魏紅芳，陳永學(xué)，遲曉慧，趙廣平，劉盼盼

(邯鄲市中心醫(yī)院 麻醉科，河北 邯鄲 056008)

急性缺血性腦卒中是因局部腦血流短暫或永久性中斷而造成的區(qū)域神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等壞死，患者可表現(xiàn)出運(yùn)動、意識、語言等腦功能受損的癥狀[1-2]。臨床對急性缺血性腦卒中患者多給予藥物溶栓或血管內(nèi)介入取栓治療，但治療后的缺血再灌注可能對患者的腦缺血區(qū)域造成二次損傷[3-4]。Notch信號通路在脊椎動物和非脊椎動物體內(nèi)廣泛存在，該通路在心包受體和配體相結(jié)合，被激活后，可調(diào)控細(xì)胞、組織、器官的分化和發(fā)育，對于細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及血管新生等過程均有重要調(diào)控作用[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可能介導(dǎo)缺血性腦損傷，通過激活Notch信號通路，可以減少神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善缺血性腦損傷患者的預(yù)后[6]。右美托咪定(dexmedetomidine, DEX)具有抗炎效果，能夠減少炎癥細(xì)胞因子表達(dá)、提高機(jī)體免疫炎癥應(yīng)答，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能[7]，提示如給予患者DEX治療可能緩解患者的炎癥反應(yīng)、改善腦損傷。本文探討DEX與Notch1通路對腦缺血再灌注損傷大鼠的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠40只，日齡為49～64 d、平均(54.12±4.96)d，體質(zhì)量250～300 g、平均(280.65±16.75)g，從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(滬)2021-0104]購入，動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，給標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)和自由飲水，室溫23 ℃。

1.1.2主要儀器與試劑 (1)主要儀器：超凈工作臺(中國，Airtech)，超低溫冰箱(美國，Thermo)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海，力申)，精密電子天平(德國，Sartorius)，恒溫水浴箱(上海，Lichen)，轉(zhuǎn)膜儀(美國，BIO-RAD)，倒置熒光顯微鏡(日本，OLYMPUS)，電泳儀(美國，BIO-RAD)，細(xì)胞凍存管(美國，Corning)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國，Costar)，高速離心機(jī)(德國，Eppendorf)，腦立體定位儀(上海，欣軟信息科技有限公司)，腦立體微量注射泵(北京，中西華大科技有限公司)，流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技有限公司);(2)主要試劑：乙二胺四乙酸、異硫氰酸熒光素、磷脂結(jié)合蛋白、聚酰亞胺、四氮唑紅溶液、Trizol裂解液(北京，索萊寶科技有限公司)，牛血清白蛋白(杭州，弗德生物科技有限公司)，兔抗鼠二抗(美國，Cell Sigllaling Tecllll0109y公司)，一抗(上海，碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1分組及造模 (1)分組：40只模型大鼠隨機(jī)均分為模型組、DEX組、γ分泌酶抑制劑DAPT組(DAPT組)及DAPT+DEX組。造模前，DAPT組大鼠腹腔注射DAPT 5 mg，其余3組注射等體積生理鹽水；造模后30 min內(nèi)，DEX組和DAPT+DEX組大鼠腹腔注射100 μg/kg的DEX，模型組和DAPT組注射等體積生理鹽水;(2)依據(jù)Longa等[8]的線栓法制備模型：大鼠制備模型前12 h均禁食，2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒，于頸正中2 cm縱行切口，暴露左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)，用動脈夾夾閉CCA和ICA，在ECA上剪口，將被生理鹽水浸泡過的魚線線栓插入到ICA內(nèi)、并上行約18 mm；用激光多普勒血流儀檢測腦血流量迅速降低為基礎(chǔ)值的70%，則完成大腦中動脈阻塞局灶性腦缺血模型，2 h后拔出線栓，結(jié)扎ECA，開放CCA動脈夾，再灌注22 h，完成腦缺血再灌注損傷模型制備;(3)造模成功標(biāo)準(zhǔn)為大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、提尾側(cè)向轉(zhuǎn)圈。

1.2.2神經(jīng)功能評分 造模后2 h和24 h，采用Longa神經(jīng)功能評分法[9]評估各組大鼠的神經(jīng)功能，0分為無神經(jīng)損傷癥狀，1分為提尾時(shí)病灶對側(cè)前肢無法完全伸直，2分為行走時(shí)出現(xiàn)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，3分為行走時(shí)向病灶對側(cè)跌倒，4分為喪失意識、且無法自發(fā)行走，其中0分和4分為造模失敗。

