陸萍，蔡珣，石向麗, 冉江華，李愛紅

(南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院 血液科, 江蘇 南通 226500)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是長期高血糖導(dǎo)致腎損害的結(jié)果，是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，又稱為糖尿病性腎小球硬化癥，是以進(jìn)行性蛋白尿、高血壓和進(jìn)展性腎衰竭為特征的一組臨床綜合征[1-2]。雖有研究表明，隨著糖尿病健康管理的加強(qiáng)，與糖尿病相關(guān)的心血管疾病的發(fā)病率逐漸降低，但這些對終末期腎病發(fā)生率的影響較小[3]。目前臨床上治療DN常采用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)受體拮抗藥物[4-5]，其中血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)是目前研究最透徹的受體[6]。研究發(fā)現(xiàn)，AT1R拮抗劑聯(lián)合中藥免疫抑制劑對早中期的DN有一定的臨床療效[7]，但關(guān)于單獨(dú)使用AT1R拮抗劑對DN的作用機(jī)制報道較少。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(jauns kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路參與多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine cignaling，SOCS)是JAK/STAT信號通路中重要的負(fù)性調(diào)控蛋白之一[9]，可介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)顯示，SOCS1能通過抑制JAK2的活性誘導(dǎo)STAT3發(fā)生磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。本研究通過用血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑干預(yù)糖尿病腎病大鼠，觀察其通過調(diào)控JAK2/STAT3/SOCS1信號通路對DN大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠均從青島市實(shí)驗(yàn)動物和動物實(shí)驗(yàn)中心購買，共計35只，動物許可證號SCXK(魯)2016-0002。大鼠均為SPF級，體質(zhì)量200～220 g，所有大鼠飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內(nèi)，保持室內(nèi)溫度20～25 ℃，光照12 h循環(huán)1次，大鼠自由飲食飲水。

1.1.2試劑和儀器 纈沙坦(南京長澳制藥有限公司，批號180925)，小鼠抗JAK2單克隆抗體、兔抗p-JAK2多克隆抗體(美國Millipore公司)，STAT3抗體、p-STAT3抗體(上海博湖生物科技有限公司)，兔抗SOCS1多克隆抗體(美國Immunoway公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博爾夫生物科技有限公司)，NAW1-XTY5血糖測定儀[博邦方舟醫(yī)療科技(北京)有限公司]。

1.2 研究方法

1.2.1動物分組和DN模型制備 將35只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，即NC組(健康大鼠不做任何干預(yù)，正常飼養(yǎng))10只，DN組(糖尿病腎病大鼠模型組)和ARB組(DN組基礎(chǔ)上灌胃纈沙坦干預(yù)治療)共25只。將DN組和ARB組大鼠制備DN模型，大鼠均用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周后，大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液pH4.4配制(劑量為30 mg/kg)；4周后，連續(xù)3次測定大鼠隨機(jī)血糖值，結(jié)果>16.7 mmol/L且24 h蛋白尿≥30 mg/L即為造模成功；造模后有5只大鼠造模失敗剔除，剩余20只大鼠每組10只。造模成功后，NC組和DN組大鼠均灌胃等體積的生理鹽水，ARB組大鼠灌胃40 mg/kg·d纈沙坦干預(yù)，各組大鼠均連續(xù)干預(yù)8周。

1.2.2生化指標(biāo)檢測 灌胃第8周末收集各組大鼠尾尖血，置于離心機(jī)離心10 min(3 000 r/min)，收集上層血清，血糖測定儀測定各組大鼠空腹血糖(first fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，測定血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)，血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平；同時分別用代謝籠收集大鼠24 h尿液，測定大鼠24 h尿蛋白總量(24-hour urine total protein quantity，24 hUTP)和尿微量白蛋白(Urine micro albumin，UmALB，全自動生化分析儀)。

1.2.3腎組織形態(tài)學(xué)觀察 取血尿后標(biāo)本后，處死各組大鼠并取出腎皮質(zhì)，置于甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋組織，將組織切成4 μm 薄片HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)變化。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡檢測腎皮質(zhì)組織勻漿 中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達(dá) 取出腎皮質(zhì)組織，冰上裂解并研磨組織呈組織勻漿，用BCA法測定總蛋白濃度。電泳蛋白樣品，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜轉(zhuǎn)上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用PBS稀釋后添加一抗JAK2(1∶1 000)、p-JAK2(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)、SOCS1(1∶1 000)、GAPDH(1∶500)抗體，4 ℃環(huán)境孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，20 min/次，共3次；加入PBS稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h。洗膜樣品后用顯微鏡觀察蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FBG、TG水平

與NC組比較，DN組大鼠血清FBG和TG水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠FBG和TG水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為大鼠FBG水平，B為大鼠TG水平；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

2.2 Scr、BUN水平

與NC組比較，DN組大鼠血清中Scr、BUN水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠血清中Scr、BUN水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為大鼠Scr水平，B為大鼠BUN水平；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

2.3 UmALB、UTP水平

與NC組比較，DN組大鼠血清中UmALB、UTP水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠血清中UmALB、UTP水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為大鼠UmALB水平，B為大鼠UTP水平；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

2.4 腎皮質(zhì)組織學(xué)觀察

與NC組比較，DN組大鼠腎小球體積增加，系膜細(xì)胞數(shù)量變多，腎小球上皮細(xì)胞形成大量空泡；與DN組比較，ARB組大鼠腎小球形態(tài)區(qū)域正常，基底膜輕微增生，腎小管排列區(qū)域整齊，病變程度模型減輕。見圖3。

