陳俊成 ， 袁 栩 ， 馬子月 ， 李曉齊 ， 曹 紅 ， 王永強 ， 鄭世軍 ， 高 麗

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流行病學(xué)重點實驗室 ， 北京 海淀 100193)

雞傳染性貧血(Chicken infectious anemia，CIA)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)引起的一種禽免疫抑制病[1]。雛雞感染CIAV后胸腺細胞和骨髓中成紅細胞被破壞，造成嚴(yán)重的免疫抑制和貧血[2-3]，這不僅會降低疫苗對雛雞的保護作用，導(dǎo)致雛雞死亡率增高，還會降低飼料轉(zhuǎn)化率以及肉雞的生產(chǎn)性能，對家禽產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟影響[4-5]。CIAV屬于指環(huán)病毒科 (Anelloviridae) 環(huán)病毒屬 (Gyrovirus)，病毒基因組為環(huán)狀單鏈DNA，編碼3種病毒蛋白：VP1、VP2和VP3。VP1是唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，可結(jié)合病毒中的ssDNA[6]； VP2是一種雙特異性蛋白質(zhì)磷酸酶，在病毒粒子組裝過程中主要起到腳手架蛋白的作用[7]； VP3又稱凋亡素，可誘導(dǎo)淋巴細胞與骨髓造血母細胞凋亡，最終導(dǎo)致雞出現(xiàn)貧血和免疫抑制[8]。

反向遺傳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種DNA病毒，該技術(shù)通過將DNA病毒的全長基因組克隆入質(zhì)粒載體從而獲得感染性克隆，然后將感染性克隆轉(zhuǎn)染細胞拯救獲得重組病毒[9-10]。由于CIAV是環(huán)狀病毒，直接將全基因組DNA插入質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染細胞并不能得到重組病毒。目前多先通過分段獲得CIAV基因組，連接得到線性全長基因組后，繼而連接載體并通過酶切環(huán)化得到病毒環(huán)狀基因組[11]； 此外，還可在載體中加入重復(fù)的兩端CIAV基因組[12]。但上述方法需要進行多次酶切、連接、單克隆鑒定、測序等復(fù)雜程序，耗時較長。本試驗通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，一次性擴增出CIAV全基因組，并通過引物設(shè)計使CIAV基因組兩端帶有與載體相同酶切位點的同源臂，使用同源重組技術(shù)將病毒基因組嵌合入載體中，提高了CIAV感染性克隆構(gòu)建的效率，為進一步研究CIAV的致病機制和研發(fā)新型疫苗提供了試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和質(zhì)粒 CIAV Cux-1毒株，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所楊兵研究員饋贈；質(zhì)粒pcDNA3.1，由本實驗室保存；雞淋巴瘤細胞MDCC-MSB1，購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)；大腸桿菌感受態(tài)菌株Trans-T1，購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 DNA 凝膠回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒，均購自廣州美基生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；LATaq酶、限制性內(nèi)切酶和Solution I連接酶，均購自日本 TaKaRa公司；2×Basic Assembly Mix(同源重組酶)，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖，購自北京盛旭百川生物科技有限公司；100×非必需氨基酸和胎牛血清，均購自美國 Gibco 公司；低熔點瓊脂，購自北京博奧拓達科技有限公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker)，購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；核酸染料 Gold View、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、FITC 標(biāo)記山羊抗鼠 IgG，均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CIAV VP2 3D7株單克隆抗體，由本實驗室制備。

1.3 主要儀器 電泳成套設(shè)備，北京東方瑞利科技有限公司；臺式電子天平，德國Sartorius公司；高壓蒸氣自動滅菌器，日本電氣公司；-80 ℃超低溫冰箱，美國Forma Scientific公司；低溫冷凍高速離心機，德國Eppendorf 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha公司；超凈工作臺，中國蘇州凈化設(shè)備廠；透射電子顯微鏡，日本Hitachi 公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；倒置顯微鏡，中國重光公司；Bio-Rad電穿孔儀，美國伯樂公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 DNA提取 將CIAV Cux-1株病毒接種MDCC-MSB1細胞，用含有2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基維持培養(yǎng)24 h，收取細胞與細胞上清并反復(fù)凍融3次，經(jīng)3 000 g離心2 min后取上清，用病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒提取DNA。

