潘媚，朱義芳，巫娟

(1.四川省骨科醫(yī)院 病理科，四川 成都 610041；2.四川省骨科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，四川 成都 610041)

腰椎間盤突出(LDH)是骨科的常見病，主要來自于腰椎間盤退行性病變，髓核突出刺激、壓迫硬膜囊及相關(guān)神經(jīng)，導(dǎo)致腰腿疼痛和神經(jīng)功能障礙[1]。多數(shù)LDH患者傾向于保守治療，追蹤部分LDH患者發(fā)現(xiàn)，腰椎突出組織會逐漸縮小或消失，目前關(guān)于LDH突出組織自發(fā)性吸收機(jī)制尚未完全闡明。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，相關(guān)研究顯示，在LDH組織自發(fā)性吸收過程中，血管化現(xiàn)象與突出組織吸收程度及預(yù)后關(guān)系密切[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是誘導(dǎo)新生血管形成的常見因子[3-4]，由此推斷2者可能參與LDH自發(fā)性吸收過程，目前此類研究多在動物模型中開展，在人體中研究較少[5]。本研究以48例LDH患者為研究對象，探究VEGF、bFGF在突出椎間盤中的表達(dá)及相互關(guān)系，分析其與椎間盤自發(fā)性吸收的關(guān)系，以期為臨床非手術(shù)治療LDH提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年10月—2021年8月行LDH手術(shù)取得的腰3～骶1段椎間盤組織48例，作為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)標(biāo)本經(jīng)后路手術(shù)獲取;(2)患者符合《腰椎間盤突出癥診療指南》[6]中關(guān)于LDH診斷標(biāo)準(zhǔn);(3)經(jīng)影像學(xué)檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在心腦血管疾病、肝腎功能嚴(yán)重不足患者;(2)存在腰椎骨折、脊柱結(jié)核、脊柱腫瘤腫瘤等患者;(3)行硬膜外腔封閉、化學(xué)溶核、經(jīng)皮髓核切吸術(shù)治療及二次手術(shù)者。另選因椎體骨折經(jīng)手術(shù)切開復(fù)位治療所獲得的胸9～腰2段正常椎間盤組織8例作為對照，排除椎管手術(shù)史、椎間盤突出或組織變性者。根據(jù)術(shù)中觀察后縱韌帶是否完整，將獲得的椎間盤組織病理類型分為破裂型(后縱韌帶破裂)和非破裂型(后縱韌帶完整)。觀察組中破裂型24例、非破裂型24例。

1.2 研究方法

所獲取組織均采用10%甲醛固定，常規(guī)梯度濃度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后連續(xù)切片，切片厚度4 μm。

1.2.1顯微鏡觀察椎間盤組織結(jié)構(gòu) 采用HE染色，二甲苯脫蠟10 min(2次)，梯度酒精脫水，蘇木素染色5 min，流水沖洗，1%鹽酸溶液分化30 s，流水沖洗，1%氨水泛藍(lán)30 s，蒸餾水沖洗1 min，伊紅染色2 min，流水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片、中性樹膠封片。由 2 名病理科醫(yī)生采用LOGENE-Ⅰ醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)觀察顯微鏡下椎間盤組織結(jié)構(gòu)，判斷是否軟骨細(xì)胞增生、血管新生、纖維增生及炎細(xì)胞浸潤等。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測椎間盤組織中VEGF和bFGF的表達(dá)水平 采用pH 6.0檸檬酸修復(fù)液對石蠟切片進(jìn)行脫蠟及脫水，熱抗原修復(fù)、血清封閉10 min、加一抗(1∶100)孵育、4 ℃過夜，加入二抗37 ℃孵育30 min、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、中性膠封片。VEGF、b-FGF 的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀染色，高倍鏡下隨機(jī)選取 5 個>100 個細(xì)胞的視野，取平均值。染色強(qiáng)度判定：無染色為0分、淡黃色或僅個別細(xì)胞黃至棕黃色為1分、黃至棕黃色為3分、介入兩者之間為2分，陽性細(xì)胞百分比<5%為0分、5%～25%為1分、25%～50%為2分、50%～75% 為3分、≥75%為4分；兩項(xiàng)評分乘積作為VEGF、b-FGF表達(dá)程度的判讀依據(jù)，≤3分為陰性，≥4分為陽性[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用率(%)表示，組內(nèi)比較采用McNemar檢驗(yàn)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。bFGF和VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

