鄧慶芬 劉曉麗 周玉璞

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有侵襲性、成瘤性強(qiáng)的雙重特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)放療、化療存在較明顯的抵抗性。核因子-κB(NF-κB)為誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，是主要的細(xì)胞存活通路，在人體多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，還可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[1-2]。有報(bào)道顯示[3-4]，放射治療后NF-κB通路可發(fā)揮抑制放射治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中放化療抵抗中起到關(guān)鍵性作用。但目前相關(guān)研究較少，故本研究觀察核因子-κB(NF-κB)抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)對(duì)放射治療誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞3#(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所)，PDTC購(gòu)自上海碧云天公司。人小腦膠質(zhì)細(xì)胞HAC(通派(上海)生物科技有限公司)、溶劑DMSO(Sigma，美國(guó))，F(xiàn)BS(Gibco，美國(guó))，雙抗(100 X)P/S(上海碧云天公司)，Trypsin(Abcam，中國(guó))，Phosphate緩沖液(南京森貝伽生物科技有限公司)，MTS比色試劑盒(上海宸功生物技術(shù)有限公司)，液體DMEM/F-12(上海澤葉生物科技有限公司)，Triton X-100(上海信裕生物科技有限公司)，Annexin V-FITC(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的培養(yǎng) 以1∶150 的比例用PBS稀釋后以2.5 mL/6cm皿的比例鋪板，4～8 h后將PBS吸出，將長(zhǎng)至3/4 左右密度的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞3#細(xì)胞消化后用5倍體積的DMEM/F-12停止消化；離心后分離收集膠質(zhì)瘤干細(xì)胞3#，用干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后傳入鋪有l(wèi)aminin的6 cm器皿中，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)(48～72 h 后)[5]。正常人小腦膠質(zhì)細(xì)胞，無(wú)需鋪laminin，0.25% Trypsin 消化后，應(yīng)用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng) 細(xì)胞中加入Trizol(上海源葉生物科技有限公司)進(jìn)行冰上裂解，然后依次進(jìn)行萃取、沉淀RNA、乙醇清洗等提取細(xì)胞總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。之后加入SYBR Green Realtime PCR Master Mix(日本ToYoBo)和相應(yīng)的上下游引物，放入Real-time PCR儀中，根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求設(shè)置相應(yīng)反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后，參考2-△△Ct方法計(jì)算研究數(shù)據(jù)。

1.2.3 X線照射 將細(xì)胞放在Rad Source RS2000pro 生物學(xué)X射線輻照儀樣品箱中，常用照射劑量率為1 Gy/min，按照本研究所需要照射劑量(8 Gy)設(shè)置照射時(shí)間。照射結(jié)束后常規(guī)換液，將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 分組 將細(xì)胞分成C組(加二甲基亞砜30 μmol/L)、PDTC組(30 μmol/L，加PDTC)、放療組(8 Gy，加二甲基亞砜30 μmol/L)和PDTC聯(lián)合放療組。每組均加入相應(yīng)PDTC或二甲基亞砜預(yù)處理2 h后進(jìn)行8 Gy的放射線照射，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行觀察指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.5 Western blot蛋白濃度檢測(cè) 采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法進(jìn)行NF-κB蛋白測(cè)定，電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，將NF-κB蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下，采用5%脫脂奶粉對(duì)膜封閉60 min，孵育相應(yīng)一抗(1∶500)4 ℃ 12 h。洗滌后加入對(duì)應(yīng)的二抗(1∶2000)孵育60 min。洗滌后在無(wú)光條件下采取增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色[6]。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行2次洗滌。加入200～500 μL的緩沖液重懸細(xì)胞，然后避光條件下加入2∶1的LAnnexin與PI充分混勻，開(kāi)始凋亡染色，室溫條件下，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，當(dāng)P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)影響

X線照射后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加，與C組比較差異有顯著性(P<0.05)；而PDTC可下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 放療對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)影響

2.2 PDTC聯(lián)合放療對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡的影響

PDTC組、放療組和聯(lián)合組的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡率與C組比較，依次半圓(1.50±0.16)倍、(2.48±0.15)倍、(6.55±0.24)倍，表明PDTC聯(lián)合放療時(shí)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡明顯增加。各組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡率見(jiàn)圖1。

圖1 PDTC聯(lián)合放療對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有兩大特點(diǎn)，一是無(wú)限的增殖能力，二是持續(xù)的自我更新能力。不僅如此，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞還與膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及抗藥有關(guān)[8-9]，為此，針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的藥物治療，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)可其可能成為膠質(zhì)瘤治療新途徑[10-11]。報(bào)道顯示[12]，活化的NF-κB是同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、侵襲、免疫和炎癥激活等作用在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。以往有報(bào)道顯示[13-15]，NF-κB活化與膠質(zhì)瘤級(jí)別和惡性程度存在一定的相關(guān)性，并且與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后存在緊密的聯(lián)系。

本研究顯示，X線照射后，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加，與C組差異有顯著性(P<0.05)。表明放療后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中NF-κB通路被活化。同時(shí)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)與C組比較，PDTC組NF-κB蛋白表達(dá)下降，與PDTC組比較，放療組NF-κB蛋白表達(dá)增加，與放療組比較，聯(lián)合組NF-κB蛋白表達(dá)下降。表明加入NF-κB通路抑制劑后可下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)。細(xì)胞凋亡情況顯示，PDTC組、放療組和聯(lián)合組的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡率均較C組增加顯著，且聯(lián)合組增加更加顯著。表明膠質(zhì)瘤干細(xì)胞X線照射后細(xì)胞凋亡率明顯增加，而聯(lián)合PDTC后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡明顯增加，進(jìn)一步表明PDTC對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療有增加其敏感性的作用。

綜上所述，NF-κB通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的放射治療中具有重要作用，并可以作為對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞放療增加敏感性的重要靶點(diǎn)。但本研究尚存在一定不足，如NF-κB通路在機(jī)體生理過(guò)程中作用廣泛，在多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用，而本研究未對(duì)PDTC抑制NF-κB通路的具體機(jī)制進(jìn)行深入研究，故未來(lái)應(yīng)對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。