張向陽 ， 張靖菊 ， 陳 晨 ， 劉春雙 ， 王玉鳳 ， 張志博 ， 朱石荻 ， 劉欣彤 ， 劉義明 ， 徐 飛 ， 陳孝杰 ， 李秀波

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 ， 北京 海淀 100044)

合理使用消毒劑做好畜舍和生活環(huán)境的凈化消毒，對(duì)阻止疫病的傳播和擴(kuò)散尤為重要[1]，做好畜禽圈舍及環(huán)境消毒是畜牧業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵[2]。養(yǎng)殖場消毒中傳統(tǒng)的次氯酸鹽消毒劑對(duì)設(shè)備有腐蝕，且刺激性強(qiáng)，新型次氯酸消毒劑因濃度低、無殘留、低腐蝕性等優(yōu)點(diǎn)越來越得到重視[3]，有報(bào)道表明，現(xiàn)場制備的弱酸性次氯酸水在養(yǎng)殖環(huán)境和圈舍消毒方面表現(xiàn)良好[4-5]。本試驗(yàn)參照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[6]和《消毒技術(shù)規(guī)范》[7]，設(shè)計(jì)了懸液定性、定量殺菌試驗(yàn)和畜舍現(xiàn)場消毒試驗(yàn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室研制的一種瓶裝次氯酸消毒劑的殺菌效力進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，為其作為新獸藥的申報(bào)和獸醫(yī)臨床的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑 次氯酸消毒劑由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，批號(hào)：200820；選擇某獸用次氯酸鈉消毒劑，市面上購買，批號(hào)：20200501。現(xiàn)場試驗(yàn)用畜舍4 m2/個(gè)，水泥地面；試驗(yàn)用大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)8099和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)ATCC6538，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙型溶血性鏈球菌(Beta-hemolyticStreptococcus,S.hemolysis)32210和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)63501，均購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保存管理中心；硫代硫酸鈉容量分析用溶液(0.101 0 mol/L，批號(hào)：5451)，購自北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；可溶性淀粉、碘化鉀、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和吐溫-80(均為分析純)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；藏紅T和孔雀石綠(生物染色劑)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(Trypytic soy agar，TSA)和LB培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；小牛血清，購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.2 儀器 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)，購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ME203E/02型電子天平，購自梅特勒—托利多儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 有效氯含量測(cè)定 以有效氯含量作為評(píng)價(jià)含氯消毒劑濃度的指標(biāo)，參照衛(wèi)生部2018年發(fā)布的《含氯消毒劑衛(wèi)生要求》[8]中的方法測(cè)定有效氯含量。

1.3.2 細(xì)菌懸液制備 取凍干菌種增菌，單菌落傳代，單菌落接種液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h得到細(xì)菌懸液，稀釋成106～107CFU/mL菌懸液備用。

1.3.3 中和劑鑒定試驗(yàn) 以大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌為指示菌。中和劑采用含硫代硫酸鈉、吐溫-80的LB肉湯，磷酸鹽緩沖液稀釋菌懸液，無菌硬水稀釋消毒劑。參照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[6]設(shè)計(jì)6組試驗(yàn)，試驗(yàn)分組及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

按照公式(1)計(jì)算誤差率。

PX/%=∑|X-Xi|÷∑Xi×100%

(1)

式中PX為組間菌落誤差率；X為3組、4組、5組間菌落平均值；Xi為各組菌落平均數(shù)。

表1 中和劑鑒定試驗(yàn)分組及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Neutralizer identification test groups and evaluation criteria

1.3.4 懸液定性殺菌試驗(yàn) 參照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[6]，每種消毒劑按有效氯含量稀釋成125、100、75、50、25、12.5、6.25 mg/L和3.125 mg/L共8個(gè)濃度，選取1、5、10、15、30 min和60 min共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5 懸液定量殺菌試驗(yàn) 參照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[6]和定性試驗(yàn)結(jié)果初步確定消毒劑作用時(shí)間和濃度，參照公式(2)計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)。平均殺滅對(duì)數(shù)≥3，殺毒效能有效[7]。

殺滅對(duì)數(shù)=原菌液平均活菌濃度的對(duì)數(shù)(N0)-消毒劑處理組活菌濃度的對(duì)數(shù)(Nx)

(2)

