黃亞蘭，張望明，劉小花，余曉靜，安麗君，吳介恒，楊留啟，劉杰麟,2**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥患者死亡的主要原因[1-2]。根據(jù)乳腺癌激素表達(dá)情況以及基因表達(dá)可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型及三陰性型多種亞型[3]，其中三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移、導(dǎo)致局部和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)率高，是乳腺癌亞型中預(yù)后較差的一種。TNBC的定義是不表達(dá)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體-2(HER-2)，因此對內(nèi)分泌藥物缺乏敏感性，以及靶向治療的選擇有限，使這類腫瘤的替代治療策略備受關(guān)注[4]。RecQ DNA解旋酶是一個(gè)在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)家族，是一類通過水解ATP高能磷酸鍵、獲得能量后解開DNA雙鏈結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生單鏈DNA的酶[5]。人體內(nèi)含有5種RecQ DNA解旋酶，分別是RECQL1、BLM、WRN、RECQL4和RECQL5，這些解旋酶在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和端粒維持等[6-7]。有研究表明BLM DNA解旋酶與癌癥的發(fā)展有著密切聯(lián)系[8-9]，BLM DNA解旋酶mRNA表達(dá)增加與乳腺癌患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期的減少相關(guān)[10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BLM DNA解旋酶蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中均有表達(dá)，但在癌組織中表達(dá)更高、且與TNM臨床分期相關(guān)[11]。前列腺癌組織和細(xì)胞中BLM DNA解旋酶的表達(dá)明顯高于非前列腺癌組織和細(xì)胞，干擾BLM DNA解旋酶的表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而減緩疾病的進(jìn)程[12]。目前關(guān)于BLM DNA解旋酶在TNBC中的作用研究較少，本研究在體外以三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞為研究對象，探討沉默BLMDNA解旋酶基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制，為TNBC分子靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本 收集2012—2014年三陰性乳腺癌30例、乳腺纖維腺瘤20例和癌旁正常對照石蠟包埋組織12例，臨床資料完整，所有患者在手術(shù)切除腫瘤前均未進(jìn)行放化療。全部的人組織標(biāo)本使用按照貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生物倫理學(xué)會(huì)的要求，對病人的隱私予以保密。

1.1.2細(xì)胞與主要試劑 人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，乳腺癌MCF-7細(xì)胞及三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Lipofectamine 2000(美國 Invitrogen公司)，RIPA 強(qiáng)裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司)，MTT 試劑(北京索萊寶公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司)，BLM抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，γ-H2AX、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8抗體(成都正能生物公司)，Rad51抗體(北京博奧森生物公司)，BRCA1抗體(武漢三鷹生物公司)，GAPDH抗體(武漢賽維爾公司)。

1.1.3主要儀器 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)，恒溫干燥箱(上海醫(yī)療器械廠)，超微量微孔板分光光度計(jì)(美國biotek公司)，正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)，流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)。

