梁金燕， 廖 榮， 田 華， 王樹(shù)麗， 莫釗文(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 廣東 廣州 510642)

水稻(OryzasativaL.)是我國(guó)主要糧食作物之一，近年來(lái)，由于環(huán)境的破壞，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)了威脅[1-2]。我國(guó)耕地土壤主要受到鎘、鎳、銅、鉛等污染[3-4]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中含鉛化肥農(nóng)藥的不合理使用、汽車(chē)尾氣的大量排放等因素致使土壤鉛污染加劇，且從土壤到植物，鉛表現(xiàn)出極高的遷移率，所以鉛污染是影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要污染物。當(dāng)土壤中的鉛積累到一定程度時(shí)，會(huì)通過(guò)作物吸收以及食物鏈傳遞而在人體中積累，危害人類(lèi)健康[5-6]。因此，緩解鉛對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)的影響，對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)具有重要意義。

鉛作為污染物中毒性較大的一種重金屬，通常當(dāng)其含量達(dá)到一定范圍時(shí)，就會(huì)毒害作物，其毒性作用因鉛處理濃度的不同、處理品種的不同、作用部位的不同、生長(zhǎng)環(huán)境的不同而存在差異。總的來(lái)說(shuō)，鉛會(huì)對(duì)植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其品質(zhì)，具體表現(xiàn)為抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)、降低生物量、影響光合作用等[7-11]。鐘靜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，水稻種子的萌發(fā)對(duì)于Pb2+濃度表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，且其抑制作用的大小與Pb2+濃度呈正相關(guān)關(guān)系。王錦文等[8]研究表明，在鉛脅迫下水稻芽和根的伸長(zhǎng)會(huì)受到抑制，對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響。李琦[9]在研究高濃度CO2和鉛脅迫下水稻幼苗的生理時(shí)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)鉛脅迫處理下水稻幼苗的呼吸作用受到抑制，表現(xiàn)為胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等顯著降低。當(dāng)土壤中鉛污染達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響水稻的生長(zhǎng)特性，如造成分蘗數(shù)下降，限制作物的光合作用，使得地上及地下?tīng)I(yíng)養(yǎng)部分的生物量降低，從而影響水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量[10-11]。作物的生長(zhǎng)始于種子的萌發(fā)，前期幼苗的素質(zhì)也對(duì)作物后期的生長(zhǎng)有著重要影響，因此，尋求能夠緩解鉛脅迫對(duì)種子萌發(fā)的毒害作用的技術(shù)已經(jīng)刻不容緩。

隨著納米技術(shù)研究的不斷深入，納米材料具有小尺寸效應(yīng)和較大的比表面積等優(yōu)良屬性，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)和日常生活中，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研究也多有報(bào)道。王學(xué)茹等[12]研究表明，納米材料可激發(fā)生物體產(chǎn)生大量的活性氧自由基，使體內(nèi)的生物大分子如脂質(zhì)、核酸等發(fā)生過(guò)氧化，從而影響生物的生理代謝過(guò)程。同時(shí)，納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)存在著積極影響[13-15]。薛琳等[13]總結(jié)了許多關(guān)于納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)的積極作用，包括打破種子休眠、促進(jìn)種子代謝、提高植物凈光合速率和水分利用率、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)元素吸收、影響植物的抗逆性等。通過(guò)葉面噴施納米材料可提高水稻幼苗對(duì)磷的吸收，促進(jìn)其生長(zhǎng)[14]；對(duì)水稻葉面噴施納米硅可降低水稻對(duì)重金屬的吸收，增強(qiáng)作物的抗氧化能力[15]。作為納米材料中的一員，ZnO NPs在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用也備受人們關(guān)注。ZnO NPs在低濃度下可促進(jìn)水稻幼苗生長(zhǎng)，在高濃度下則會(huì)抑制其生長(zhǎng)[16]。在研究植物病害防治中發(fā)現(xiàn)ZnO NPs對(duì)水稻白葉枯病菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[17]。方清[18]發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs可緩解水稻鎘脅迫，增加其葉綠素含量及生物量，降低水稻對(duì)鎘的吸收。ZnO NPs可以吸附砷，緩解砷對(duì)水稻的毒害作用，同時(shí)提高水稻中鋅的含量[19]。Li等[20]研究表明，ZnO NPs對(duì)于鎘脅迫下水稻幼苗生長(zhǎng)有影響，但關(guān)于ZnO NPs對(duì)鉛脅迫的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。前期試驗(yàn)應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，納米材料對(duì)緩解水稻尤其是香稻重金屬脅迫具有一定的積極效應(yīng)。本試驗(yàn)以2個(gè)香稻品種作為材料，研究在鉛脅迫下進(jìn)行ZnO NPs浸種對(duì)香稻種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)與生理的影響，以期為提高香稻對(duì)重金屬脅迫的抗逆性提供一定的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地點(diǎn)