1.2.3腦梗死情況 造模后24 h，對各大鼠進(jìn)行戊巴比妥鈉麻醉，向斷頭法處死并取出腦組織，置于低溫冰箱內(nèi)冷凍30 min，制作腦組織切片、2%四氮唑紅溶液內(nèi)孵育20 min、4%多聚甲醛溶液固定24 h，使用Image J軟件掃描并測量腦梗死面積，計(jì)算腦梗死體積占比。

1.2.4腦神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子水平 取5 mg腦梗死組織，制備腦組織勻漿液，使用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測腦神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和白細(xì)胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)水平。

1.2.5Notch通路相關(guān)蛋白Notch1、Notch2及家族多毛強(qiáng)化子-1基因(hairy and enhancer of split 1, Hes1)蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot檢測，使用Trizol裂解液提取腦腦組織總蛋白，使用BCA檢測總蛋白含量。離心取蛋白裂解液上清液，體積質(zhì)量比1∶0.5加入5×Loading Buff，震蕩混勻(10 min)，置于100 ℃沸水內(nèi)5 min變性，每孔加入30 μg等量蛋白樣品，電泳，取出蛋白凝膠，轉(zhuǎn)PVDF膜；于10%脫脂奶粉內(nèi)浸泡，室溫下封閉2 h，加一抗(1∶1 000)孵育，4℃下過夜，加二抗(1∶800)孵育2 h，加發(fā)光液顯影，以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

結(jié)果顯示，與DAPT+DEX組相比，DAPT組、模型組、DEX組大鼠造模后2 h和24 h的神經(jīng)功能評分升高，且DAPT組>模型組>DEX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后2 h和24 h的神經(jīng)功能評分比較

2.2 造模后24 h腦梗死情況

結(jié)果顯示，造模后24 h時(shí)，DAPT組、模型組、DEX組大鼠梗死灶體積、梗死灶與全腦體積比，都高于DAPT+DEX組，且DAPT組高于模型組，模型組高于DEX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但全腦總體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠造模后24 h時(shí)的腦梗死情況

2.3 造模后24 h的腦神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

結(jié)果顯示，造模后24 h時(shí)，DAPT組、模型組、DEX組大鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞NSE、MDA水平均較DAPT+DEX組升高，且DAPT組>模型組>DEX組；DAPT組、模型組、DEX組的腦神經(jīng)細(xì)胞SOD水平均較DAPT+DEX組降低，且DAPT組<模型組

表3 各組大鼠造模后24 h的腦神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平比較

2.4 造模后24 h的腦神經(jīng)細(xì)胞炎性因子水平

結(jié)果顯示，造模后24 h時(shí)，DAPT組、模型組、DEX組大鼠的腦神經(jīng)細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較DAPT+DEX組升高，且DAPT組>模型組>DEX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠造模后24 h的腦神經(jīng)細(xì)胞炎性因子水平

2.5 造模后24 h的腦組織細(xì)胞Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

與DAPT+DEX組相比，DAPT組、模型組大鼠造模后24 h的腦組織細(xì)胞Notch1、Notch2、Hes1水平均降低，且DAPT組低于模型組，DEX組大鼠造模后24 h的腦組織細(xì)胞Notch1、Notch2、Hes1水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，見表5和圖1。

表5 各組大鼠造模后24 h腦組織細(xì)胞Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)

圖1 各組大鼠造模后24 h的腦組織細(xì)胞Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)(Western blot)

3 討論

大腦作為人體最重要的生命器官之一，其具有高耗氧、高灌注、高能量儲備、高代謝等特點(diǎn)，但是其對于缺血缺氧的耐受能力較差[10]。臨床中雖然可以給予缺血性腦卒中患者早期溶栓治療促進(jìn)血液再通，但是治療后血液再灌注可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量氧自由基，損傷腦神經(jīng)組織，加重腦組織損傷，隨病情進(jìn)展還會導(dǎo)致患者出現(xiàn)肢體功能障礙和認(rèn)知功能障礙，對患者的家庭和社會均有重要影響[11-12]。因此給予腦缺血再灌注損傷患者適當(dāng)?shù)乃幬镏委煂τ诟纳苹颊哳A(yù)后有重要意義，結(jié)合既往有學(xué)者指出麻醉藥物具有一定的神經(jīng)保護(hù)效果[13]，本文選取臨床中廣泛應(yīng)用的DEX作為研究對象，建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，分析了DEX通過調(diào)控Notch1通路對腦缺血再灌注損傷大鼠的作用機(jī)制，以期能為今后臨床治療提供指導(dǎo)。