1.2 研究方法

1.2.1免疫組織化學(xué)(IHC)染色檢測BLM DNA解旋酶的表達(dá) 利用IHC二步法檢測三陰性乳腺癌、乳腺纖維腺瘤和癌旁組織中BLM DNA解旋酶的表達(dá)情況，BLM DNA解旋酶單克隆抗體工作濃度為1∶500。由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)專業(yè)老師對切片IHC染色進(jìn)行評(píng)估，細(xì)胞核或(和)細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色即認(rèn)為是BLM DNA解旋酶蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)。免疫組織化學(xué)評(píng)分(IHS)根據(jù)染色的強(qiáng)度和陽性表達(dá)細(xì)胞的百分比。染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性(未著色)為0分，弱陽性(淡黃色)為1分，中度陽性(棕黃色)為2分，強(qiáng)陽性(棕色)為3分。陽性細(xì)胞百分比的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞比例≤5%(陰性)為0分，陽性細(xì)胞比例6%～25%(弱陽性)為1分，陽性細(xì)胞比例26%～50%(中度陽性)為2分，陽性細(xì)胞比例51%～75%(陽性)為3分，陽性細(xì)胞比例≥76%(強(qiáng)陽性)為4分。每張切片的蛋白質(zhì)IHC染色指數(shù)為染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞比例評(píng)分的乘積。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，乳腺癌MCF-7細(xì)胞及三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，均置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3siRNA設(shè)計(jì)合成及轉(zhuǎn)染 由上海吉瑪公司合成3對靶向BLMDNA解旋酶基因的siRNA序列和1對陰性對照siRNA。siRNA-BLM 1正義鏈為5′-CGGCCAAUUAAAUCAGUAUTT-3′,反義鏈為5′-AUACUGAUUUAAUUGGCCGTT-3′;siRNA-BLM 2 正義鏈為 5′-GGAGGUGGUAAGAGUUUGUTT-3′,反義鏈為5′-ACAAACUCUUACCACCUCCTT-3′;siRNA-BLM 3正義鏈為5′-GCCACAUGUAGAAAGAUAUTT-3′,反義鏈為5′-AUAUCUUUCUACAUGUGGCTT-3′;Negative Control正義鏈為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。染前24 h將MDA-MB-468細(xì)胞以每孔5×105個(gè)鋪至6孔板，轉(zhuǎn)染時(shí)設(shè)置5個(gè)組分別為轉(zhuǎn)染組(Control)、siRNA-NC、siRNA-BLM 1、siRNA-BLM 2和siRNA-BLM 3，以Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染過程參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染6 h后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液更換6孔板中的轉(zhuǎn)染液體，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞蛋白檢測沉默效果，軟件測量各組條帶灰度值(A)。沉默效率(%)=[1-(A干擾組BLM×A未轉(zhuǎn)染組GAPDH)/(A干擾組GAPDH×A未轉(zhuǎn)染組BLM)]×100%，選取沉默效率最高的siRNA序列構(gòu)建shRNA干擾載體慢病毒，由上海吉?jiǎng)P基因公司完成。

1.2.4慢病毒感染及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 將對數(shù)生長期的MDA-MB-468細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種到6孔板中。將實(shí)驗(yàn)分為shRNA-NC組和shRNA-BLM組，分別為感染陰性對照慢病毒組和感染shRNA-BLM重組慢病毒組。感染步驟：去除6孔板內(nèi)液體，加DMEM 1 mL、慢病毒感染增強(qiáng)液HitransG P 40 μL 及病毒液15 μL，培養(yǎng)12 h更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，用含嘌呤霉素2 mg/L的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定沉默BLMDNA解旋酶基因的細(xì)胞株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。shRNA-NC序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT，shRNA-BLM序列為GCCACATGTAGAAAGATAT。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞活力 將shRNA-BLM組和shRNA-NC組細(xì)胞接種至96孔板，接種密度為1.2×104個(gè)/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加DMSO 150 μL，震蕩后用微量微孔板分光光度計(jì)在490 nm處檢測各孔光吸收值(OD)。

1.2.6平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力 shRNA-BLM組和shRNA-NC組細(xì)胞以每孔3×103個(gè)/孔接種在含有1.5 mL培養(yǎng)液的12孔板中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 d后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，蒸餾水將染液沖洗干凈，計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集shRNA-BLM組和shRNA-NC組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌兩次，離心后棄掉上清液。加入1×Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞，在每管細(xì)胞樣本中各加入7-AAD 10 μL和Annexin V-APC 5 μL，用移液器輕輕混勻，室溫條件下避光染色5 min上機(jī)檢測。

1.2.8單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測細(xì)胞DNA損傷 在shRNA-BLM組和shRNA-NC組細(xì)胞中加入PBS，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。配制0.5%普通正常熔點(diǎn)的瓊脂糖，覆蓋至載玻片上，干燥后為第一層膠。取細(xì)胞懸液 10 μL與0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖 75 μL混勻，滴加至第一層膠上。將載玻片浸入細(xì)胞裂解液中，4 ℃裂解2 h，PBS洗滌。載玻片放置在水平電泳槽中，加入堿性電泳緩沖液，室溫條件避光解旋1 h。設(shè)置電壓為25 V、電泳30 min，取出載玻片，0.4 mmol/L Tris-HCL緩沖液中和3次、每次10 min。滴加PI染液20 μL至凝膠上，于正置熒光顯微鏡下觀察，分析細(xì)胞尾部DNA含量。