供試香稻品種為象牙香占和玉香油占，種子均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院香稻研究室提供。試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取籽粒飽滿的香稻種子，用3%次氯酸鹽溶液消毒20 min，再用純水進(jìn)行沖洗。將已消毒的種子用不同濃度(ck、25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L)的納米氧化鋅溶液，分別記作ck、T 1、T 2、T 3,分別浸種20 h，然后播種在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)盒中，加入不同質(zhì)量濃度(ck和300 mg/L)的鉛離子處理液，分別記作Pb 0和Pb 300，于25～28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.3 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1發(fā)芽率測(cè)定

以胚根長(zhǎng)度超過(guò)2 mm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，播種后連續(xù)7 d，每天中午觀察并記錄種子發(fā)芽情況。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

1.3.2胚根、胚芽長(zhǎng)度測(cè)定

在播種后第7天，每個(gè)處理隨機(jī)選取25株長(zhǎng)勢(shì)一致的香稻幼苗，用直尺測(cè)量幼苗胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)。

1.3.3抗逆性指標(biāo)的測(cè)定

在播種后第7天取新鮮香稻樣品，將胚芽和胚根分開(kāi)，分別作為酶樣置于液氮中冷凍并放入-80 ℃冰箱中保存用于抗逆指標(biāo)的測(cè)定?？鼓嫘灾笜?biāo)的測(cè)定參照Li YZ等[20]的方法進(jìn)行。稱取0.3 g冷凍保存的鮮樣，加入pH值為7.8的磷酸緩沖溶液(PBS)3 mL，再加入液氮進(jìn)行研磨至形成勻漿，在8 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，上清液即為粗酶液。

SOD活性的測(cè)定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法，將240 μL的反應(yīng)液(含pH值為7.8的PBS 150 μL、130 mmol/L 甲硫氨酸溶液 30 μL、750 μmol/L NBT 30 μL、100 μmol/L 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物緩沖液 30 μL)用移液槍加入到酶標(biāo)板中，再加入粗酶液5 μL，最后加入20 μmol/L 核黃素30 μL混合均勻。將酶標(biāo)板置于4 000 lx下反應(yīng)20 min后在560 nm處讀取吸光值。計(jì)算酶活性時(shí)以抑制50%NBT光化學(xué)還原反應(yīng)所需酶量作為1 U,表示為U/g(FW)。

POD活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，用移液槍依次往酶標(biāo)板中加入0.05 mol/L pH值為7.0的PBS 100 μL、粗酶液5 μL、0.2%愈創(chuàng)木酚95 μL和0.3% H2O2100 μL，充分混合，在470 nm處每隔30 s測(cè)量一次吸光值，共測(cè)5次。計(jì)算酶活性時(shí)以每分鐘內(nèi)A470減少0.01作為1 U，表示為U/g(FW)。

