尚學(xué)平，許世錦，陳羅華周, 陳玲娟

(廣東天益生物科技有限公司，廣東 湛江，524300)

20世紀(jì)70年代末，日本的ENDO等[1]發(fā)現(xiàn)了紅曲霉代謝產(chǎn)物中的降膽固醇活性物質(zhì)Monacolin K及其類似物，這極大地促進(jìn)了紅曲的研究與應(yīng)用。近年來，高膽固醇血癥發(fā)生率正以驚人的速度增長(zhǎng)。同時(shí)，它會(huì)引發(fā)多種心血管疾病及并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅到公眾健康。目前，臨床上普遍使用由土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的全部為閉環(huán)的降脂藥物治療高膽固醇血癥，但存在較多副作用，主要是對(duì)肝功能的損害，患者服藥期間需3個(gè)月進(jìn)行一次肝功能的血檢，因此通過研發(fā)紅曲菌發(fā)酵，特別是液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的富含高開環(huán)的Monacolin K的功能紅曲來達(dá)到降脂療效[2]，引起了廣泛的關(guān)注。

由于存在非甘油碳源液態(tài)發(fā)酵Monacolin K產(chǎn)量極低的技術(shù)瓶頸，因而采用符合GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的原料通過液態(tài)發(fā)酵開發(fā)出高含量、高開環(huán)的Monacolin K的功能紅曲，已成為當(dāng)今的研究重點(diǎn)[3]。

1 Monacolin K的生物活性

紅曲菌生物發(fā)酵產(chǎn)的Monacolin K，不管是采用固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方式，均以酸式(開環(huán)結(jié)構(gòu))和內(nèi)酯式(閉環(huán)結(jié)構(gòu))2種形式存在。酸式Monacolin K的結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)膽固醇合成途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A, HMG-CoA)的結(jié)構(gòu)相似,能與限速酶HMG-CoA還原酶形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而抑制膽固醇的合成[4]。內(nèi)酯式Monacolin K，則需要被人體肝臟分泌的羥基酸酯酶轉(zhuǎn)化為酸式結(jié)構(gòu)，才能夠發(fā)揮降膽固醇的作用[5]。因個(gè)體的差異，部分人體的肝臟能分泌羥基酸酯酶，而部分人體的肝臟則低分泌或不分泌羥基酸酯酶，所以內(nèi)酯式Monacolin K的降脂效果會(huì)大打折扣。同時(shí)，人體分泌羥基酸酯酶的同時(shí)，會(huì)對(duì)肝臟造成損害，也就是通常所說的功能紅曲Monacolin K的毒性問題，這是土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的無活性的100%內(nèi)酯式結(jié)構(gòu)的洛伐他汀的弊端所在。

2 Monacolin K的生物合成

Monacolin K是由紅曲霉聚酮體合成酶(polyketide synthetase, PKS)調(diào)控合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，有2條生物合成途徑[6](圖1)；一條在合成過程中形成中間體，依次轉(zhuǎn)化為Monacolin L、Monacolin J, 最后形成Monacolin K；另一條在合成過程中形成二甲基丁酰輔酶A，再進(jìn)一步合成Monacolin K。

通過對(duì)Monacolin K生物合成相關(guān)基因進(jìn)行鑒定，CHEN等[7]發(fā)現(xiàn)了9個(gè)和Monacolin K生物合成基因同源性較高的基因簇(圖2)，推測(cè)它們編碼Monacolin K蛋白質(zhì)的合成基因：mokA和mokB用于合成肽鏈骨架；還包括P450單氧酶基因(mokC),氧化還原酶基因(mokD),脫氫酶基因(mokE),轉(zhuǎn)酯酶基因(mokF),HMG-CoA還原酶基因(mokG),轉(zhuǎn)錄因子基因(mokH)及外排泵基因(mokI)。