1.2.9γ-H2AX免疫細(xì)胞化學(xué)染色 PBS洗滌細(xì)胞樣本，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌3次、每次3 min；滴加1%Triton X-100通透液4 min，PBS漂洗3次；PBS配制3%BSA，室溫封閉30 min，PBS洗滌；PBS以400∶1稀釋γ-H2AX抗體，加至樣本上，4 ℃過夜。室溫平衡30 min后，加入山羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次；DAB顯色1 min，PBS漂洗，滴加蘇木素染液，室溫下染色3 min，蒸餾水沖洗。通風(fēng)條件下晾干后滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)γ-H2AX陽性細(xì)胞。

1.2.10Western blot法檢測細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸，使蛋白充分變性。加入蛋白樣品后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌三次，分別加入一抗BLM、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8、Rad51、BRCA1、GAPDH(TBST 稀釋，均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入對應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(TBST稀釋，1∶4 000)，室溫孵2 h，TBST洗膜后曝光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，Image J軟件用于分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BLM DNA解旋酶在組織與細(xì)胞中的表達(dá)

在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)BLM DNA解旋酶在膽管癌、食管癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等常見惡性腫瘤以及其對應(yīng)的正常組織之間存在差異表達(dá)。與正常組織比較，BLM DNA解旋酶在大多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)(圖1A)，在乳腺癌呈明顯高表達(dá)(圖1B)。在GEO數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)BLM DNA解旋酶mRNA高表達(dá)與乳腺癌患者總生存期(OS)、無復(fù)發(fā)生存期(RFS)降低相關(guān)(圖1C，D)。IHC結(jié)果顯示，BLM DNA解旋酶的陽性著色定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)(圖1E)，BLM DNA解旋酶在TNBC組織中表達(dá)高于乳腺纖維腺瘤和癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)；在乳腺纖維腺瘤和癌旁組織之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。Western blot結(jié)果顯示，TNBC MDA-MB-468細(xì)胞中BLM DNA解旋酶蛋白表達(dá)水平顯著高于正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1F，P<0.01)。

表1 三陰性乳腺癌、乳腺纖維腺瘤和癌旁組織中BLM DNA解旋酶的表達(dá)

注：A、B為在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析BLM DNA解旋酶在組織中的表達(dá)情況，C、D為在GEO數(shù)據(jù)庫中分析BLM DNA解旋酶在乳腺癌患者中的預(yù)后價(jià)值，E為IHC檢測BLM DNA解旋酶在組織中的表達(dá)情況(DAB顯色)，F(xiàn)為Western blot檢測BLM DNA解旋酶在細(xì)胞中的表達(dá)情況及定量結(jié)果；(1)與MCF-10A和MCF-7組比較，P<0.01。

2.2 沉默三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中BLM DNA解旋酶基因的表達(dá)

為了沉默三陰性乳腺癌細(xì)胞中BLMDNA解旋酶基因的表達(dá)，將siRNA序列轉(zhuǎn)染MDA-MB-468細(xì)胞(圖2A)。蛋白印跡結(jié)果顯示，與Control組比較，siRNA-BLM 3實(shí)驗(yàn)組BLM DNA解旋酶表達(dá)水平下降，蛋白沉默效率為60.49%(圖2B,P<0.05)。選取沉默效率最高的siRNA-3序列構(gòu)建shRNA干擾載體慢病毒，將shRNA干擾載體慢病毒感染MDA-MB-468細(xì)胞(圖3A)。Western blot法檢測BLM DNA解旋酶蛋白沉默效果，如圖3B所示，與shRNA-NC組相比較，shRNA-BLM組BLM DNA解旋酶蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為細(xì)胞轉(zhuǎn)染FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記的siRNA序列后于光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡下視野(100×)；B為BLM DNA解旋酶蛋白表達(dá)情況及定量結(jié)果；(1)與Control組比較，P<0.05;(2)與siRNA-NC組比較，P<0.01。

注：A為細(xì)胞感染GFP標(biāo)記的shRNA質(zhì)粒慢病毒后于光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡下視野(100×)；B為BLM DNA解旋酶蛋白表達(dá)情況及定量結(jié)果；(1)與shRNA-NC組比較，P<0.001。

2.3 沉默BLM DNA解旋酶基因抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖、集落形成能力

MTT檢測結(jié)果顯示，與shRNA-NC組比較，shRNA-BLM組細(xì)胞生長曲線上升平緩。shRNA-BLM組48 h、72 h的OD值均低于shRNA-NC組(圖4A，P<0.001)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA-BLM組細(xì)胞集落數(shù)為(194±31)，shRNA-NC組細(xì)胞集落數(shù)為(10±2)，shRNA-BLM組細(xì)胞集落數(shù)低于shRNA-NC組(圖4B，P<0.001)。提示下調(diào)BLM DNA解旋酶表達(dá)顯著抑制MDA-MB-468細(xì)胞生長及集落形成能力，使其增殖減慢。

