郭君潔， 王春弘， 仲 杰， 李鴻雁(黃淮學院生物與食品工程學院， 河南 駐馬店 463000)

種子萌發(fā)是一個復雜的過程，受到內(nèi)源信號和外部環(huán)境的綜合影響。由于種子萌發(fā)是植物生命周期中的一個關鍵階段，是植物生長發(fā)育的第一步，因此，了解種子萌發(fā)的生理和分子機制，以便對其進行遺傳調(diào)控具有重要意義。在過去幾十年中，已經(jīng)進行了大量的研究來探索種子萌發(fā)機制[1]。植物激素和許多信號分子(如ROS、NO等)在種子發(fā)育和種子吸脹過程中會發(fā)生劇烈變化，響應生長發(fā)育[2]。脫落酸(ABA)和赤霉素(GAs)被認為是控制種子休眠和萌發(fā)的兩種主要激素[3]。ABA促進種子休眠，而GA則是種子萌發(fā)開始和完成所必需的。一般認為，種子萌發(fā)是由ABA和GA之間的拮抗作用調(diào)節(jié)的。然而，ABA和GA對種子萌發(fā)的調(diào)節(jié)比想象的要復雜得多。Okamoto等[4]發(fā)現(xiàn)，盡管外源ABA的應用抑制了發(fā)芽，但外源ABA與內(nèi)源ABA對ABA介導的基因轉(zhuǎn)錄的影響不同。外源ABA對幾個ABA相關基因在吸脹后期的表達影響顯著，而內(nèi)源ABA影響關鍵成分的表達，例如ABA信號、光合作用、生理和代謝基因，包括GA生物合成酶。

盡管活性氧長期以來被認為是有害分子，但它們作為細胞信號分子逐漸被證實，并在植物中得到了廣泛的研究[5]。在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中，活性氧水平會發(fā)生很大的變化。越來越多的研究表明，活性氧可能在種子萌發(fā)期間作為信號分子，并積極控制種子萌發(fā)[6]。然而，目前對活性氧在種子萌發(fā)過程中的信號通路研究報道較少。

活化C激酶1受體(RACK 1)是最重要的WD(色氨酸-天冬氨酸)重復序列，在所有真核生物中都有發(fā)現(xiàn)[7]。作為支架蛋白，RACK 1參與多種信號通路[8]。第一個植物RACK 1被鑒定為煙草BY-2懸浮細胞中的生長素誘導基因arcA[9]，此后，RACK1基因從一系列植物物種中分離，包括擬南芥、水稻等，并發(fā)現(xiàn)RACK1在不同組織和器官中廣泛表達，包括葉、莖、根和花等[10]，這意味著RACK1可能在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，rack1a突變體對幾種植物激素的敏感性明顯不同，例如種子萌發(fā)時對赤霉素和油菜素類固醇的敏感性降低；不定根和側(cè)根形成時對生長素的敏感性降低；以及種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育時對ABA的敏感性升高[11]。Islas Flores等[12]使用RNAi方法抑制菜豆RACK1基因表達(PvRACK1)，并發(fā)現(xiàn)PvRACK1在根中的mRNA積累是由生長素、ABA、細胞分裂素和赤霉素誘導的。

對擬南芥和水稻RACK1在干旱脅迫響應中的功能的研究表明，當RACK1基因表達受抑制時，葉片ABA水平顯著增加，從而提高了幼苗對土壤干旱的耐受性[13]。越來越多的研究表明，RACK1對植物發(fā)育起關鍵作用，如擬南芥RACK1A中的功能缺失突變會導致多種發(fā)育過程中的缺陷，包括種子萌發(fā)、葉片生產(chǎn)和開花[11]。以擬南芥RACK 1 A蛋白(NCBI登錄號：NP_173248)為模板的BLASTP搜索顯示，在大豆基因組中，有1個RACK1同源基因GmRACK1(Q 39836)，在氨基酸水平上與擬南芥RACK 1蛋白約92.2%相似。然而，目前對RACK1是否參與以及它如何調(diào)節(jié)種子萌發(fā)的機理鮮見報道。在本實驗中，選擇大豆作為實驗材料，首先構(gòu)建了一系列GmRACK1基因過表達或抑制表達的轉(zhuǎn)基因大豆株系，并探討了GmRACK1在調(diào)節(jié)種子萌發(fā)中的作用。