圖1 Monacolin K的生物合成途徑Fig.1 Monacolin K biosynthetic pathway

將mokA基因破壞后，菌株不再合成Monacolin K，表明mokA編碼合成Monacolin K的聚酮體合成酶；將mokB基因破壞后[8]，菌株也不合成Monacolin K，但積累了一個(gè)中間體Monacolin J，表明mokB編碼聚酮體合成酶，負(fù)責(zé)側(cè)鏈二酮部分的生物合成;mokH基因編碼Zn(Ⅱ)2Cys6 雙核DNA結(jié)合蛋白，研究表明[9]，mokH 可以上調(diào)Monacolin K生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Monacolin K的合成。

3 功能紅曲液態(tài)發(fā)酵的控制策略

與功能紅曲傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵具有規(guī)模大，自動(dòng)化程度高，人力成本低，生長(zhǎng)過程中易控制雜菌等顯著優(yōu)點(diǎn)。但功能紅曲的液態(tài)深層發(fā)酵，也存在諸多不利因素：紅曲菌處于高滲透壓的狀態(tài)下，菌體的生長(zhǎng)和代謝受到包括菌種、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成與配比、發(fā)酵醪液滲透壓、溶氧、溫度、發(fā)酵醪液的稀黏度、補(bǔ)料工藝、攪拌葉的剪切力等因素的影響。

3.1 菌種的選育

選育高產(chǎn)Monacolin K的優(yōu)良菌株，是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵。目前，改良菌種的手段有誘變、遺傳重組和基因工程技術(shù)等手段，但考慮到基因工程菌株帶來的安全隱患，現(xiàn)在常用的菌種改良手段還是采用常規(guī)的誘變，其中包括紫外誘變和常壓室溫等離子(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變方式。李玲等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外誘變和ARTP誘變的紫色紅曲菌突變株，產(chǎn)Monacolin K能力較原菌株提高了1.0倍和2.3倍，經(jīng)5次傳代培養(yǎng)，Monacolin K產(chǎn)量分別下降2.83%和1.97%，表明2種誘變方法得到的突變株均能高產(chǎn)Monacolin K，同時(shí)具有良好的遺傳穩(wěn)定性。研究表明ARTP誘變方式比常規(guī)的誘變方式更具優(yōu)勢(shì)。祁田甜等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ARTP具有較強(qiáng)的致死和致突變效應(yīng)，可獲得較高的正突變率(23.8%)，篩選得到的突變株較出發(fā)菌株產(chǎn)Monacolin K提高了111%。研究表明ARTP產(chǎn)生的活性粒子可透過細(xì)胞膜作用于DNA，引起DNA發(fā)生多樣性損傷和不完全修復(fù)突變，形成遺傳穩(wěn)定的突變株。郎天丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，利用高能混合粒子場(chǎng)處理紫色紅曲霉，也能選育出高產(chǎn)Monacolin K、低產(chǎn)桔霉素的突變株，經(jīng)混合粒子場(chǎng)輻照后，紫色紅曲霉正突變率可達(dá)32.84%～60.56%，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K最高可達(dá)421.69 mg/L,較出發(fā)菌株最高提高了142.14%, 產(chǎn)桔霉素為0.01～0.04 mg/L。突變株經(jīng)5次傳代后，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K能力僅下降1.65%～4.21%，可獲得遺傳性能穩(wěn)定的突變株。由此可知，通過高能粒子或等離子對(duì)紅曲菌進(jìn)行誘變，是一種可應(yīng)用到微生物誘變育種的新方法。

圖2 Monacolin K的生物合成基因簇Fig.2 Monacolin K biosynthetic gene cluster

3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的構(gòu)建

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成與配比，直接影響紅曲菌的生長(zhǎng)與代謝，是高產(chǎn)功能紅曲活性物質(zhì)的決定性因素，菌株優(yōu)良性狀的高效表達(dá)，取決于優(yōu)良的培養(yǎng)基的構(gòu)建。

