病史或者鑒別診斷中注意這些癥狀[23]。最后，NIID 患者的很多癥狀不具有特異性，發(fā)作性癥狀、自主神經(jīng)障礙癥狀及其他內(nèi)臟系統(tǒng)癥狀，容易被分開考慮，也容易被忽視。實際上，本組患者的及時診斷也更多地得益于頭顱磁核磁影像的特異性發(fā)現(xiàn)，而單純依靠臨床癥狀和體征存在一定的難度。

本組患者中9 例出現(xiàn)了以額頂葉為主的皮髓交界區(qū)曲線樣DWI 高信號，這在成年型NIID 患者中非常常見，也是有一定特異性的影像學(xué)標(biāo)志物，有助于NIID 患者的臨床診斷[24]。這種影像學(xué)改變的病理基礎(chǔ)可能和皮層下U 纖維持續(xù)進(jìn)展的海綿樣變性有一定關(guān)聯(lián)[25]。本組患者也出現(xiàn)了顯著的對稱分布的白質(zhì)病變，目前認(rèn)為這種白質(zhì)病變和少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失和變性有緊密的聯(lián)系。NOTCH2NLC基因的擴增變異已經(jīng)成為非血管源性白質(zhì)病變最重要的原因，因此在解讀NIID 患者的頭顱影像時要重視腦白質(zhì)病變特點[26]。此外，本組患者中有2 例患者在合并皮髓交接區(qū)DWI 高信號的同時，合并胼胝體部位持續(xù)存在的DWI 高信號，此種影像學(xué)特征在別的文獻(xiàn)中也有被報告，可能和胼胝體部位大量的投射纖維變性有一定的關(guān)系[15]。值得注意的是，有1 例患者的影像學(xué)并沒有出現(xiàn)DWI 的曲線樣高信號，也沒有出現(xiàn)白質(zhì)病變，而是表現(xiàn)為顳枕葉皮層水腫和強化，有類似于線粒體腦肌病樣的影像學(xué)改變特點，此種特殊類型的NIID也已有少量病例報告，極易出現(xiàn)誤診[16]。

自從發(fā)現(xiàn)NIID 由NOTCH2NLC基因中5'UTR的CGG 重復(fù)擴增突變導(dǎo)致，關(guān)于NOTCH2NLC基因擴增突變的報告越來越多，但主要集中在亞洲，而歐洲幾乎沒有[17]。目前認(rèn)為NOTCH2NLC基因5'UTR 的CGG 重復(fù)在正常人群重復(fù)次數(shù)小于40。41～60 次之間屬于中間型，可能和極少數(shù)的帕金森病或者特發(fā)性震顫存在一定關(guān)系[20]。重復(fù)次數(shù)超過60 次具有致病性，經(jīng)典表型即為NIID，其重復(fù)次數(shù)在120 次左右，本組患者重復(fù)次數(shù)均大于60 次，而且平均次數(shù)非常接近120次，因此NIID 患者的基因診斷有必要確定CGG 的重復(fù)次數(shù)，已明確其致病性。NOTCH2NLC基因重復(fù)擴增還可以表現(xiàn)為變性相關(guān)性癡呆[27]、特發(fā)性腦白質(zhì)病變[26]、運動神經(jīng)元病[10]、感覺運動伴自主神經(jīng)病[11]、遠(yuǎn)端型運動神經(jīng)病[28]、眼咽遠(yuǎn)端型肌病[12]等罕見臨床表型。因為相關(guān)的病例數(shù)較少，目前尚沒有建立明確的臨床表型和重復(fù)次數(shù)之間的關(guān)系，但通常認(rèn)為遠(yuǎn)端型運動神經(jīng)病和眼咽遠(yuǎn)端型肌病具有更多的重復(fù)次數(shù)。此外，有研究顯示當(dāng)CGG 重復(fù)次數(shù)超過300次時，攜帶者不表現(xiàn)出臨床癥狀或者臨床癥狀非常輕微[29]。

