鄒志卓 ， 黃 鶴 ， 許松姬

(延邊大學醫(yī)學院，吉林 延邊朝鮮族自治州 133000)

肥胖是一種能量攝入大于能量消耗的代謝性疾病[1]。當今社會，隨著經(jīng)濟發(fā)展、飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整和運動量減少，肥胖人數(shù)逐年增加[2]。肥胖是現(xiàn)今影響全球的公共衛(wèi)生問題，是很多疾病的高危因素，如高血壓、高血脂、脂肪肝、動脈粥樣硬化、癌癥等[3]。關(guān)于肥胖引起心血管疾病的研究很多，其中肥胖引起的臟器線粒體損傷[4-5]也受到廣泛關(guān)注。本試驗擬通過高脂飲食誘導大鼠肥胖，觀察肥胖對其心臟、肝臟線粒體呼吸功能的影響，通過檢測大鼠臟器線粒體呼吸控制率(Respiratory control ratio，RCR)和純化線粒體磷氧比(Adenosine diphosphate/ Oxygen，ADP/O)，直觀反映飲食誘導肥胖對其心臟、肝臟線粒體呼吸功能的影響，為進一步研究肥胖相關(guān)心血管疾病的線粒體損傷機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD清潔級雄性大鼠108只，體重(230±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016—0006，飼養(yǎng)于吉林醫(yī)藥學院動物實驗室。

1.2 主要試劑 心臟和肝臟組織線粒體分離緩沖液A、B(自制)；磷酸鹽(Phosphate buffered saline，PBS)緩沖液、ADP/O檢測試劑盒、RCR檢測試劑盒，均購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 分組及處理 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。自由飲水和攝食，記錄每天進食量，每周稱量體重1次。高脂飼料飼養(yǎng)2周后，根據(jù)體重增加量降序排序，位于體重增加量上1/3的大鼠作為飲食誘導肥胖(Diet-induced obesity，DIO)組，位于體重增加量下1/3的大鼠作為飲食誘導肥胖抵抗(Diet-induced obesity resistance，DR)組，位于體重增加量中間的為正常對照(Control，CON)組，每組36只。DIO組和DR組給予高脂飼料，CON組給予基礎(chǔ)飼料，持續(xù)喂養(yǎng)18周。

1.4 線粒體提取 為觀察飲食誘導肥胖過程中心臟和肝臟線粒體呼吸功能的動態(tài)變化，在飲食誘導肥胖過程中第8、10、12、14、16周和第18周，分別從CON組、DIO組和DR組中每組隨機選取6只大鼠處死，立即取心臟和肝臟組織置于預(yù)冷的PBS中。洗去血液，充分剪碎、勻漿，在4 ℃條件下使用低溫離心機3 000 g離心5 min，棄上清，取沉淀。心臟組織用心臟分離緩沖液A(120 mol/L NaCl，20 mol/L HEPES，2 mol/L MgCl2，1 mol/L EGTA，5 g/L 牛血清白蛋白；pH 7.4)，600 g離心10 min，取上清，再次離心(4 ℃，17 000 g，10 min)，沉淀用心臟緩沖液B(300 mol/L 蔗糖，2 mol/L HEPES，0.1 mol/L EGTA；pH 7.4)重懸即制成心臟線粒體懸液。肝臟組織用肝臟分離緩沖液A (0.22 mol/L甘露醇,0.07 mol/L蔗糖,0.02 mol/L HEPES,2 mol/L Tris-HCl,1 mol/L EDTA；pH 7.2)，于4 ℃條件下1 000 g離心10 min，取上清，再次離心(4 ℃，16 000 g，4 min)，棄上清，取沉淀后使用肝臟緩沖液B(0.22 mol/L甘露醇,0.07 mol/L蔗糖,0.01 mol/L Tris-HCl,1 mol/L EDTA;pH 7.2)重懸即制成肝臟線粒體懸液。心臟和肝臟部分所有操作均在0～4 ℃進行。

1.5 ADP/O水平的測定 預(yù)熱氧電極儀到37 ℃后加入2 mL介質(zhì)液(Reagent A)到反應(yīng)玻璃槽，開始記錄氧濃度O1。1 min后加入50 μL待測的心臟線粒體懸液和肝臟線粒體懸液，持續(xù)1 min后加入10 μL底物液(Reagent B)。持續(xù)記錄直至下行斜線出現(xiàn)拐點，記錄氧濃度O2，繼續(xù)加入10 μL底物液(Reagent B)，記錄氧濃度O3，持續(xù)記錄直至下行斜線出現(xiàn)拐點，記錄氧濃度O4，按照公式(1)和公式(2)計算氧濃度降低值和線粒體磷氧比(ADP/O)。

氧濃度降低值=(O1-O2)+(O3-O4)

(1)

ADP/O=

(2)

1.6 RCR水平的測定 將2 mL介質(zhì)液(Reagent A)加入到反應(yīng)玻璃槽，開始記錄氧濃度。1 min后加入50 μL待測的心臟線粒體懸液和肝臟線粒體懸液，持續(xù)1 min后加入10 μL底物液(Reagent B)——開始Ⅳ態(tài)呼吸。持續(xù)記錄2 min，出現(xiàn)氧濃度緩慢下降，繼續(xù)加入20 μL底物液(Reagent C)——開始Ⅲ態(tài)呼吸，持續(xù)記錄直至下行斜線出現(xiàn)拐點，記錄數(shù)據(jù)，按照公式(3)分別測算Ⅲ態(tài)呼吸速率和Ⅳ態(tài)呼吸速率,