3.2.1 碳源的選擇

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的成分之一，對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝的作用主要為提供細(xì)胞的碳架，提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量，提供合成產(chǎn)物的碳架。

現(xiàn)有技術(shù)中，單獨(dú)使用大米粉作碳源進(jìn)行功能紅曲的液態(tài)發(fā)酵，所產(chǎn)生的活性物質(zhì)含量較低，發(fā)酵醪液Monacolin K含量通常在5～30 mg/L，無經(jīng)濟(jì)價(jià)值，無法批量生產(chǎn)及應(yīng)用。為此，眾多學(xué)者和研究人員，為實(shí)現(xiàn)紅曲菌高產(chǎn)Monacolin K，對(duì)碳源的選擇進(jìn)行了不懈的努力。陳曄等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以紅色紅曲菌9901作試驗(yàn)菌株，純甘油為碳源，大豆水解液為氮源，14 d搖瓶液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K可達(dá)1 600 mg/L,在15 L發(fā)酵罐中產(chǎn)Monacolin K可達(dá)888.9 mg/L，確認(rèn)最佳的碳源為甘油。陳泉等[14]采用紫色紅曲菌突變株MP60-6作試驗(yàn)菌株,以甘油與米粉復(fù)合碳源進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵17 d，產(chǎn)Monacolin K可達(dá)1 302 mg/L，為出發(fā)菌株產(chǎn)量的2.66倍。薛意斌等[15]采用煙色紅曲菌作試驗(yàn)菌株，甘油作碳源的液態(tài)深層發(fā)酵中，甘油含量在0～12%時(shí)，隨其濃度的增加，紅曲菌胞內(nèi)和胞外的總的Monacolin K產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，胞內(nèi)和胞外的總的Monacolin K達(dá)到最大，分別為9 474.4、7 005.8 μg/(g dcw)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)合成Monacolin K的相關(guān)基因mokA、mokD、mokE、mokG、mokH、mokI表達(dá)量較對(duì)照組逐漸升高。研究表明，甘油在液態(tài)發(fā)酵功能紅曲中具有重要的作用，既可作紅曲菌生長(zhǎng)的碳源，又可作為合成Monacolin K的前體物質(zhì)。

3.2.2 氮源的選擇

氮源是構(gòu)成菌體細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的主要成分，也是合成含氮代謝產(chǎn)物的主要原料，對(duì)微生物的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的積累有重要影響。陳泉等[14]在紫色紅曲菌突變株MP60-6的液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源中蛋白胨發(fā)酵Monacolin K產(chǎn)量最高，無機(jī)氮源中NaNO3發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K最高。童振宇等[16]利用單次單因子法和響應(yīng)面法相結(jié)合的方法，優(yōu)化紫色紅曲菌WX的液態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)利用有機(jī)氮源Monacolin K質(zhì)量濃度明顯高于無機(jī)氮源，在各種有機(jī)氮源中，蛋白胨和黃豆粉發(fā)酵的Monacolin K產(chǎn)量最高，考慮到黃豆粉成本較低，以黃豆粉為氮源較佳。