觀察組，男32例、女16例，年齡18～71歲、平均(44.94±13.49)歲，病程(以腰痛開始計算)1～72月、平均(11.98±15.87)月。對照組，男1例、女7例，年齡50～81歲、平均(47.88±10.04)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2 腰椎間盤組織學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示，對照組可見正常腰椎間盤的髓核及纖維環(huán)內(nèi)外層結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，基質(zhì)稀少均勻，未見新生血管形成；觀察組可見軟骨細(xì)胞及纖維增生，基質(zhì)增多、排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤，17例見新生血管(圖1)。

注：A為對照組軟骨細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、基質(zhì)稀少均勻，B為觀察組軟骨細(xì)胞增生、基質(zhì)增多，C為觀察組血管增生。

2.3 VEGF、bFGF陽性表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對照組腰椎間盤組織中未見VEGF、bFGF陽性表達(dá)，觀察組腰椎間盤組織中VEGF陽性33例(68.75%)、bFGF陽性41例(85.42%)，VEGF主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞中表達(dá)，bFGF主要在軟骨細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。見圖2。

注：A為對照組VEGF未見表達(dá)，B為觀察組VEGF在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，C為觀察組bFGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。

2.4 不同病理類型和病程的LDH患者腰椎間盤組織中VEGF和bFGF陽性表達(dá)

結(jié)果顯示，破裂型LDH患者腰椎間盤組織中VEGF陽性總表達(dá)率(87.5%)高于非破裂型(50%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；破裂型和非破裂型LDH患者腰椎間盤組織中bFGF陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同病程中，患者病程>12個月的破裂型LDH腰椎間盤組織中VEGF陽性表達(dá)率(75%)高于非破裂型(12.5%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余病程破裂型和非破裂型LDH腰椎間盤組織中VEGF陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同病程的LDH患者腰椎間盤組織中VEGF和bFGF陽性表達(dá)[n(%)]

2.5 LDH患者的腰椎間盤組織中VEGF和bFGF陽性表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)McNemar檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VEGF陽性靈敏度(31/33=93.94%)高于bFGF陽性靈敏度(31/41=75.61%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.083，P=0.039)。經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，LDH患者的腰椎間盤組織中bFGF與VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(rs=0.358，P=0.012)。

3 討論

突出椎間盤自發(fā)性吸收是LDH患者在未經(jīng)化學(xué)溶核、外科手術(shù)干預(yù)情況下發(fā)生的突出組織自發(fā)性消失或縮小現(xiàn)象[8]。隨著MRI的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外有關(guān)LDH突出組織自發(fā)性吸收的臨床報告日益增多，證實(shí)自發(fā)性吸收現(xiàn)象客觀存在，這對手術(shù)治療LDH提出了更為嚴(yán)格的適應(yīng)證[9-10]。目前關(guān)于突出椎間盤自發(fā)性吸收的機(jī)制越來越明晰，包括新生血管形成、炎癥免疫反應(yīng)、機(jī)械壓力、細(xì)胞自噬與凋亡等多種因素，但具體發(fā)生過程及如何激活相關(guān)機(jī)制仍尚未完全闡明[11]。本研究從新生血管形成因素入手，了解新生血管形成過程中相關(guān)因子的表達(dá)，以期為優(yōu)化臨床LDH治療方案提供新的方向。