1.3.6 畜舍現(xiàn)場消毒試驗(yàn) 次氯酸消毒劑設(shè)置高濃度(150 mg/L)、中濃度(75 mg/L)、低濃度(50 mg/L)，次氯酸鈉消毒劑按推薦劑量1∶100稀釋后有效氯含量為486 mg/L，用自來水代替消毒劑同步試驗(yàn)，作為陰性對(duì)照，進(jìn)行自然菌的現(xiàn)場消毒試驗(yàn)、對(duì)特定菌的現(xiàn)場消毒試驗(yàn)和畜舍空氣現(xiàn)場消毒試驗(yàn)。試驗(yàn)前對(duì)畜舍沖洗除污，自然干燥后備用。對(duì)特定菌的現(xiàn)場消毒試驗(yàn)提前將制備菌液均勻涂于采樣部位，保證采樣部位含菌量為105～106CFU，自然晾干后進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)自然菌的現(xiàn)場消毒試驗(yàn)和畜舍空氣現(xiàn)場消毒試驗(yàn)無此操作。消毒時(shí)使用噴霧器噴灑整個(gè)畜舍，包括畜舍內(nèi)空氣。采樣位置：每個(gè)濃度每次使用3個(gè)圈舍作為平行，試驗(yàn)前在空圈舍地面、欄桿、食槽用記號(hào)筆分別標(biāo)記出5 cm×5 cm區(qū)域的采樣部位，要求采樣部位相鄰而不相同，結(jié)果取平均值；采樣方法：無菌棉拭子浸潤中和劑后，在采樣區(qū)域橫豎各用力擦拭10次，并不斷轉(zhuǎn)換拭子擦拭面，將拭子棉花端剪入無菌離心管內(nèi)，封好；采樣時(shí)間：消毒前、消毒后10、20、30 min和60 min。檢測(cè)方法：樣品用無菌磷酸鹽緩沖液充分洗脫后梯度稀釋，在LB瓊脂平皿或含5%小牛血清的TSA瓊脂平皿均勻涂布，活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)。在做表面消毒的同時(shí)進(jìn)行空氣消毒試驗(yàn)，采用自然沉降法，時(shí)間點(diǎn)同上。將含5%小牛血清的TSA平皿均勻放置在畜舍不同位置敞口5 min，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)計(jì)數(shù)。參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[7]，現(xiàn)場消毒試驗(yàn)對(duì)環(huán)境自然菌的殺滅對(duì)數(shù)≥1，對(duì)特定菌的殺滅對(duì)數(shù)≥3，可判為消毒合格。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn) 由表2可知，5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L吐溫-80+20 g/L肉湯作為中和劑，1組、2組、6組無菌生長，E.coli和B.subtilis分別作為指示菌的3組、4組、5組間菌落數(shù)誤差率分別為1.21%和13.50%，均低于15%，可判定該中和劑能有效中和消毒劑，且對(duì)E.coli和B.subtilis生長均無影響。

表2 中和劑鑒定試驗(yàn)Table 2 Neutralizer identification test

2.2 懸液定性殺菌試驗(yàn) 由表3、表4可知，室溫作用1 min，次氯酸消毒劑完全殺滅E.coli所需有效氯含量最低為25 mg/L，完全殺滅S.aureus和S.hemolysis的最低有效氯含量均為75 mg/L；次氯酸鈉消毒劑完全殺滅S.aureus的最低有效氯含量為25 mg/L，完全殺滅E.coli和S.hemolysis所需有效氯含量最低為50 mg/L；2種消毒劑對(duì)B.subtilis作用5 min，完全殺滅B.subtilis的最低有效氯含量分別為75 mg/L和125 mg/L。初步確定定量殺菌試驗(yàn)消毒劑有效氯含量選擇6.25～125 mg/L。

表3 次氯酸消毒劑對(duì)細(xì)菌的定性殺菌效力Table 3 Qualitative bactericidal efficacy of hypochlorous acid disinfectant on bacteria

表4 次氯酸鈉消毒劑對(duì)細(xì)菌的定性殺菌效力Table 4 Qualitative bactericidal efficacy of sodium hypochlorite disinfectant on bacteria

2.3 懸液定量殺菌試驗(yàn) 如圖1所示，當(dāng)有效氯含量為3.125 mg/L時(shí)，對(duì)E.coli，次氯酸消毒劑作用2 min殺滅對(duì)數(shù)達(dá)3以上，而次氯酸鈉消毒劑則需5 min；對(duì)S.aureus，次氯酸消毒劑的最短有效殺滅時(shí)間為2 min，次氯酸鈉消毒劑則為30 min；對(duì)S.hemolysis，次氯酸消毒劑作用60 min殺滅對(duì)數(shù)達(dá)6以上，次氯酸鈉消毒劑無有效消毒效能；對(duì)B.subtilis，2種消毒劑最短有效殺滅時(shí)間均為10 min。