CAT活性的測(cè)定采用紫外吸收法，用移液槍依次往石英比色皿中加入超純水1.95 mL、0.3% H2O21.0 mL和粗酶液0.05 mL迅速搖勻，以純水為對(duì)照，在240 nm處每隔30 s測(cè)量一次吸光值，共測(cè)5次。以每分鐘內(nèi)A240減少0.01作為1 U，表示為U/g(FW)。

MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)氧化法，用移液槍往2 mL離心管中加入粗酶液0.2 mL，再加入0.5% TBA 0.4 mL，充分混勻后沸水浴30 min。在3 000 r/min條件下離心15 min。取上清液,分別在450 nm、532 nm和600 nm處測(cè)量吸光值,單位為μmol/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 26和Microsoft Excel 2010數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，并用Origin 2021軟件作圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用最小顯著差異法(LSD)(p<0.05)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子發(fā)芽率的影響

由表1可見(jiàn)，在Pb 0條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均顯著提高了播種后1 d的象牙香占的發(fā)芽率，增幅分別為204%、213%和233%；T 2處理顯著提高了播種后1 d的玉香油占的發(fā)芽率，增幅為56%；T 1、T 2處理顯著降低了播種后2 d的玉香油占的發(fā)芽率。

表1 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on germination rate

在Pb 300條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均顯著提高了播種后1 d的玉香油占的發(fā)芽率，增幅分別為111%、169%和74%；T 3處理顯著降低了播種后3 d的玉香油占的發(fā)芽率。在T 3條件下，Pb 0處理和Pb 300處理均顯著提高了播種后2 d的象牙香占的發(fā)芽率，增幅分別為15%和18%。在播種后4 d，Pb 300處理和T 1處理下象牙香占和玉香油占的發(fā)芽率均最高，分別為98.53%和95.31%。結(jié)果表明，前期香稻種子發(fā)芽受ZnO NPs浸種影響，最終發(fā)芽無(wú)明顯差異。

2.2 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽形態(tài)特征的影響

由表2可知，在Pb 0條件下，與ck相比，T 2處理顯著提高了玉香油占的根長(zhǎng)，增幅為10.96%。在Pb 300條件下，與ck相比，T 3處理顯著降低了象牙香占的根長(zhǎng)；T 1、T 3處理顯著提高了象牙香占的芽長(zhǎng)和玉香油占的根長(zhǎng)，增幅分別為12.94%和9.86%、22.26%和25.81%；T 3處理顯著降低了玉香油占的芽長(zhǎng)。

表2 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽形態(tài)特征的影響Table 2 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on morphological characteristics of seed root and shoot

2.3 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子芽的SOD活性的影響

由表3可知，在Pb 0條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均降低了玉香油占芽的SOD活性。 在Pb 300條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均降低了象牙香占芽的SOD活性；T 2處理顯著提高了玉香油占芽的SOD活性，增幅為87.52%。在T 3條件下，Pb 0處理和Pb 300處理均降低了2個(gè)香稻品種芽的SOD活性。

表3 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子芽的SOD活性的影響Table 3 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on SOD activity in seed shoot

2.4 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽的POD活性的影響

由表4可知，在Pb 0和Pb 300條件下，T 2和T 3處理均顯著降低了象牙香占根的POD活性。在Pb 0條件下，T 3處理均顯著降低了2個(gè)香稻品種芽的POD活性。

表4 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽的POD活性的影響Table 4 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on POD activity in seed root and shoot

2.5 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽CAT活性的影響

由表5可知，在Pb 0條件下，與ck相比，T 2、T 3處理均顯著降低了象牙香占根的CAT活性；T 1處理顯著提高了象牙香占芽的CAT活性，增幅為60.00%；T 1、T 3處理均顯著降低了玉香油占芽的CAT活性；T 2處理顯著提高了玉香油占芽的CAT活性，增幅為38.83%。在Pb 300條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均顯著降低了象牙香占根的CAT活性；T 2、T 3處理均顯著降低了象牙香占芽的CAT活性；T 1、T 2、T 3處理均顯著降低了玉香油占芽的CAT活性。

