肖建旭 ， 孫艷爭

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 河北 保定 071000 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)感染包括家養(yǎng)動物、野生動物和人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物。近年來，臨沂動植物園內(nèi)野生動物如斑馬、梅花鹿、平頂猴等頻繁出現(xiàn)流產(chǎn)，而弓形蟲病又是引起動物流產(chǎn)的主要原因之一，弓形蟲一旦在園區(qū)內(nèi)流行極可能造成人獸共患風險，因此本試驗對臨沂動植物園珍稀野生動物弓形蟲感染情況進行調(diào)查。被譽為弓形蟲檢測金標準的改良凝集試驗(MAT)是臨床和流行病學調(diào)查中最常用于檢測弓形蟲的方法之一[1]，所以本調(diào)查在檢測園內(nèi)181只珍稀野生動物和園內(nèi)流浪貓弓形蟲IgG抗體水平時采用了MAT法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備和器材 熒光倒置顯微鏡(X71型號)，日本Olympus公司；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；高速冷凍離心機(Centrifuge 5810R)，德國Eppendorf公司；冰箱(BCD-238S)，海爾集團；微量移液器，德國Eppendorf公司；電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.1.2 試劑及材料 Vero細胞，中國農(nóng)業(yè)大學汪明教授惠贈，由本實驗室傳代保存。弓形蟲RH株速殖子，中國農(nóng)業(yè)大學劉群教授惠贈，由本實驗室傳代保存。DMEM細胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液，均購自賽默飛世爾生物制品有限公司；胎牛血清，購自德國PAN-Biotech GmhH公司；100 mm細胞培養(yǎng)皿、96孔U型微量板，均購自Coming公司；β-羥基乙醇，購自北京奧科斯科技有限公司。福爾馬林溶液：PBS和甲醛溶液按照6∶1配比。伊文思藍染液：在100 mL PBS溶液中添加0.2 g伊文思藍粉末，混合均勻。堿性緩沖液：含7.01 g NaCl、3.09 g H3BO3、2 g NaN3和4 g牛血清白蛋白，用24 mL 1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.95，加入H2O2定容至1 000 mL，置于4～6oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 調(diào)查對象 包括2個綱12個目20個科43種珍稀野生動物181頭(只)和流浪貓41只。每只動物靜脈采血0.5～2 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清，-20 ℃保存待檢。以上動物均于2019年捕獲檢測，全部來源于臨沂動植物園園區(qū)內(nèi)，試驗結束后全部放歸園區(qū)，在動物館舍內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 MAT檢測

1.3.1 Vero細胞擴增弓形蟲速殖子 當Vero細胞單層鋪滿至80%左右時，接種弓形蟲RH株速殖子，接種量為106～107個/瓶，待速殖子入侵細胞，細胞破裂釋放出速殖子后，收集培養(yǎng)瓶內(nèi)的懸液，然后以2 500 r/min離心10 min，棄去上清，加20倍沉淀體積的PBS進行洗滌，離心棄去上清，加適量PBS重懸沉淀，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MAT抗原懸液制備 收集到的弓形蟲速殖子懸液經(jīng)過10 mL注射器吹打，去除其中的細胞碎片，以2 500 r/min離心10 min，棄去上清，沉淀按1∶6加入福爾馬林溶液固定24 h。將固定的速殖子懸液以2 500 r/min離心10 min，棄去上清，加入PBS重懸沉淀，2 500 r/min離心10 min，以上操作重復3次。最后用堿性緩沖液調(diào)整速殖子濃度為107個/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MAT法檢測弓形蟲IgG抗體 96孔U型板中加入25 μL待檢血清，稀釋倍數(shù)分別為1∶20～1∶2 560，然后加入10 μL新鮮配制的抗原液(70 μL 2-巰基乙醇，100 μL 0.2%伊文思藍，1 mL 1.3.2中制備的抗原懸液)，振蕩混合均勻，用鋁錫紙密封，置于37 ℃保存，于24～72 h后觀察結果。結果判定：若抗原抗體結合物如地毯狀平鋪于孔底則為陽性；若抗原抗體結合物在孔底為紐扣狀的凝集物則為陰性[2]。