正常成年椎間盤髓核及纖維環(huán)是體內(nèi)最大的無血管組織，髓核所需營養(yǎng)物質(zhì)主要經(jīng)軟骨終板和纖維環(huán)滲透進(jìn)入，LDH患者進(jìn)入硬膜外腔的突出組織表面可見明顯的新生毛細(xì)血管[12-14]。VEGF作為重要的血管生長刺激因子之一，一方面能促進(jìn)新生血管形成，將炎性細(xì)胞募集到炎癥區(qū)域，另一方面通過內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2受體增加血管通透性，維持炎癥反應(yīng)過程，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的浸潤及吞噬，從而使突出的髓核組織逐漸縮小和消失[15-16]。Pufe 等[17]發(fā)現(xiàn)利用 VEGF可刺激軟骨細(xì)胞，顯著上調(diào)金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-13 的表達(dá)，下調(diào)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、TIMP-2 的表達(dá)，促進(jìn)椎間盤退變；采用VEGFR-2 抑制劑可逆轉(zhuǎn)VEGF 對軟骨細(xì)胞的促分解代謝反應(yīng)，緩解退變進(jìn)程。bFGF也是促進(jìn)血管形成的重要因子，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及誘導(dǎo)大量的纖維蛋白溶酶原激活劑產(chǎn)生，促使新的毛細(xì)血管芽形成。研究顯示，bFGF在突出的髓核組織中呈高表達(dá)，且能與炎癥因子腫瘤壞死因子-ɑ相互作用，通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和提高金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)促進(jìn)突出組織的吸收[18]，注射bFGF 能減少退變早期椎間盤形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞[19]。

本研究中病理組織學(xué)檢測對照組未見新生血管形成，觀察組17例見新生血管。免疫組織化學(xué)檢測48例LDH組織VEGF、bFGF陽性率分別為68.75%及85.72%，對照組未見VEGF、bFGF陽性表達(dá)，破裂型的VEGF陽性總表達(dá)率(87.5%)高于非破裂型(50%，P<0.05)，提示新生血管形成是LDH患者突出組織自發(fā)性吸收的重要過程，VEGF、bFGF均參與了突出組織自發(fā)性吸收過程，且破裂型更能反映血管新生及自發(fā)性吸收特點(diǎn)。此外，有研究顯示突出椎間盤組織自發(fā)性吸收主要發(fā)生在發(fā)病后2～12個月，3～6個月時呈顯著性變化，巨大破裂型LDH急性起病時更易發(fā)生自發(fā)性吸收現(xiàn)象[11]。本組研究中病程≤12月破裂型患者VEGF陽性表達(dá)率無明顯差異，隨病程延長到12個月以后VEGF陽性表達(dá)率降低，但病程>12個月破裂型患者VEGF陽性表達(dá)率(75%)仍高于非破裂型(12.5%，P<0.05)；破裂型和非破裂型患者的bFGF陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，bFGF陽性表達(dá)性率在7～12個月時開始降低，提示病程≤12月破裂型患者更易發(fā)生突出組織自發(fā)性吸收，且隨病程延長破裂型患者發(fā)生自發(fā)性吸收的可能性仍大于非破裂型患者，同時可推測VEGF表達(dá)的降低可能與后期血管缺血及閉鎖有關(guān)；而bFGF在整個重吸收過程變化緩慢，可推測其在椎間盤發(fā)育、成熟及退變過程中起持續(xù)作用。除此之外，bFGF能作用于血管壁，通過提高VEGF的蛋白水平，促進(jìn)血管新生[20]。實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析顯示，bFGF和VEGF呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.358，P=0.012)，也驗(yàn)證了bFGF能促進(jìn)VEGF的表達(dá)。觀察組組織中見炎性細(xì)胞浸潤、軟骨細(xì)胞增生、基質(zhì)增多，可能與炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬、基質(zhì)金屬蛋白酶的合成與降解失衡等相關(guān)，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，破裂型患者病程≤12月更易發(fā)生突出組織自發(fā)性吸收；VEGF、bFGF均參與了突出椎間盤自發(fā)性吸收過程，且bFGF能促進(jìn)VEGF的表達(dá)，了解兩者在新生血管形成及突出椎間盤自發(fā)性吸收過程中的作用及規(guī)律，有望為非手術(shù)治療LDH提供了可靠證據(jù)和新的思路。