1.4.2 CIAV全長基因組的克隆 根據(jù)CIAV Cux-1株基因序列 (GenBank登錄號:M55918.1)及 pcDNA3.1質(zhì)粒多克隆位點設(shè)計帶有同源臂和酶切位點的引物(表1)，并由北京擎科生物科技有限公司合成。以病毒基因組DNA為模板，以CIAV-AflⅡ-F/R為引物，用LATaq酶進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2×High Fidelity Master Mix 25 μL，模板 5 μL，上、下游引物各 2 μL，ddH2O 13.5 μL，DMSO 2.5 μL；PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。用DNA 凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物回收和純化。

表1 病毒基因組擴增引物(基于Cux-1毒株)Table 1 Primers for viral genome amplification (based on Cux-1 strain)

1.4.3 嵌合CIAV Cux-1株全長基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用AflII內(nèi)切酶酶切pcDNA3.1載體，回收純化酶切后產(chǎn)物。應(yīng)用同源重組酶將病毒基因組DNA與線性化pcDNA3.1載體同源重組，從而將病毒基因組DNA全長嵌合入載體中。同源重組體系：2×Basic Assembly Mix 5 μL，目的基因 3.5 μL，線性化載體 1.5 μL；反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，4 ℃保存。同源重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Trans-T1，進一步通過菌落PCR篩選陽性克隆并進行測序鑒定，將測序正確的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-Cux-1。

1.4.4 CIAV全長基因組的環(huán)化 對重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Cux-1 進行AflⅡ單酶切，酶切體系：AflⅡ限制性內(nèi)切酶 1 μL，10×buffer 5 μL，重組質(zhì)粒 2 μg，ddH2O補充至50 μL。得到線性化CIAV Cux-1株全基因組，其兩端攜帶有互補的黏性末端。酶切產(chǎn)物經(jīng)回收和純化后，通過SolutionⅠ連接酶連接得到 CIAV Cux-1 環(huán)狀DNA。

1.4.5 重組病毒rCux-1的拯救 為區(qū)分重組病毒與親本病毒，將重組病毒命名為rCux-1。CIAV Cux-1環(huán)狀DNA電轉(zhuǎn)染 (220 V，10 ms)導(dǎo)入MDCC-MSB1細胞。轉(zhuǎn)染后細胞置于含10%胎牛血清、無抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，48 h后對細胞反復(fù)凍融3次，離心收獲上清液并通過0.45 μm濾器過濾，將濾液按1∶10接種MDCC-MSB1細胞進行連續(xù)傳代。

1.4.6 重組病毒rCux-1的鑒定

1.4.6.1 PCR鑒定 當(dāng)病毒連續(xù)傳代至第3、4、5代時，通過病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒提取病毒DNA，使用CIAV-298-F/R引物進行PCR擴增CIAVvp2保守區(qū)。

1.4.6.2 Western blot檢測VP2蛋白 當(dāng)病毒連續(xù)傳代至第8代時，用RIPA裂解液裂解細胞收獲細胞總蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以CIAV VP2 3D7株單抗為一抗(1∶1 000)，以HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗(1∶10 000)；使用化學(xué)發(fā)光法進行曝光。

1.4.6.3 間接免疫熒光檢測VP2蛋白 當(dāng)病毒連續(xù)傳代至第8代時，離心收集MDCC-MSB1細胞，并用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗滌2次，每次1 min;以適量PBS重懸細胞，將細胞涂于載玻片，室溫干燥；用丙酮-乙醇(體積比為1∶1)4 ℃固定15 min;37 ℃、1% BSA封閉2 h；向細胞涂片滴加CIAV VP2 3D7株單抗稀釋液(1∶100)，37 ℃孵育1 h；用PBS室溫洗滌3次，每次5 min；向細胞涂片滴加 FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG(1∶100)，37 ℃孵育30 min;用PBS室溫洗滌3次，每次5 min；室溫干燥后在熒光顯微鏡下觀察。