在基因被克隆后，作為一種以病理形態(tài)為特征命名的疾病體，病理診斷發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的核內(nèi)包涵體仍被認(rèn)為是該病診斷的必要流程之一。2011 年SONE 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在NIID 患者皮膚活檢的汗腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的核內(nèi)發(fā)現(xiàn)組成和結(jié)構(gòu)特征與神經(jīng)元核內(nèi)包涵體一致的嗜酸性包涵體。后續(xù)研究還證實皮膚細(xì)胞的核內(nèi)包涵體和NOTCH2NLC基因5'UTR 區(qū)CGG 致病性重復(fù)擴增之間存在高度的一致性[6]，本組患者也再次證實了這種基因-皮膚病理之間的關(guān)聯(lián)系，因此皮膚活檢已經(jīng)成為NIID最重要的病理診斷方法。

NIID臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，特別是在患者未出現(xiàn)皮髓交界處DWI異常高信號等典型特征時，這時我們沒有更多的證據(jù)來支持NIID 診斷或者我們需要將疾病與NIID 進(jìn)行鑒別，有創(chuàng)的皮膚活檢篩查對患者來說是無益或不合理的。另一方面，常規(guī)基因篩查費用較高，而且時效性不能保證。在本研究開始之初，基于腎小管上皮細(xì)胞的核內(nèi)存在嗜酸性包涵體，擬在尿液細(xì)胞沉渣中尋找腎小管上皮細(xì)胞的核內(nèi)包涵體[14]。本研究通過免疫熒光在10例基因和皮膚病理確診的NIID 患者中，發(fā)現(xiàn)3 例患者的尿細(xì)胞沉渣中有典型的核內(nèi)包涵體，但是僅從細(xì)胞形態(tài)不能確定該細(xì)胞的來源。進(jìn)一步通過電鏡檢查，我們在尿沉渣中的單核細(xì)胞核內(nèi)觀察到典型的包涵體，然而非常遺憾的是只在1 例患者中證實。

本研究的尿細(xì)胞沉渣研究存在一定不足之處。①不同NIID 患者500 mL尿液離心后的細(xì)胞沉渣含量和質(zhì)量差異較大，這直接影響了后續(xù)細(xì)胞涂片和電鏡制片質(zhì)量的高低；②由于尿沉渣較少，本研究在細(xì)胞涂片的制作之前沒有進(jìn)行定量分析，導(dǎo)致100 μL的尿懸液沉淀后，涂片上的細(xì)胞數(shù)量和密度差異較大，少部分涂片細(xì)胞數(shù)量過少無法進(jìn)行觀察，而部分涂片細(xì)胞重疊堆積影響結(jié)果判斷；③3例免疫熒光陽性患者（電鏡陽性患者在其內(nèi)）均存在留置導(dǎo)尿或者尿路感染，提示該檢查方法可能有一定的局限性，是否只針對抗生素使用前的尿路感染患者具有診斷價值尚需進(jìn)一步探究；④p62 反應(yīng)陽性較多的出現(xiàn)在細(xì)胞漿中，對迅速地確定核內(nèi)包涵體產(chǎn)生較大的干擾，下一步研究如果能夠結(jié)合單核細(xì)胞的識別抗體進(jìn)行免疫共標(biāo)，可能有助于陽性率的提升。

總之，本研究顯示NIID 具有很大的臨床異質(zhì)性，其中發(fā)作性癥狀表現(xiàn)多樣，部分不具有特異性。多數(shù)NIID 患者的診斷依賴于額頂葉為主的皮髓交接區(qū)的曲線樣DWI 高信號。皮膚活檢病理和NOTCH2NLC基因的CGG 致病擴增之間存在很高的一致性。尿細(xì)胞沉渣病理檢查對NIID 的診斷可能有一定的輔助作用，特別是在部分尿路感染的患者中顯示出一定的陽性率，但是其研究方法尚需要進(jìn)一步的優(yōu)化，樣本數(shù)尚需要進(jìn)一步的擴大。