1.4 統(tǒng)計學分析 所得數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件進行處理，技術資料用樣本數(shù)和陽性率表示。采用單因素方差分析，比較館舍開放程度、季節(jié)和飼料等因素對弓形蟲IgG抗體陽性率的影響。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 珍稀野生動物和流浪貓弓形蟲感染情況 本試驗共對181頭(只)珍稀野生動物和41只流浪貓的血液樣本進行弓形蟲IgG抗體檢測，珍稀野生動物中一級動物有14種61頭(只)，二級動物有21種95頭(只)，三有保護動物及山東省重點動物有8種25頭(只)。結果如表1所示，臨沂動植物園珍稀野生動物弓形蟲IgG抗體陽性率為38.12%；41只流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率為21.95%。主要檢測結果見表1。

2.2 不同種屬動物弓形蟲IgG抗體陽性率分析 不同種屬動物弓形蟲IgG抗體陽性率從高到低排序：雞形目54.55%、雁形目52.27%、偶蹄目47.06%、鶴形目42.86%、靈長目33.33%、有袋目20.00%、鸛形目16.67%、肉食目4.76%、長鼻目0。

2.3 館舍開放程度、食性、季節(jié)與弓形蟲IgG抗體陽性率的關系分析 本調(diào)查中有101頭(只)野生動物生活在半封閉性館舍內(nèi)，其弓形蟲IgG抗體陽性率為51.49%，其余80頭(只)野生動物生活在全封閉性館舍內(nèi)，其弓形蟲IgG抗體陽性率為26.25%，二者的陽性率差異顯著(P<0.05)。草食類和鳥類動物弓形蟲IgG抗體陽性率(47.06%和44.05%)明顯高于肉食類動物弓形蟲IgG抗體陽性率(4.76%)。按照動物食性不同，弓形蟲IgG抗體陽性率從高到低排序為植食性動物(44.83%)>雜食性動物(33.33%)>肉食性動物(4.76%)，其中植食性動物和肉食性動物的陽性率差異顯著(P<0.05)，雜食性動物和肉食性動物的陽性率差異顯著(P<0.05)。同年夏冬兩季分別檢測黑頸天鵝、黑天鵝、大白天鵝和疣鼻天鵝4種珍禽的弓形蟲感染情況，夏季弓形蟲IgG抗體陽性率分別是60.00%、28.57%、0、25.00%，冬季弓形蟲IgG抗體陽性率分別是100%、100%、33.33%和44.44%，經(jīng)統(tǒng)計學分析，夏季和冬季弓形蟲IgG抗體陽性率差異極顯著(x2=7.291，P=0.007)。

2.4 不同性別、季節(jié)和生活地點流浪貓弓形蟲感染情況 雄性流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率為21.42%，雌性流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率為23.08%，二者差異不顯著(x2=0.906，P>0.05)。按照采樣檢查時間的分布，得出不同季節(jié)的流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率分別為春季50.00%、夏季0、秋季16.67%和冬季30.77%。不同季節(jié)流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率差異顯著(P<0.05)。根據(jù)流浪貓主要生活地點劃分，弓形蟲IgG抗體陽性率分別為百鳥園33.33%、天鵝湖28.57%、食草動物散養(yǎng)區(qū)37.50%、獅虎山0、草食區(qū)14.29%、飼料室50.00%和廣場0。

表1 臨沂動植物園主要珍稀野生動物弓形蟲IgG抗體檢測Table 1 Seroprevalence of T. gondii antibodies in rare wild animals in Linyi Zoological and Botanical Garden

2.5 流浪貓與野生動物弓形蟲感染情況相關性分析 根據(jù)野生動物館舍分布情況和流浪貓主要生活地點，選取百鳥園、天鵝湖、草食動物散養(yǎng)區(qū)、獅虎山和草食區(qū)共5個片區(qū)進行分析。經(jīng)Pearson相關分析，野生動物弓形蟲IgG抗體陽性率與同區(qū)域流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率成正比(R2=0.978，P<0.001)，說明野生動物弓形蟲感染率與館舍附近流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率呈正相關。