1 材料和方法

1.1 植物材料

大豆(Glycinemax(L.) Merr.)“中黃13”被用作野生型(非轉(zhuǎn)基因系，WT)并用于所有轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生。所有轉(zhuǎn)基因大豆株系均由本實驗室獲得并保存。本研究以GmRACK1第5代過表達轉(zhuǎn)基因株系Oe1 2、Oe 27和RNAi抑制表達轉(zhuǎn)基因株系Ri 9、Ri 22為實驗材料[14]。

1.2 植物生長條件、種子發(fā)芽試驗和脅迫處理

用70%(v/v)的酒精清洗大豆種子30 s，然后用無菌水清洗3次。隨后將滅菌種子種植在鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿(直徑150 mm)中。分別用不同濃度的ABA(0.40 mmol/L)、氟啶酮(20 mmol/L)、烯唑醇(100 mmol/L)或H2O2(20 mmol/L，Sigma)。ABA(混合異構(gòu)體，Sigma)、氟啶酮(Sigma)和烯唑醇(Sigma)用乙醇溶解。對照培養(yǎng)皿中含有等量的無菌水。種子在培養(yǎng)室中萌發(fā)，光照12 h/黑暗12 h，溫度28 ℃。在指定時間記錄發(fā)芽情況。每個基因型使用50粒種子，并進行3次重復。計算3次試驗的平均發(fā)芽率±se(標準誤差)。收集在水或ABA存在下不同時間吸脹的種子，并在-80 ℃下儲存，用于ABA和H2O2測定和基因表達分析。

1.3 基因表達分析

qPCR按SYBR Premix Ex TaqTM 試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)說明書提供的試驗步驟進行。使用7 500實時PCR系統(tǒng)(ABI)測量每個基因的轉(zhuǎn)錄水平。Actin 2 (V 00450)作為對照。每個實驗進行3次生物重復。qRT PCR的引物序列如表1所示。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers name and its sequences

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

將大豆種子或葉片在含有蛋白酶抑制劑的TEDM緩沖液(20 mmol/L Tris/HCl，pH值為7.5，1 mmol/L DTT，5 mmol/L EDTA和10 mmol/L MgCl2)中均漿。勻漿在4 ℃以下6 000 g離心30 min以去除細胞碎片，上清液在4 ℃下以5 000 g離心90 min以澄清?？扇苄缘鞍踪|(zhì)在10%凝膠上通過SDS-PAGE分離，并在Hybond-P膜(美國/GE)上印跡，以Actin作為對照。本實驗所用抗體購自北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。

1.5 內(nèi)源ABA和H2O2水平的定量分析

對吸水種子的內(nèi)源ABA水平進行了測量。簡單地說，將10粒吸水的大豆種子在5 mL蒸餾水中均質(zhì)化，然后在4 ℃下?lián)u動一夜。勻漿在4 ℃下以12 000 g離心10 min，上清液直接用于ABA測定。如Quarrie等[15]所述，使用放射免疫分析法(RIA)進行ABA分析。

為了測量吸收種子的內(nèi)源性H2O2水平，將10粒種子在500 mL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L K2HPO4，pH值6.5)中均漿。離心后，將50 mL上清液與0.2 U/mL辣根過氧化物酶和100 mmol/L ADHP(10-乙?；?3,7-二羥基吩嗪)在黑暗中培養(yǎng)30 min。使用EpochTM微孔板閱讀器(BioTek)對熒光進行定量(激發(fā)波長為560 nm，發(fā)射波長為590 nm)。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)方差分析和多重比較(Duncan多范圍檢驗；p<0.05顯著性水平)使用SPSS 17.0軟件。顯著差異在圖中標記為“*”。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因株系鑒定分析