圖4 各組大鼠腎皮質(zhì)組織學(xué)特點(diǎn)(HE，×200)

2.5 腎皮質(zhì)組織勻漿中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1蛋白表達(dá)

與NC組比較，DN組大鼠腎皮質(zhì)組織中p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值明顯升高，SOCS1蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與DN組比較，ARB組大鼠腎皮質(zhì)組織中p-JAK2/JAK2比值和p-STAT3/STAT3比值顯著降低，SOCS1蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明AT1R拮抗劑可影響DN大鼠腎皮質(zhì)組織中JAK2/STAT3/SOCS1蛋白表達(dá)水平。見圖5。

注：A為大鼠腎皮質(zhì)組織中p-JAK2、JAK2蛋白表達(dá)，B為大鼠腎皮質(zhì)組織中p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)，C為大鼠腎皮質(zhì)組織中SOCS1蛋白表達(dá)，D為p-JAK2/JAK2，E為p-STAT3/STAT3，F(xiàn)為SOCS1蛋白表達(dá)；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與DN組比較，P<0.05。

3 討論

DN是眾多糖尿病并發(fā)癥中最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥糖尿病(DM)，其以血管損傷所致腎小球病變?yōu)橹饕±硖卣鱗11]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，控制糖尿病腎病患者血糖，改善血流動力學(xué)變化，不僅能有效延緩微量蛋白尿的發(fā)生，而且還能減少已有微量蛋白尿患者的臨床蛋白尿癥狀[12]。研究發(fā)現(xiàn)，腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，抑制RAS激活對足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[13]，進(jìn)而能有效延緩DN的進(jìn)展。AngⅡ作為腎素血管緊張素系統(tǒng)的主要效應(yīng)因子，其在機(jī)體血容量、血流動力學(xué)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，目前已有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ水平在腎內(nèi)局部升高，其與高血壓、糖尿病時腎臟病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。因此本研究采用AngⅡ拮抗劑干預(yù)DN模型大鼠，觀察其對大鼠的作用機(jī)制及相關(guān)信號通路的影響。

高糖可通過誘導(dǎo)大鼠腎病病變而降低腎小球的濾過功能，抑制腎功能指標(biāo)Scr、BUN等的吸收。糖尿病腎病發(fā)生過程中伴隨著異常的脂質(zhì)代謝，有學(xué)者通過對DN大鼠研究發(fā)現(xiàn)，腎小管中有大量的脂質(zhì)沉淀，通過下調(diào)脂質(zhì)生成基因的表達(dá)可減輕糖尿病腎病大鼠的腎損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，DN組大鼠FPG、TG、Scr、BUN、UmALB、UTP水平升高，提示DN模型制備成功。通過給予大鼠AngⅡ拮抗劑發(fā)現(xiàn)，AngⅡ拮抗劑對糖尿病腎病大鼠腎組織損傷有一定修復(fù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ能有效的改善腎小球?yàn)V過膜通透性，且AngⅡ能和結(jié)合其受體，通過減少濾過膜負(fù)電荷起到減弱電荷的屏障作用，進(jìn)而改變腎小球?yàn)V過膜的通透性[16]。

JAKs是STATs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游激酶，其可激活JAKs表達(dá)，通過誘導(dǎo)STATs磷酸化而形成STATs二聚體，進(jìn)而調(diào)控核內(nèi)的基因表達(dá)。當(dāng)JAK/STAT途徑被過度激活時，靶細(xì)胞的生物學(xué)功能會因異?；钴S而損傷機(jī)體，因此通過抑制JAK/STAT途徑的過度激活對維持機(jī)體的穩(wěn)定性有重要作用。SOCS家族是目前研究最多的負(fù)性調(diào)節(jié)因子之一，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)JAK/STAT途徑而減輕機(jī)體產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)，一定程度阻止了疾病的進(jìn)展，同時對組織損傷有一定改善作用。SOCS1能通過其特異性酶活性抑制區(qū)域與JAK2相應(yīng)催化部位結(jié)合，從而抑制信號傳導(dǎo)，目前SOSl對JAK2/STAT3信號通路的負(fù)調(diào)控作用已被證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1能抑制JAK2誘導(dǎo)的STAT3磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ受體拮抗劑可抑制DN大鼠腎皮質(zhì)組織中JAK2/STAT3信號通路，提高SOCS1蛋白表達(dá)水平，對腎組織具有保護(hù)作用。有研究證實(shí)，SOCSl可通過負(fù)向調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路抑制STAT3磷酸化的生成，機(jī)體中的SOCS1含量隨著疾病的加重而增加，進(jìn)而一定程度減輕炎癥損傷[18]。目前，尚無相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)AngⅡ受體拮抗劑可調(diào)控JAK2/STAT3/SOCS1信號通路，因此，后續(xù)本研究將完善實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，通過更多的實(shí)驗(yàn)方案證實(shí)AngⅡ與JAK2/STAT3/SOCS1表達(dá)的相關(guān)性。

綜上所述，AngⅡ受體拮抗劑能減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷，影響JAK2/STAT3/SOCS1蛋白的表達(dá)水平，對腎組織有保護(hù)作用，為臨床治療糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。