1.4.7 重組病毒遺傳標(biāo)志鑒定 將第9代病毒液根據(jù)病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒說明書提取病毒DNA，通過CIAV-short-F/R引物進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物進行AflⅡ酶切鑒定。

1.4.8 建立病毒拷貝數(shù)定量PCR(qPCR)標(biāo)準(zhǔn)曲線 計算包含CIAVvp2保守區(qū)的重組質(zhì)粒摩爾濃度，以10倍濃度梯度稀釋的質(zhì)粒作為模板，使用CIAV-298-F/R引物進行qPCR擴增，以Ct值對應(yīng)質(zhì)粒拷貝數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其公式為LogYCt=LogX+Ct×Log(1+E)，其中YCt為第Ct個循環(huán)后擴增產(chǎn)物的量，X為原模板數(shù)，E為擴增效率，Ct為擴增循環(huán)數(shù)。

1.4.9 CIAV復(fù)制曲線的測定 將重組病毒與親本病毒按照感染復(fù)數(shù)(MOI)為1分別感染處于對數(shù)生長期的MDCC-MSB1細胞，在感染后的0、6、12、24 h 和48 h反復(fù)凍融裂解細胞，并離心收獲上清液，保存于-80 ℃。提取病毒DNA，進行qPCR擴增，通過1.4.8建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算CIAV拷貝數(shù)，繪制病毒生長動力學(xué)曲線。qPCR反應(yīng)體系：2×M5 HiPer SYBR Premix 10 μL，模板 2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 7.2 μL；qPCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，共40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s；50 ℃降溫30 s。

1.5 CIAV感染性克隆構(gòu)建流程 CIAV感染性克隆構(gòu)建流程如圖1所示。

圖1 感染性克隆構(gòu)建流程Fig.1 Flow chart of infectious clone construction

2 結(jié)果

2.1 CIAV全長基因組的克隆 以CIAV Cux-1毒株感染MDCC-MSB1后提取的DNA為模板，采用同源臂擴增引物CIAV-AflⅡ-F/R經(jīng)PCR擴增獲得兩端帶有同源臂的CIAV基因組，片段大小為2 355 bp，與預(yù)期大小一致(圖2A)。

2.2 pcDNA3.1-Cux-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 pcDNA3.1載體經(jīng)AflⅡ限制性內(nèi)切酶單酶切后線性化(圖2B)，與帶有同源臂的CIAV基因組進行同源重組，轉(zhuǎn)化后挑取測序正確的質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-Cux-1。測序結(jié)果顯示，除兩端帶AflII酶切位點外，質(zhì)粒pcDNA3.1-Cux-1中插入的CIAV基因序列與親本病毒完全相同。

圖2 CIAV Cux-1全長基因組PCR擴增(A)與pcDNA3.1載體線性化(B)Fig.2 PCR amplification of CIAV Cux-1 full-length genome (A) and linearization of pcDNA3.1 vector (B)M:DNA標(biāo)志物(DL2 000 plus)； 1～2:Cux-1毒株樣品； 3～4:pcDNA3.1載體經(jīng)Afl Ⅱ限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物M:DL2 000 plus DNA Marker; 1-2:Cux-1 strain samples； 3-4:pcDNA3.1 vector digested by Afl Ⅱ restriction endonuclease

2.3 CIAV環(huán)狀全長基因組的構(gòu)建 利用AflⅡ限制性核酸內(nèi)切酶位點將CIAV全長基因組從pcDNA3.1-Cux-1質(zhì)粒上切割下來，電泳條帶分別為2 350 bp和5 500 bp左右(圖3)，與預(yù)期大小一致。回收并純化2 350 bp左右的條帶，通過Solution Ⅰ 連接酶將線性DNA環(huán)化，得到CIAV Cux-1環(huán)狀基因組。