為了研究GmRACK1在種子萌發(fā)和幼苗生長中的功能，首先培育了一系列轉(zhuǎn)基因大豆株系，其中GmRACK1基因的表達通過RNA干擾下調(diào)，或通過Ubi啟動子過表達上調(diào)[14]。圖1顯示了GmRACK1在對照及轉(zhuǎn)基因株系吸水后種子中的表達。通過qPCR測定，與野生型相比，過表達轉(zhuǎn)基因株系(OEs)中GmRACK1的轉(zhuǎn)錄水平高出45.04%和50.61%，而RNAi轉(zhuǎn)基因株系(Ris)中GmRACK1的轉(zhuǎn)錄水平低30.91%和36.66%(圖1 A)。使用GmRACK1特異性抗體的western blot分析表明，RACK 1蛋白在OEs上調(diào)，而在Ris下調(diào)(圖1 B)。

2.2 不同轉(zhuǎn)基因大豆種子萌發(fā)及其對ABA和H2O2的響應

種子萌發(fā)是一個多階段的過程，涉及復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。為了評估GmRACK1在大豆發(fā)芽中的作用，在標準發(fā)芽條件下選擇了不同轉(zhuǎn)基因大豆株系的種子，并測定發(fā)芽動力學。吸脹36 h后種子開始萌發(fā)，WT的發(fā)芽率迅速提高，但Ris種子的發(fā)芽顯著延遲，隨著時間的延長，發(fā)芽率緩慢增加(圖2 A)。ABA處理后，所有大豆基因型的種子萌發(fā)顯著延緩。然而，Ris種子的萌發(fā)對外源ABA的處理比WT和OEs更敏感(圖2 B)。這些結(jié)果表明，WT和GmRACK1過表達大豆種子萌發(fā)速率顯著高于Ri種子萌發(fā)速率且外源ABA對所有基因型的種子萌發(fā)均有抑制作用。為了探索內(nèi)源ABA在控制種子萌發(fā)中的作用，用ABA生物合成抑制劑氟啶酮(Fluridone，F(xiàn)lu)和ABA分解代謝抑制劑烯唑醇(Diniconazole, Din)進行處理，并測定了種子萌發(fā)動力學。如圖2 C至圖2 E所示，與對照處理相比，氟啶酮處理對所有基因型的種子萌發(fā)均無明顯影響(圖2 C)。當用氟啶酮與外源ABA聯(lián)合處理和單獨用ABA處理種子時，其發(fā)芽率也出現(xiàn)相似的結(jié)果。這說明Ris抑制種子萌發(fā)不是影響ABA合成。然而，烯唑醇處理顯著延遲了所有基因型的種子萌發(fā)，尤其是在種子萌發(fā)早期，即吸脹后48 h內(nèi)。在Ris系中觀察到更嚴重的發(fā)芽延遲(圖2 E)。這說明RACK1可能通過影響ABA代謝來調(diào)節(jié)種子萌發(fā)。

注：“*”表示轉(zhuǎn)基因系的種子萌發(fā)與野生型相比存在顯著差異(p<0.05)。下同。圖2 不同處理對不同轉(zhuǎn)基因系種子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different treatments on seed germination of different transgenic lines

本試驗還研究了Ris對ABA抑制發(fā)芽的敏感性是否與ABA濃度相關(圖3)，當ABA濃度越高，對種子萌發(fā)延緩越顯著?？傊@些結(jié)果表明，延遲種子發(fā)芽可能的因素是RACK 1抑制ABA分解代謝而不是促進ABA生物合成，GmRACK1可能通過控制ABA代謝發(fā)揮其作用。

眾所周知，ABA處理以及不利的環(huán)境因素能誘導H2O2的產(chǎn)生，H2O2也可能參與調(diào)節(jié)種子萌發(fā)[15]。然而，目前還不清楚H2O2調(diào)節(jié)種子萌發(fā)的分子機制。在本研究中，評估了外源H2O2處理對不同轉(zhuǎn)基因大豆株系種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，外源H2O2處理顯著刺激了所有基因型的種子萌發(fā)，吸脹48 h后，WT和OEs的發(fā)芽率約為67%，Ris的發(fā)芽率約為48%(圖2 F)，而用水處理，WT和OEs的發(fā)芽率約為40%，Ris的發(fā)芽率約為15%，Ris對H2O2促進種子萌發(fā)更為敏感。這些結(jié)果表明H2O2也可能參與GmRACK1對種子萌發(fā)的調(diào)節(jié)。