注：A為MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，B為平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果及定量結(jié)果；(1)與shRNA-NC組比較，P<0.001。

2.4 沉默BLM DNA解旋酶基因促進(jìn)MDA-MB-468細(xì)胞凋亡

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測shRNA-NC組和shRNA-BLM 組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，shRNA-BLM沉默組的細(xì)胞凋亡率較陰性對照組shRNA-NC顯著增加(圖5A,P<0.01)。Western blot檢測shRNA-NC組和shRNA-BLM細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，與shRNA-NC組相比，shRNA-BLM組Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(圖5B,P<0.05)。說明沉默BLMDNA解旋酶基因促進(jìn)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞發(fā)生凋亡。

注：A為兩組細(xì)胞凋亡水平及定量結(jié)果，B為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平及定量結(jié)果；(1)與shRNA-NC 組比較，P<0.01；(2)與shRNA-NC組比較，P<0.05。

2.5 沉默BLM DNA解旋酶基因增加MDA-MB-468細(xì)胞DNA 損傷

為了分析沉默BLMDNA解旋酶基因?qū)NA損傷的影響，收集shRNA-NC陰性對照組和shRNA-BLM沉默組的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳、計(jì)算細(xì)胞尾部DNA含量；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX灶的形成，Western blot法檢測DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白BRCA1、Rad51表達(dá)。結(jié)果顯示，與shRNA-NC組相比較，shRNA-BLM組細(xì)胞拖尾更明顯，尾部DNA含量更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6A，P<0.001)；γ-H2AX陽性細(xì)胞比例顯著增加(圖6B，P<0.001)；BRCA1、Rad51蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6C，P<0.05)。提示沉默BLMDNA解旋酶基因增加三陰性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力下降。

注：A為單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果及定量結(jié)果(DAPI染色)，B為免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果及定量結(jié)果(DAB顯色)，C為DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)及定量結(jié)果；(1)與shRNA-NC 組比較，P<0.001；(2)與siRNA-NC 組比較，P<0.05；(3)與shRNA-NC組比較，P<0.01。

3 討論

三陰性乳腺癌具有缺乏靶向治療，患者生存率低、預(yù)后差等特點(diǎn)，非靶向治療策略通常會(huì)對機(jī)體腎臟、心臟、肝臟和其他正常組織等器官造成毒性作用和不良反應(yīng)[13]。因此，為三陰性乳腺癌尋找有效的抗癌分子靶點(diǎn)是基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)，具有重要的臨床意義[14]。BLM DNA解旋酶是RecQ DNA解旋酶家族的重要成員之一，由位于15q26.1區(qū)帶上的BLM DNA解旋酶基因編碼[15]。研究顯示在惡性腫瘤組織及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BLM DNA解旋酶的表達(dá)高于癌旁組織和正常細(xì)胞，在通過沉默BLM DNA解旋酶表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞周期受到阻滯，細(xì)胞的增殖和遷移能力均受到抑制[16]。關(guān)于BLM DNA解旋酶在三陰性乳腺癌中作用的研究相對較少，本研究結(jié)果顯示BLM DNA解旋酶在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中BLM DNA解旋酶蛋白表達(dá)水平高于正常乳腺上皮細(xì)胞，提示BLM DNA解旋酶可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過RNAi技術(shù)，構(gòu)建shRNA-BLM干擾載體慢病毒感染MDA-MB-468細(xì)胞，探究沉默BLMDNA解旋酶基因表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示shRNA-BLM組BLM DNA解旋酶蛋白表達(dá)水平低于shRNA-NC組，說明沉默BLMDNA解旋酶基因的細(xì)胞株構(gòu)建成功，可用于后續(xù)研究。