(3)

并按照公式(4)計算RCR。

(4)

1.7 統(tǒng)計分析 連續(xù)變量用平均值±標準差(Mean±SD)表示，并使用獨立樣本t檢驗進行比較。所有的數(shù)據(jù)分析使用IBM SPSS程序(26版，SPSS公司，美國芝加哥)進行，所有的圖表使用GraphPad Prism軟件(8版，GraphPad Prism，美國加州圣地亞哥)進行。

2 結(jié)果

2.1 飲食誘導肥胖大鼠的體重變化 各組大鼠初始體重無差異，試驗第1周開始，DIO組體重明顯高于DR組(P<0.001)，第2周開始DIO組體重明顯高于CON組(P<0.001)。試驗第1、2、3、5、6、7、10、11周和第12周時，CON組大鼠體重明顯高于DR組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠每周體重變化情況Table 1 Weekly weight change in rats

2.2 心臟線粒體RCR和ADP/O測定 DIO組大鼠心臟線粒體RCR在試驗第16周和第18周時顯著低于CON組(P<0.05)，DR組在第16周和第18周也表現(xiàn)出低于CON組的趨勢，在第18周有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖1。ADP/O結(jié)果與RCR表現(xiàn)出相似的趨勢，均在第16周和第18周時，DIO組與DR組ADP/O水平顯著低于CON組(P<0.05)，見圖2。

圖1 大鼠心臟線粒體呼吸控制率(A)和磷氧比(B)Fig.1 Rat heart mitochondrial respiratory control rate (A) and P/O ratio (B)a:DIO組與CON組比較，P<0.05； b:DR組與CON組比較，P<0.05a:Comparison between DIO group and CON group, P<0.05; b:Comparison between DR group and CON group, P<0.05

2.3 肝臟線粒體RCR和ADP/O測定 大鼠肝臟線粒體呼吸功能表現(xiàn)出較心臟更強的抵抗能力，RCR結(jié)果僅在第16周時出現(xiàn)了DIO組顯著低于CON組(P<0.05)，其余時間點各組間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖2A)。ADP/O在第10周時，DIO組有高于CON組的趨勢(P=0.057)，在第18周時，DIO組ADP/O顯著低于DR組(P<0.05)，且有低于CON組的趨勢(P=0.093)(圖2B)。

圖2 大鼠肝臟線粒體呼吸控制率(A)和磷氧比(B)Fig.2 Rat liver mitochondrial respiratory control rate (A) and P/O ratio (B)a:DIO組與CON組比較，P<0.05; b:DIO組與DR組比較，P<0.05a:Comparison between DIO group and CON group,P<0.05; b:Comparison between DIO group and DR group,P<0.05

3 討論

肥胖個體易發(fā)生心肌脂類蓄積[6]、心肌耗氧量和脂肪酸氧化增加以及心肌效能降低；心肌線粒體呼吸功能降低和ATP合成減少，氧化磷酸化減弱，心肌解偶聯(lián)蛋白3(Uncoupling protein 3,UCP3)表達增加[7]。一旦線粒體受到外界因素影響，富含線粒體的心臟將很快出現(xiàn)相關(guān)反應(yīng)[8]。本試驗發(fā)現(xiàn)，第8～16周時，與肝臟相比，心臟各組各項指標都出現(xiàn)了十分明顯的變化。心臟線粒體對肥胖所致的損傷最為敏感。通過第14～18周心臟指標的變化，發(fā)現(xiàn)心臟在第16周時下降趨勢減緩，但因為試驗時間原因，不能確定心臟是否已出現(xiàn)了失代償[9]。與肝臟相比，心臟出現(xiàn)失代償?shù)内厔莞鼮槊黠@，并且從最開始測定各組指標時，心臟的波動比肝臟更劇烈，說明心臟的線粒體損傷更嚴重。

在保持機體代謝平衡的各種臟器中，肝臟起至關(guān)重要的作用[10]。除了脂類代謝主要在肝臟中發(fā)生外，肝臟同時與骨骼肌一起保持機體的血糖平衡。本試驗發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)大鼠肝臟并沒有出現(xiàn)明顯的失代償，這可能便是肝臟在脂類代謝和維持血糖平衡中發(fā)揮重要作用的原因。

本試驗顯示，高脂飲食可以引起大鼠心臟、肝臟線粒體損傷，其中大鼠心臟對肥胖所致的線粒體損傷尤為敏感，且心臟各項指標在較短時間內(nèi)出現(xiàn)波動，而肝臟也在之后的短時間內(nèi)出現(xiàn)指標波動。DR組大鼠比DIO組大鼠的線粒體代償能力更強，這種現(xiàn)象在不同臟器均有體現(xiàn)，在肝臟中DR組大鼠各項水平與CON組更相近。雖然本次試驗并未出現(xiàn)明顯的失代償，但是根據(jù)各項指標趨勢可以推測，隨著時間的進行，DR組大鼠出現(xiàn)失代償?shù)臅r間將晚于DIO組。得出上述試驗結(jié)果的可能原因：在高脂飲食誘導過程中，DIO組大鼠體內(nèi)在肥胖過程中會逐漸出現(xiàn)生理性代償作用，不同程度地緩沖適應(yīng)高脂肥胖給機體帶來的一系列生理性損害。與此同時，大鼠各臟器及其線粒體含量、鼠種不同、飼養(yǎng)環(huán)境、鼠齡等都可能是出現(xiàn)不同試驗結(jié)果的影響因素。