表5 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽CAT活性的影響Table 5 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on CAT activity in seed root and shoot

2.6 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下發(fā)芽香稻種子根和芽MDA含量的影響

由表6可知，在Pb 0條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均顯著降低了象牙香占根的MDA含量，降幅分別為28.49%、44.89%和37.37%；T 1、T 2、T 3處理均提高了玉香油占根的MDA含量。在Pb 0條件下，與ck相比，T 1、T 2處理均提高了2個(gè)香稻品種芽的MDA含量。在Pb 300條件下，與ck相比，T 1、T 2、T 3處理均降低了2個(gè)香稻品種根以及芽的MDA含量，降幅分別為9.13%～18.26%、2.31%～14.51%和14.28%～21.53%、4.89%～16.50%。

表6 ZnO NPs浸種對(duì)鉛脅迫下種子根和芽MDA含量的影響Table 6 Effects of soaking seeds with ZnO NPs under Pb stress on MDA content in seed root shoot

注：3 d表示播種后3 d發(fā)芽率；SOD表示芽的超氧化物歧化酶活性；4 d表示播種后4 d發(fā)芽率；RMDA表示根的MDA含量；RPOD表示根的過(guò)氧化物酶活性；RCAT表示根的過(guò)氧化氫酶活性；2 d表示播種后2 d發(fā)芽率；1 d表示播種后1 d發(fā)芽率；SPOD表示芽的過(guò)氧化物酶活性；SCAT表示芽的過(guò)氧化氫酶活性；SL表示芽長(zhǎng)；RL表示根長(zhǎng)；SMDA表示芽的MDA含量。圖1 測(cè)量指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of measurement indexes

2.7 測(cè)量指標(biāo)的相關(guān)性分析

圖1顯示了13個(gè)形態(tài)、生理指標(biāo)之間的相關(guān)性。芽的SOD活性與播種后1 d發(fā)芽率、播種后4 d發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)關(guān)系；根的POD活性與播種后4 d發(fā)芽率、根的MDA含量、根的CAT活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系；播種后1 d發(fā)芽率與芽的POD活性、芽的CAT活性、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與播種后3 d發(fā)芽率、根的MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；芽的POD活性與芽的CAT活性、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、芽的MDA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；芽的CAT含量與芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、芽的MDA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；芽長(zhǎng)與根長(zhǎng)、芽的MDA含量呈顯著正相關(guān)；根長(zhǎng)與芽的MDA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

作物生命始于種子的萌發(fā)，同時(shí)，這也是作物最早接觸外界環(huán)境并做出反應(yīng)的階段[8]。大量研究表明，ZnO NPs是一把雙刃劍，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育存在積極影響也存在著消極的影響。孫露瑩等[21]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度(<100 mg/L)納米氧化鋅處理可以促進(jìn)玉米種子萌發(fā)。于敬波等[22]研究納米氧化鋅在0、10、20、50、100、200、1 000 mg/L濃度梯度下對(duì)水稻種子吉粳803幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅對(duì)水稻種子第7天的發(fā)芽率相比對(duì)照無(wú)明顯差異，但其幼苗的根和芽的伸長(zhǎng)均受到抑制。本試驗(yàn)中在無(wú)鉛條件下，T 1、T 2、T 3處理下播種后1 d的象牙香占和玉香油占種子發(fā)芽率均較ck高，增幅分別為204%～233%和14%～56%，但最終發(fā)芽率與ck相比無(wú)明顯差異。無(wú)鉛條件下納米氧化鋅浸種對(duì)香稻幼苗的根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果不盡相同，一方面可能是所選植物的不同導(dǎo)致納米氧化鋅處理對(duì)其產(chǎn)生的影響有所不同；另一方面是種子萌發(fā)主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源于種子本身，且納米氧化鋅不易通過(guò)種皮進(jìn)入胚中，所以種子發(fā)芽率受納米氧化鋅的影響小，與于敬波等[22]的結(jié)果一致。但在幼苗生長(zhǎng)階段，納米氧化鋅可以通過(guò)植物的根部吸收進(jìn)入胚中，對(duì)植物生長(zhǎng)起作用，所以猜測(cè)納米氧化鋅對(duì)水稻幼苗生長(zhǎng)的作用可能與所選的水稻品種本身有關(guān)[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在鉛脅迫下，不同濃度納米氧化鋅浸種對(duì)發(fā)芽率沒(méi)有影響。T 1處理和T 3處理下象牙香占的芽長(zhǎng)和玉香油占的根長(zhǎng)顯著高于ck，表明納米氧化鋅浸種緩解了鉛對(duì)水稻幼苗根系和芽生長(zhǎng)的毒害，但該效果存在品種間和生長(zhǎng)部位的差異。