3.2.3 影響紅曲菌產(chǎn)Monacolin K的物質(zhì)選擇

要實(shí)現(xiàn)液態(tài)發(fā)酵功能紅曲的高產(chǎn)，關(guān)鍵是增加胞外代謝物的分泌，盡可能減少胞內(nèi)代謝物的反饋抑制，也就是增加細(xì)胞膜的通透性。柴詩(shī)緣等[17]以紫色紅曲菌作試驗(yàn)菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加山藥粉、橘皮粉、酵母菌液、酵母上清液、酵母破壁液、破壁后的酵母液、亮氨酸、谷氨酸、乙醇等物質(zhì)，進(jìn)行深層液態(tài)發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)：添加谷氨酸可以極顯著(P<0.01)增加Monacolin K的產(chǎn)量，產(chǎn)量提高了5.60倍, 通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，菌體細(xì)胞壁的褶皺增加，推測(cè)谷氨酸增加了紅曲菌細(xì)胞膜的通透性，使胞外代謝物分泌量增加，從而提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。朱倩倩等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在紫色紅曲菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加精氨酸、L-蘋果酸、D-葡萄糖、煙酰胺、α-酮戊二酸、苯丙氨酸、賴氨酸、焦磷酸硫胺素、黃素單核苷酸、L-乳酸等物質(zhì)，對(duì)發(fā)酵8和15 d的Monacolin K產(chǎn)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：精氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸以及黃素單核苷酸等物質(zhì)的添加對(duì)Monacolin K產(chǎn)量有促進(jìn)作用，其中精氨酸效果最為顯著，Monacolin K產(chǎn)量與對(duì)照組相比提高了2.3～3.7倍。朱穎慧等[19]在紫色紅曲菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1%檸檬酸，發(fā)現(xiàn)對(duì)Monacolin K的產(chǎn)量促進(jìn)效果最為顯著，與原始培養(yǎng)基相比提高了2.71倍，經(jīng)掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞壁表面出現(xiàn)了更多的褶皺，推測(cè)細(xì)胞膜的通透性有所提升；同時(shí)，采用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，添加檸檬酸的培養(yǎng)基中，紅曲菌Monacolin K合成關(guān)鍵基因(mokA-mokI,LaeA)的表達(dá)量呈現(xiàn)一定的上升趨勢(shì)，進(jìn)而提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。上述研究表明，氨基酸或有機(jī)酸的添加，既能增加細(xì)胞膜的通透性，又能提升Monacolin K合成關(guān)鍵基因(mokA-mokI,LaeA)的表達(dá)量，從而提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。ZHANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在紅色紅曲菌9901的液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加40.0 g/L非離子表面活性Triton X-100，發(fā)酵20 d產(chǎn)Monacolin K達(dá)到(2 026.0±30.4) mg/L，比對(duì)照組增加了84.9%。研究表明，Triton X-100能大幅增加細(xì)胞膜的通透性，驅(qū)使更多的胞內(nèi)代謝物分泌到發(fā)酵液中，從而降低了胞內(nèi)代謝物的反饋抑制，實(shí)現(xiàn)Monacolin K高產(chǎn)。

3.3 培養(yǎng)條件的構(gòu)建

3.3.1 培養(yǎng)溫度的選擇

紅曲菌能夠在較寬的溫度范圍內(nèi)(25～40 ℃)生長(zhǎng)，但其合成代謝物的溫度則相當(dāng)特殊，而利于高產(chǎn)高開環(huán)Monacolin K的培養(yǎng)溫度則更為特殊。黃穎穎等[21]研究發(fā)現(xiàn), 在接種量為6%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，搖瓶轉(zhuǎn)速160 r/min的紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中，先30 ℃培養(yǎng)2 d后再26 ℃培養(yǎng)7 d，產(chǎn)生開環(huán)的Monacolin K的比例可達(dá)87%，比26 ℃恒溫培養(yǎng)的提高了2.63倍。LIN等[22]采用煙色紅曲菌CG-6分2種工藝進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)。一種為恒溫30 ℃培養(yǎng)21 d；另一種為變溫培養(yǎng)，先于30 ℃培養(yǎng)6 d，然后25 ℃培養(yǎng)15 d, 測(cè)定菌體的生物量和Monacolin K的含量。結(jié)果顯示，恒溫培養(yǎng)能增加菌體的生物量，變溫培養(yǎng)Monacolin K的產(chǎn)量為恒溫培養(yǎng)的16倍。研究發(fā)現(xiàn)，基因mokI在變溫培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)量為恒溫培養(yǎng)的1.65倍，變溫培養(yǎng)能增強(qiáng)了次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生途徑中的蛋白質(zhì)表達(dá)，但抑制了參與菌絲體生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)。童振宇等[16]采用紫色紅曲菌WX作試驗(yàn)菌株，甘油作碳源，黃豆粉作氮源的液態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)Monacolin K的質(zhì)量濃度與培養(yǎng)溫度十分密切，在24～28 ℃的范圍內(nèi)，Monacolin K的質(zhì)量濃度較高，在28～32 ℃，Monacolin K的質(zhì)量濃度隨溫度的升高而急劇降低。研究表明，變溫培養(yǎng)有利于開環(huán)結(jié)構(gòu)的Monacolin K的合成與分泌，并能夠?qū)崿F(xiàn)Monacolin K的高產(chǎn)。