Notch信號通路主要在哺乳動物大腦皮層和海馬神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，正常狀態(tài)下，大腦發(fā)育時(shí)機(jī)體的Notch信號通路狀態(tài)對神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)有重要影響，其能夠?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程進(jìn)行調(diào)節(jié)[14-15]。既往Stump等[16]指出，激活Notch信號通路能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能缺損恢復(fù)。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)，使用電針刺激Notch信號通路活化，可防治腦缺血所致神經(jīng)功能缺損。但腦組織內(nèi)Notch信號通路的變化所產(chǎn)生的效應(yīng)在臨床中尚存爭議，有學(xué)者認(rèn)為通過阻斷Notch信號通路后機(jī)體可通過其他途徑改善腦缺血狀態(tài)，而多數(shù)學(xué)者則認(rèn)為活化Notch信號通路則能夠減少神經(jīng)元凋亡，保護(hù)腦缺血大鼠的腦功能，同時(shí)可促進(jìn)海馬新生神經(jīng)元整合[18-19]，因此本文對其展開探究。

本文研究結(jié)果顯示，與DAPT+DEX組相比，DAPT組、模型組、DEX組大鼠造模后2 h和24 h的神經(jīng)功能評分均升高，DAPT組、模型組、DEX組大鼠造模后24 h的梗死灶體積、梗死灶與全腦體積比、腦神經(jīng)細(xì)胞NSE、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，且DAPT組高于模型組、DEX組，模型組高于DEX組；DAPT組、模型組、DEX組大鼠造模后24 h的腦神經(jīng)細(xì)胞SOD水平、腦組織細(xì)胞OD值均降低，且DAPT組低于模型組、DEX組，模型組低于DEX組。其中MDA為氧自由基和生物不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其是毒性最大的脂質(zhì)過氧化總產(chǎn)物，因此其水平高低能夠反映出腦梗死病灶情況[20]。SOD為人體內(nèi)重要的氧化鎂和自由基清潔劑，其能夠?qū)Ⅲw內(nèi)過量氧自由基有效清除，發(fā)揮器官保護(hù)效果[21]。NSE水平高低與繼發(fā)性腦損傷存在相關(guān)性，因此神經(jīng)元壞死或損傷可能造成NSE水平升高[22]。提示本研究中給予腦缺血再灌注損傷模型大鼠DEX而調(diào)控了多炎性反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)了海馬神經(jīng)元，促進(jìn)腦組織內(nèi)γ-氨基丁酸含量升高，促進(jìn)了腦細(xì)胞增殖，發(fā)揮了腦神經(jīng)保護(hù)效果。同時(shí)Notch受體作為跨膜蛋白，激活后可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)片段NICD，其與細(xì)胞核內(nèi)DNA相結(jié)合而形成復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)Hes1表達(dá)，Hes1作為螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的負(fù)調(diào)控因子，能夠維持神經(jīng)元細(xì)胞增殖[23-24]。本文結(jié)果顯示，與DAPT+DEX組相比，DAPT組、模型組大鼠造模后24 h的腦組織細(xì)胞Notch1、Notch2、Hes1水平均降低，且DAPT組高于模型組，DEX組大鼠造模后24 h的腦組織細(xì)胞Notch1、Notch2、Hes1水平均升高。肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning, RIPC)介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用與其預(yù)先激活缺血腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的Notch1信號相關(guān)，DAPT可阻斷RIPC激活的Notch1信號和下游保護(hù)基因的上調(diào)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)RIPC的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，而Notch1通路的激活在RIPC介導(dǎo)的抗MCAO/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用中有重要意義，因此上述結(jié)果提示DEX可能通過上調(diào)Notch信號通路而發(fā)揮腦保護(hù)效果[25-27]。

綜上所述，DEX可通過上調(diào)Notch1通路而影響缺血再灌注損傷大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，提高細(xì)胞活力，縮小梗死灶體積，改善腦神經(jīng)功能，具有一定的腦神經(jīng)保護(hù)功能。