惡性腫瘤最顯著的特征之一是細(xì)胞增殖失控，抑制癌細(xì)胞增殖在抗癌和疾病防御中起著關(guān)鍵作用[17]。有研究報(bào)道下調(diào)BLM DNA解旋酶的表達(dá)不僅能夠抑制人晶體上皮細(xì)胞的增殖，還促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18]。在前列腺癌細(xì)胞中BLM DNA解旋酶的過度表達(dá)有助于前列腺癌的進(jìn)展，在沉默BLMDNA解旋酶基因表達(dá)后，抑制前列腺癌PC3細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[19]。為了檢測沉默BLMDNA解旋酶基因的表達(dá)對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞增殖的影響，本研究采用MTT法以及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示下調(diào)BLM DNA解旋酶表達(dá)能夠抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖以及集落形成能力，表明BLM DNA解旋酶參與了三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖，BLM DNA解旋酶有作為治療三陰性乳腺癌分子靶點(diǎn)的潛力。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要形式，促進(jìn)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是抗腫瘤的重要機(jī)制[20]，常見的兩條凋亡途徑分為內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑，均有Caspase的參與[21]。Caspase蛋白家族中，Caspase-3屬于凋亡執(zhí)行因子，其活化是細(xì)胞進(jìn)入凋亡的重要標(biāo)志[22]。Caspase-8屬于凋亡啟動(dòng)因子，對多數(shù)執(zhí)行Caspase分子均能激活，進(jìn)而誘發(fā)凋亡。腫瘤細(xì)胞通過活化Caspase-8，活化后的Caspase-8特異性切割Caspase-3，生成效應(yīng)因子cleaved Caspase-3使腫瘤細(xì)胞解體導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。Bax是細(xì)胞內(nèi)重要的促凋亡基因，Bcl-2為抑制細(xì)胞凋亡基因，兩者屬于Bcl-2家族。Bax與Bcl-2之間表達(dá)水平的改變在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[24]。研究表明，癌細(xì)胞內(nèi)cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8、Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡[25]。為了檢測沉默BLM DNA解旋酶的表達(dá)對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法分別檢測細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示，沉默BLM DNA解旋酶表達(dá)后細(xì)胞凋亡率增加，Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，說明BLM DNA解旋酶沉默后可促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞凋亡，這與張等[26]研究發(fā)現(xiàn)沉默在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)的BLM DNA解旋酶后，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡一致。

基因組的完整性和穩(wěn)定性對細(xì)胞至關(guān)重要，當(dāng)細(xì)胞DNA持續(xù)暴露于應(yīng)激源下會(huì)導(dǎo)致DNA損傷。當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞激活DNA損傷檢查點(diǎn)和周期檢查點(diǎn)以阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，并促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，當(dāng)DNA修復(fù)失敗導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，就會(huì)觸發(fā)程序性細(xì)胞死亡[27]。在感知和修復(fù)DNA損傷中γ-H2AX起著核心作用，可作為DNA損傷的早期敏感生物標(biāo)記物[28]。作為DNA修復(fù)基因，Rad51基因編碼的蛋白質(zhì)是參與同源重組的關(guān)鍵酶，在維持DNA的遺傳穩(wěn)定性和多樣性方面發(fā)揮著重要作用[29]。同樣作為DNA修復(fù)基因的BRCA1目前已知是一種重要的抑癌基因，BRCA1基因編碼的蛋白參與細(xì)胞代謝的多個(gè)過程，包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等，BRCA1蛋白在DNA修復(fù)中的特殊作用是維持基因組的穩(wěn)定性。BLM DNA解旋酶在DNA修復(fù)中起著重要作用，為了檢測沉默BLM DNA解旋酶的表達(dá)對三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞DNA損傷及修復(fù)的影響，本研究通過單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測細(xì)胞尾部DNA含量，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX、Western Blot檢測BRCA1、Rad51的表達(dá)。結(jié)果顯示，抑制 BLM DNA解旋酶表達(dá)后，細(xì)胞尾部DNA含量、γ-H2AX陽性細(xì)胞數(shù)增加，DNA損傷修復(fù)蛋白BRCA1、Rad51 蛋白表達(dá)下調(diào)，提示沉默BLMDNA解旋酶基因達(dá)，三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞DNA損傷增加，DNA損傷修復(fù)能力下降。

綜上所述，BLM DNA解旋酶在三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中高表達(dá)，shRNA介導(dǎo)的BLMDNA解旋酶基因沉默抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白受抑制。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，DNA修復(fù)失敗導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，靶向抑制BLM DNA解旋酶的表達(dá)有望為TNBC治療提供新的思路。