注：A為在不同濃度的ABA(0、5、10和20 μmol/L)處理48 h后種子萌發(fā)的形態(tài)。B為在0、5、10和20 μmol/L ABA處理下48 h的種子發(fā)芽率。圖3 不同濃度的ABA處理對不同轉(zhuǎn)基因系種子萌發(fā)的影響Fig.3 Effects of different concentration of ABA treatments on seed germination of different transgenic lines

2.3 ABA和H2O2相互作用對不同轉(zhuǎn)基因大豆種子萌發(fā)的影響

如上所述，ABA對種子萌發(fā)有抑制作用，而H2O2對種子萌發(fā)有刺激作用，ABA在許多過程中與H2O2相互作用。然而，目前尚不清楚ABA如何與H2O2相互作用來調(diào)節(jié)種子萌發(fā)，以及它們在GmRACK1介導種子萌發(fā)中的作用。本研究比較了單獨或同時用ABA或H2O2處理不同GmRACK1轉(zhuǎn)基因大豆系的種子發(fā)芽情況。如圖4所示，ABA顯著抑制種子萌發(fā)，而H2O2刺激種子萌發(fā)。然而，對于WT和OEs，H2O2幾乎完全消除ABA對種子萌發(fā)的抑制作用，對于Ris株系，它顯著減輕ABA對種子萌發(fā)的抑制作用。進一步分析了不同轉(zhuǎn)基因大豆株系的H2O2水平以及不同濃度ABA對吸脹種子產(chǎn)生H2O2的量進行測定。在不同轉(zhuǎn)基因大豆株系的吸脹種子中檢測到H2O2水平的巨大差異(圖5 A)。與WT相比，OEs的H2O2水平顯著升高，而Ris的H2O2水平顯著降低，這可能部分解釋了不同轉(zhuǎn)基因大豆株系之間萌發(fā)模式的差異。從圖5 B可以看出，ABA濃度與H2O2的濃度成反比。如圖6所示，隨著吸脹時間的延長，內(nèi)源ABA水平顯著降低，不同轉(zhuǎn)基因大豆株系之間的ABA水平存在顯著差異。Ris株系的吸水種子中ABA水平顯著高于WT和OEs，這至少可以部分解釋Ris種子萌發(fā)緩慢和延遲是因為其內(nèi)源ABA含量較高引起的。

圖4 外源ABA和H2O2對不同轉(zhuǎn)基因系種子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of exogenous ABA and H2O2 on seed germination of different transgenic lines

圖5 不同轉(zhuǎn)基因大豆株系之間H2O2相對含量的比較以及不同濃度ABA處理對吸脹種子中H2O2含量的影響Fig.5 Comparison of relative H2O2 contents among different transgenic soybean lines and the effect of ABA treatment on it in imbibed seeds

圖6 不同轉(zhuǎn)基因株系吸脹種子內(nèi)源ABA含量的比較Fig.6 Comparison of endogenous ABA contents in imbibed seeds of different transgenic lines