圖3 CIAV全長基因組的環(huán)化Fig.3 Cyclization of full-length CIAV genomeM:DNA標(biāo)志物(DL2 000 plus)； 1:質(zhì)粒pcDNA3.1酶切后樣品； 2:質(zhì)粒pcDNA3.1-Cux-1酶切后樣品M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Plasmid pcDNA3.1 samples after enzyme digestion; 2:Plasmid pcDNA3.1-Cux-1 samples after enzyme digestion

2.4 重組病毒rCux-1的鑒定 將CIAV Cux-1環(huán)狀基因組通過電轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入MDCC-MSB1細胞，并進行連續(xù)傳代。通過PCR檢測第3、4、5代細胞，結(jié)果如圖4所示，病毒DNA均能被檢測到，表明病毒可進行傳代。將rCux-1傳至第8代時，Western blot檢測結(jié)果顯示，CIAV感染MDCC-MSB1細胞24 h后，親本病毒和重組病毒均能檢測到VP2蛋白，而對照細胞無法檢測到VP2蛋白(圖5)，表明重組病毒rCux-1能夠正常表達蛋白。同時應(yīng)用間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)VP2蛋白，結(jié)果顯示，親本病毒和重組病毒均可檢測到特異性的綠色熒光，而對照細胞無法檢測到特異性的綠色熒光(圖6)。

圖4 重組病毒的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of the recombinant virusM:DNA標(biāo)志物(DL2 000 plus)； 1:空白對照； 2:陰性對照； 3:第3代重組病毒rCux-1； 4:陰性對照； 5:第4代重組病毒rCux-1； 6:陰性對照； 7:第5代重組病毒rCux-1M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Blank control; 2:Negative control; 3:3rd recombinant virus rCux-1; 4:Negative control; 5:4th recombinant virus rCux-1; 6:Negative control; 7:5th recombinant virus rCux-1

圖5 免疫印跡檢測病毒VP2蛋白Fig.5 Immunoblot detection of viral VP2 protein1:陰性對照； 2:親本病毒Cux-1； 3:重組病毒rCux-11:Negative control; 2:Parental virus Cux-1; 3:Recombinant virus rCux-1

圖6 間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)VP2蛋白Fig.6 Indirect immunofluorescence detection of intracellular VP2 proteinA～C：陰性對照； D～F：親本病毒Cux-1； G～I：重組病毒rCux-1A-C：Negative control; D-F：Parental virus Cux-1; G-I：Recombinant virus rCux-1

2.5 重組病毒遺傳標(biāo)志的鑒定 將rCux-1傳至第9代，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增帶有AflⅡ酶切位點遺傳標(biāo)記的序列，電泳結(jié)果顯示，目的條帶大小為736 bp，與預(yù)期大小一致(圖7)。用限制性內(nèi)切酶AflⅡ?qū)δ繕?biāo)序列進行單酶切，電泳結(jié)果顯示，親本毒株Cux-1 PCR產(chǎn)物未被切開，而重組毒株rCux-1 PCR產(chǎn)物切開后得到2條大小為360 bp左右的條帶(圖8)，表明獲得的重組病毒rCux-1帶有特定遺傳標(biāo)記，為感染性克隆構(gòu)建所得重組病毒。

圖7 重組病毒的PCR鑒定Fig.7 PCR identification of the recombinant virusM:DNA標(biāo)志物(DL2 000 plus)； 1:空白對照； 2:陰性對照； 3:親本病毒Cux-1； 4:重組病毒rCux-1M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Blank control; 2:Negative control; 3:Parental virus Cux-1; 4:Recombinant virus rCux-1