3.3.2 接種量的選擇

接種量的大小決定著發(fā)酵延緩期的長(zhǎng)短，隨著接種量的增加，菌體繁殖速度加快，生物量增加，相應(yīng)合成Monacolin K的產(chǎn)量也增加；但過高的接種量，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分消耗過快，而影響代謝物合成所需能量的供應(yīng)。趙娜等[23]采用紫色紅曲菌ZX26作試驗(yàn)菌株，以葡萄糖為碳源，牛肉膏為氮源的液態(tài)搖瓶發(fā)酵中，接種量在7%～9%(體積分?jǐn)?shù)，下同)時(shí)，有利于Monacolin K產(chǎn)量的增加；7%時(shí)，產(chǎn)量最高；大于9%時(shí)，Monacolin K產(chǎn)量開始下降。陳景智等[24]采用紅曲菌突變株作試驗(yàn)菌株，以甘油為碳源，黃豆為氮源進(jìn)行液態(tài)搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)最適的接種量為8%，培養(yǎng)12 d，Monacolin K產(chǎn)量達(dá)最大值615.3 mg/L。李玲等[25]以紫色紅曲菌M2作試驗(yàn)菌株，發(fā)現(xiàn)最適的接種量為10%，培養(yǎng)14 d產(chǎn)Monacolin K達(dá)最大值。陳曄等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以紅色紅曲菌9901為試驗(yàn)菌株，甘油作碳源，大豆水解液作氮源的液態(tài)搖瓶發(fā)酵，當(dāng)接種量為5%時(shí)，培養(yǎng)14 d，產(chǎn)Monacolin K達(dá)最大值1 600 mg/L。上述的研究表明，考慮到發(fā)酵培養(yǎng)基組成的差異，合適的接種量應(yīng)在5%～10%。

3.3.3 發(fā)酵初始pH的選擇

發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的累積有很大的影響。徐偉等[26]以紅曲菌作試驗(yàn)菌株，玉米淀粉作碳源的搖瓶液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)在偏酸性的發(fā)酵初始條件下，Monacolin K產(chǎn)量相對(duì)較高，隨著pH升高產(chǎn)量逐步下降，當(dāng)pH為4.5時(shí)，Monacolin K產(chǎn)量最高達(dá)148.00 mg/L。陳曄等[13]在紅色紅曲菌9901，培養(yǎng)基的碳源為甘油，氮源為大豆水解液的液態(tài)搖瓶發(fā)酵中，研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基最適的初始pH為4.5，產(chǎn)Monacolin K可達(dá)1 600 mg/L。研究表明，最適的培養(yǎng)基初始pH應(yīng)在4.5左右。