3 討 論

3.1 GmRACK1下調(diào)抑制萌發(fā)可能與ABA有關

RACK 1是一種高度保守的支架蛋白，在植物組織中廣泛表達。RACK 1參與多種信號通路，包括生長發(fā)育和對外部環(huán)境的響應[11]。然而，與哺乳動物RACK 1的研究進展相比，植物RACK 1的功能和分子機制的研究還處于起步階段。本課題組和其他幾個研究團隊研究了RACK 1在植物生長發(fā)育和對環(huán)境響應中的作用，發(fā)現(xiàn)RACK 1參與調(diào)節(jié)細胞增殖和伸長、種子萌發(fā)以及對植物激素和環(huán)境因素的響應[16]。在本研究中，通過產(chǎn)生幾個GmRACK1下調(diào)或上調(diào)的轉(zhuǎn)基因大豆株系，分析GmRACK1在種子萌發(fā)中的作用及其可能的機制。研究表明，GmRACK1通過增強ABA分解代謝和刺激H2O2產(chǎn)生來調(diào)節(jié)種子萌發(fā)。與野生型大豆(WT)種子相比，當GmRACK1下調(diào)時，種子萌發(fā)明顯延緩，而GmRACK1的過表達對萌發(fā)有促進作用，但不顯著。這與擬南芥和水稻種子萌發(fā)非常相似[11,17]。然而，目前對RACK 1如何調(diào)節(jié)種子萌發(fā)知之甚少。ABA參與維持種子休眠和抑制種子萌發(fā)，因此推測GmRACK1下調(diào)導致的萌發(fā)抑制可能與ABA有關，這一假設在本研究中得到了驗證。實驗表明，盡管外源ABA處理抑制了所有基因型的種子萌發(fā)，但GmRACK1下調(diào)對轉(zhuǎn)基因大豆種子萌發(fā)抑制比非轉(zhuǎn)基因株系和GmRACK1過表達轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)更敏感(圖2、圖3)。這一現(xiàn)象表明GmRACK1是大豆種子萌發(fā)過程中ABA作用的負調(diào)節(jié)因子，這與之前的結(jié)果非常相似，即ABA處理后，RACK 1負調(diào)節(jié)擬南芥種子萌發(fā)、子葉綠化和根系生長[18]。

3.2 GmRACK1抑制表達大豆種子內(nèi)源ABA水平升高是由于ABA分解代謝減少

對吸脹種子內(nèi)源ABA水平的分析表明，GmRACK1下調(diào)轉(zhuǎn)基因大豆株系吸脹種子內(nèi)源ABA水平顯著高于野生型和GmRACK1過表達轉(zhuǎn)基因大豆株系的種子內(nèi)源ABA水平(圖6)。這些結(jié)果很好地解釋了在相同條件下GmRACK1下調(diào)轉(zhuǎn)基因大豆種子萌發(fā)延遲的原因。但是，GmRACK1下調(diào)的轉(zhuǎn)基因大豆株系的內(nèi)源ABA水平升高和種子萌發(fā)延遲并非由于ABA生物合成的增強，因為ABA生物合成抑制劑氟啶酮處理沒有顯著增強發(fā)芽率，而ABA分解代謝抑制劑烯唑醇處理卻顯著降低了種子發(fā)芽率(圖2)。這些結(jié)果表明，GmRACK1下調(diào)的轉(zhuǎn)基因大豆種子內(nèi)源ABA水平升高的主要原因是ABA分解代謝減少，從而導致種子萌發(fā)延遲。目前對GmRACK1調(diào)控種子萌發(fā)過程中ABA代謝的分子機制還不甚明了，值得進一步研究。

3.3 GmRACK1可通過種子中ROS來調(diào)節(jié)種子萌發(fā)

ROS在種子休眠緩解、后熟和萌發(fā)中起重要作用[19]。盡管活性氧長期以來被認為是對植物有害的物質(zhì)，但最近的許多研究提供了生理學和遺傳學證據(jù)，表明活性氧在種子萌發(fā)過程中也可能作為環(huán)境信號的信使分子發(fā)揮作用。例如，擬南芥[20]、小麥[21]等種子萌發(fā)和內(nèi)部ROS含量和ROS清除系統(tǒng)的活性密切相關。本研究表明，GmRACK1也可能通過調(diào)節(jié)吸收種子中ROS的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)種子萌發(fā)。例如當用外源H2O2處理時，所有基因型的種子萌發(fā)率增加，并且GmRACK1下調(diào)的轉(zhuǎn)基因大豆株系的萌發(fā)對H2O2更敏感(圖2)，這與其他一些物種種子萌發(fā)情況一致[22-23]。此外，比較不同大豆基因型的種子發(fā)芽率和吸脹種子內(nèi)源H2O2水平，發(fā)芽率越低，內(nèi)源H2O2水平就越低。例如，在吸脹48 h后，野生型和GmRACK1下調(diào)的轉(zhuǎn)基因大豆株系的H2O2相對內(nèi)源水平分別為1.24和0.76(圖5)。這些結(jié)果表明，GmRACK1也可能控制吸收種子的H2O2生成。