鉛脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧(ROS)的生成，ROS水平的動(dòng)態(tài)平衡被打破，而酶促抗氧化系統(tǒng)中的SOD、POD和CAT等抗氧化酶在一定范圍內(nèi)能清除細(xì)胞中過(guò)多的ROS，以維持細(xì)胞內(nèi)ROS平衡，防止膜結(jié)構(gòu)遭受損傷[24-25]。SOD能將O2-氧化成H2O2和O2；POD以愈創(chuàng)木酚作為電子供體清除H2O2；CAT分解呼吸作用和β-氧化過(guò)程中脂肪酸產(chǎn)生的H2O2[26]。MDA是植物體內(nèi)膜脂發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一，可作為衡量質(zhì)膜受損程度的指標(biāo)，MDA含量越高則說(shuō)明體內(nèi)膜脂過(guò)氧化程度越高，膜系統(tǒng)的完整性越差[27]。本試驗(yàn)中無(wú)鉛條件下，與ck相比，兩個(gè)香稻品種的POD活性、SOD活性、CAT活性均有所變化，但象牙香占芽的MDA含量以及玉香油占根和芽的MDA含量均有所增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，納米氧化鋅浸種對(duì)香稻幼苗有一定的抑制作用。推測(cè)3種抗氧化酶活性降低可能是納米氧化鋅脅迫造成了一定的脅迫，使得香稻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，且ROS積累量超出了抗氧化酶調(diào)節(jié)能力的閾值。過(guò)量的ROS破壞了抗氧化酶的表達(dá)系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酶活性降低[28]。本研究結(jié)果顯示，在鉛脅迫下納米氧化鋅浸種處理使兩個(gè)香稻品種的3種酶(SOD、POD、CAT)活性和MDA含量降低了，可能是納米氧化鋅浸種減緩了鉛對(duì)香稻幼苗的毒害作用，其機(jī)制一方面可能是ZnO NPs吸附鉛離子從而減少植物根系從環(huán)境中吸收鉛的量，另一方面可能是由于納米氧化鋅通過(guò)植物細(xì)胞的吞噬或胞飲等內(nèi)吞作用進(jìn)入植株體內(nèi)，然后提高了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化酶活性，從而促進(jìn)谷胱甘肽與O2、.OH-和O2-.等發(fā)生反應(yīng)生成氧化型谷胱甘肽，以減少ROS含量，進(jìn)而減少膜的損傷，最終減輕了鉛對(duì)香稻幼苗的毒害作用[29-33]。

4 結(jié) 論

納米氧化鋅浸種處理對(duì)緩解鉛脅迫下香稻種子萌發(fā)和苗期生長(zhǎng)有一定效果，其緩解效果存在品種效應(yīng)，且香稻幼苗不同部位的生理響應(yīng)也存在一定的差異。象牙香占在25 mg/L納米氧化鋅浸種下對(duì)鉛脅迫的緩解效果最好，而玉香油占則是在50 mg/L納米氧化鋅浸種下對(duì)鉛脅迫的緩解效果最佳。