3 討論

弓形蟲病的癥狀、病理變化雖有一定的特征，但必須進行實驗室診斷，查出病原體或其特異性抗體方能確診[3]。目前，群體動物感染弓形蟲的情況主要通過抗體測試進行判斷[4]。改良凝集試驗(MAT) 是由美國學者Dubey等在直接凝集試驗基礎上經(jīng)過改良而建立的檢測方法，Dubey將幾種免疫診斷技術比較后確認了MAT法是弓形蟲抗體檢測的金標準[1]，因此，本調(diào)查選定了MAT檢測法開展研究。本調(diào)查選取的珍稀野生動物和流浪貓均無接種弓形蟲疫苗史，血清中弓形蟲IgG抗體陽性說明其感染過弓形蟲。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，臨沂動植物園園區(qū)內(nèi)181頭(只)珍稀野生動物弓形蟲IgG抗體總體陽性率為38.12%，而北京、上海、成都、杭州和福州動物園的弓形蟲IgG抗體陽性率分別為19.35%、35.00%、47.46%、21.19%和22.70%[5-9]，說明魯南蘇北地區(qū)野生動物弓形蟲感染率較高，遠遠高于北京、杭州和福州等地。本園中頻繁發(fā)生的斑馬、梅花鹿等流產(chǎn)，不能排除與弓形蟲病有關，后續(xù)將進一步有目的性地鑒別診斷。同群野生動物中冬季的弓形蟲IgG抗體陽性率明顯高于夏季，這可能與弓形蟲卵囊對高溫和紫外線敏感，卵囊在夏季孢子化率下降有關。與北京、上海、福州等地動物園[5-6,9]情況一致的是，臨沂動植物園內(nèi)野生動物弓形蟲感染率與館舍的開放度也有很大關聯(lián)性，這主要是因為半開放性館舍中，小型動物流浪貓、老鼠等可自由出入，其排泄物包含有弓形蟲卵囊[10]，可能對動物飼料及環(huán)境造成潛在的威脅，從而導致草食類和鳥類動物弓形蟲IgG抗體陽性率明顯高于肉食類動物。動物采食被污染的飼料是感染弓形蟲的一個重要途徑[11]，本次調(diào)查中，在哺乳動物中，食肉性動物弓形蟲IgG抗體陽性率明顯低于植食性動物和雜食性動物。分析這一現(xiàn)象可能原因：首先是植食性和雜食性動物居住館舍比較封閉，流浪貓不能進入，降低了感染的概率；其次是肉類和魚類飼料全部經(jīng)過科學冷凍后再解凍投喂，冷凍后飼料中的弓形蟲卵囊存活率降低，極大地減少了感染的概率；另外，雜食性鳥類可采食地面昆蟲或者蚯蚓之類的小動物，導致誤吞入弓形蟲而發(fā)生了感染。

本次調(diào)查中，雄性流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率為21.42%，雌性流浪貓陽性率為23.08%，二者差異不顯著(x2=0.906，P>0.05)，此結果與于晉海等[12]研究結果一致。本調(diào)查中不同季節(jié)流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率差異顯著(P<0.05)，這可能與環(huán)境溫度影響弓形蟲卵囊的存活率有關。流浪貓與園區(qū)其他動物間接接觸途徑主要包括：弓形蟲陽性流浪貓排出卵囊污染館舍、飼料、水源等，被動物接觸或誤食后感染；在爭奪食物過程中發(fā)生肢體接觸；流浪貓將弓形蟲傳染給鼠類，部分動物捕食老鼠后感染。本調(diào)查與趙娟等[5]研究結果一致，野生動物與館舍及周邊流浪貓感染弓形蟲的趨勢一致，野生動物弓形蟲總體感染率與館舍附近流浪貓弓形蟲IgG抗體陽性率呈正相關。

本次調(diào)查說明，圈養(yǎng)野生動物中也存在較高的弓形蟲感染率，加強對飼料、環(huán)境、從業(yè)人員的科學管理，不僅是保護珍稀野生動物的需要，更是減少人和多種動物弓形蟲病互患風險的有效措施。