圖8 親本病毒和重組病毒PCR產(chǎn)物的酶切鑒定Fig.8 Identification of PCR products of the parental and recombinant virus by enzymatic digestionM:DNA標(biāo)志物(DL2 000 plus)； 1:親本病毒 PCR產(chǎn)物酶切后樣品； 2:重組病毒PCR產(chǎn)物酶切后樣品M:DL2 000 plus DNA Marker; 1:Sample of parental virus PCR product after enzymatic digestion; 2:Sample of recombinant virus PCR product after enzymatic digestion

2.6 病毒復(fù)制曲線分析 為比較重組病毒rCux-1與親本病毒的復(fù)制能力和增殖特性是否發(fā)生變化，將rCux-1傳至第9代后檢測病毒感染MDCC-MSB1細胞后不同時間點的病毒拷貝數(shù)并繪制病毒生長曲線，發(fā)現(xiàn)二者生長趨勢一致(圖9)，表明重組病毒復(fù)制能力和增殖特性與親本Cux-1株基本相同，可用于后續(xù)研究。

圖9 親本病毒Cux-1和重組病毒rCux-1的生長曲線Fig.9 Growth curves of parental virus Cux-1 and recombinant virus rCux-1

3 討論

CIAV是一種重要的禽類免疫抑制病病毒，該病毒于1979年由Yuasa等學(xué)者首次報道[3]。隨后發(fā)現(xiàn)CIAV在世界各地的家禽場中普遍存在，我國于1992年在黑龍江省首次分離到該病毒[13-15]。目前，CIAV在我國廣泛流行[15]，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，但目前尚沒有有效的疫苗防控該病，針對CIAV的減毒活疫苗免疫后誘導(dǎo)的抗體效價較低，僅能提供中等保護[16]，因此深入研究CIAV致病機制對于制備新型的亞單位疫苗或DNA疫苗具有重要意義。

反向遺傳操作是病毒研究的重要方法，為深入研究病毒致病分子機制以及研制疫苗奠定了基礎(chǔ)[17]。為快速構(gòu)建CIAV反向遺傳平臺，本試驗采用一步法擴增CIAV全基因組，在同源重組酶的作用下連接病毒基因和線性化的質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒中CIAV全基因組兩端的同源臂上具有相同的酶切位點，單酶切后可在體外使用T4 DNA連接酶將其環(huán)化，得到環(huán)狀的CIAV全基因組。

將環(huán)狀的CIAV基因組電轉(zhuǎn)染入MDCC-MSB1細胞中，盲傳3代后開始提取病毒DNA，連續(xù)檢測第3～5代病毒DNA，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)傳代后仍能夠檢測到病毒，初步表明病毒拯救成功。本試驗在病毒傳至第8代時收取了細胞與蛋白，使用VP2單克隆抗體，分別通過間接免疫熒光和Western blot進行鑒定，發(fā)現(xiàn)均能檢測到VP2蛋白。為進一步探究重組病毒與親本病毒的復(fù)制能力和增殖特性，比較重組病毒第9代rCux-1與親本病毒第9代Cux-1的生長動力曲線，結(jié)果表明重組毒株與親本毒株增殖能力基本一致。最后，以第9代病毒的DNA為模板，通過PCR擴增其遺傳標(biāo)記，經(jīng)酶切鑒定為陽性，表明一步法構(gòu)建CIAV感染性克隆平臺準(zhǔn)確有效。

本試驗感染性克隆構(gòu)建的關(guān)鍵在于得到病毒環(huán)狀DNA，CIAV基因組的長度較短(約2.3 kb)，為共價閉合環(huán)狀單股負(fù)鏈DNA。相比于其他方式如分段擴增等[11-12]，本試驗在高保真DNA聚合酶作用下一步得到病毒全基因組，縮短了構(gòu)建時間，并且是非載體依賴的分子克隆，更易于轉(zhuǎn)染入細胞得到病毒。

綜上所述，本試驗成功構(gòu)建了CIAV感染性克隆，為今后對CIAV進行致病機制研究提供了試驗基礎(chǔ)，也將為開展基因工程疫苗研究提供平臺。