圖1 有效氯含量3.125 mg/L的2種消毒劑對(duì)細(xì)菌的定量殺菌效力Fig.1 Quantitative bactericidal efficacy of two disinfectants containing 3.125 mg/L of available chlorine on bacteria

2.4 畜含現(xiàn)場消毒試驗(yàn)

2.4.1 對(duì)自然菌的現(xiàn)場消毒 由表5可知，次氯酸消毒劑有效氯含量為75 mg/L和150 mg/L時(shí)，消毒10 min，對(duì)畜舍不同位置自然菌的殺滅對(duì)數(shù)達(dá)1以上；次氯酸消毒劑有效氯含量為50 mg/L時(shí)，消毒10 min，對(duì)欄桿和食槽上自然菌的殺滅對(duì)數(shù)在1以上，對(duì)地面自然菌的殺滅對(duì)數(shù)低于1。次氯酸鈉消毒劑使用推薦濃度(486 mg/L)，在不同作用時(shí)間對(duì)欄桿、食槽和地面上自然菌的殺滅對(duì)數(shù)均在1以上。

表5 2種消毒劑作用不同時(shí)間對(duì)畜舍不同位置自然菌的消毒效果Table 5 Disinfection effect of two disinfectants on natural bacteria in different positions of livestock houses at different time

2.4.2 對(duì)特定菌的現(xiàn)場消毒 由表6可知，次氯酸消毒劑中濃度(75 mg/L)與次氯酸鈉消毒劑推薦濃度(486 mg/L)對(duì)不同位置特定菌作用10 min，殺滅對(duì)數(shù)均在3以上。

表6 次氯酸消毒劑中濃度(75 mg/L)和次氯酸鈉消毒劑推薦濃度(486 mg/L)對(duì)畜舍不同位置特定菌的消毒效果對(duì)比Table 6 Comparison of the disinfection effect of hypochlorous acid disinfectant medium concentration (75 mg/L) and sodium hypochlorite disinfectant recommended concentration (486 mg/L) on specific bacteria in different positions of livestock houses

2.4.3 畜舍空氣現(xiàn)場消毒 由圖2可知，次氯酸消毒劑中濃度(75 mg/L)和高濃度(150 mg/L)對(duì)空氣中自然菌的殺滅對(duì)數(shù)均在1以上，次氯酸消毒劑低濃度(50 mg/L)作用20 min消毒效果最好，殺滅對(duì)數(shù)在1以上，次氯酸鈉消毒劑推薦濃度(486 mg/L)殺菌對(duì)數(shù)不能穩(wěn)定在1以上。

圖2 2種消毒劑對(duì)畜舍空氣中自然菌的消毒效果Fig.2 Disinfection effect of two disinfectants on natural bacteria in the air of livestock houses

3 討論

市面上常用的含氯消毒劑多以次氯酸鈉消毒劑為主，廣泛應(yīng)用于家庭、食品、醫(yī)療、物流等多種領(lǐng)域[9]，但次氯酸鹽類消毒劑使用后會(huì)有鈉、鈣等金屬鹽離子殘留，可能會(huì)污染消毒物品表面。本試驗(yàn)研究的次氯酸消毒劑見光易分解，使用無殘留，無需清洗[10]。本產(chǎn)品是本實(shí)驗(yàn)室制備的次氯酸瓶裝溶液劑成品，殺菌效力穩(wěn)定，適用于家庭等小規(guī)模、間斷性場景，使用方便，操作簡單，彌補(bǔ)了目前市面上使用次氯酸消毒劑時(shí)需借助次氯酸發(fā)生器現(xiàn)用現(xiàn)制[10-11]的短板。

對(duì)于本消毒劑多項(xiàng)殺菌力評(píng)價(jià)試驗(yàn)顯示，與次氯酸鈉消毒劑相比，次氯酸消毒劑對(duì)多種自然菌和特定菌有效殺滅濃度更低，殺菌速度更快，且75 mg/L次氯酸消毒劑即可達(dá)到與486 mg/L次氯酸鈉消毒劑相同的消毒效果。

全國消毒產(chǎn)品網(wǎng)上備案信息服務(wù)平臺(tái)信息顯示[12]，2020年1月1日之后備案的次氯酸消毒劑數(shù)量激增，次氯酸消毒劑越來越受到人們的認(rèn)可，相信未來該新型次氯酸消毒劑會(huì)在越來越多場景中使用。