3.3.4 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短，由菌株所產(chǎn)目的代謝物的質(zhì)量濃度來決定，目的是盡可能縮短發(fā)酵周期，提高效益。一方面，既要盡可能完全利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，另一方面，又要盡可能發(fā)揮菌株合成代謝物的潛能。陳曄等[13]在紅色紅曲菌9901的液態(tài)搖瓶發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4～14 d，Monacolin K產(chǎn)量迅速增加，14 d后Monacolin K產(chǎn)量增加趨于平緩，第23天時(shí)較第17天略有下降。童振宇等[16]采用紫色紅曲菌WX的液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)Monacolin K在第4天開始合成，在第4～15天內(nèi)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而提高，第15天時(shí)達(dá)到最大，15 d以后Monacolin K的質(zhì)量濃度基本不變，17 d之后有所減少。徐偉等[26]以紅曲菌作試驗(yàn)菌株，玉米淀粉作碳源的搖瓶液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)紅曲菌Monacolin K的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而提高，到第14天達(dá)到最大，為156.236 mg/L。李亞莉等[27]以紅曲菌MPT13作供試菌株，甘油為碳源，黃豆粉為氮源的液態(tài)搖瓶發(fā)酵中，培養(yǎng)4～18 d時(shí)，Monacolin K增幅較大，第12天時(shí)，產(chǎn)Monacolin K最高，達(dá)到0.180 mg/mL。發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的最大值應(yīng)在12～15 d，周期應(yīng)在20 d左右，具體由菌株、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)工藝決定。

3.3.5 攪拌轉(zhuǎn)速的選擇

攪拌轉(zhuǎn)速是影響液態(tài)發(fā)酵的菌體形態(tài)和Monacolin K產(chǎn)量的一個(gè)非常重要的因素，它會(huì)影響紅曲菌菌體形態(tài)的變化，同時(shí)菌體形態(tài)的變化與紅曲菌生物量和Monacolin K產(chǎn)量又有緊密的關(guān)系。陳曄等[13]在紅色紅曲菌9901的15 L發(fā)酵罐液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)初始攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，菌球形成后逐步增加轉(zhuǎn)速，4 d后增加到300 r/min，初始通風(fēng)量1 m，逐步提高至1.6～1.8 m，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)12 d，產(chǎn)Monacolin K最高，產(chǎn)量達(dá)888.9 mg/L。徐偉等[26]研究發(fā)現(xiàn)，以紅曲菌作試驗(yàn)菌株，玉米淀粉作碳源的搖瓶液態(tài)發(fā)酵中，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，Monacolin K產(chǎn)量最高，達(dá)到157.231 mg/L。張朝暉等[28]以紫色紅曲菌作試驗(yàn)菌株，葡萄糖、甘油、可溶性淀粉為復(fù)合碳源，大豆蛋白胨為氮源的2 L罐液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)最適的攪拌轉(zhuǎn)速為120 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12 d, 產(chǎn)Monacolin K最高達(dá)48.8 mg/L。葉昌亞等[29]以紅色紅曲菌9901作試驗(yàn)菌株，甘油為碳源，大豆水解液為氮源，30 L液態(tài)發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速較低(150～350 r/min)時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中的菌球數(shù)量和菌球直徑逐漸增大，其發(fā)酵合成Monacolin K的產(chǎn)量隨著轉(zhuǎn)速的加大而逐漸增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速為350 r/min時(shí)，發(fā)酵液中菌體為均勻、較大、表面光滑的菌絲球，其生物合成Monacolin K產(chǎn)量最高，達(dá)到1 308 mg/L。當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，初始直徑為1 500 μm的菌球減小至最終大小為900 μm的菌絲球，這些分散的、較小的、表面有較長(zhǎng)菌絲的菌絲球，合成Monacolin K的產(chǎn)量較低。研究表明，攪拌轉(zhuǎn)速的大小，受多因素的制約。一般來說，搖瓶轉(zhuǎn)速在150～180 r/min為宜，合適的發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速主要與罐的容積有關(guān)系。

3.4 補(bǔ)料工藝的構(gòu)建

補(bǔ)料是提高紅曲菌產(chǎn)Monacolin K發(fā)酵水平的一種有效方式。紅曲菌液態(tài)發(fā)酵Monacolin K的合成一般在氮源消耗殆盡時(shí)才開始。現(xiàn)有技術(shù)中，發(fā)酵一般采用前3 d高溫培養(yǎng)，為菌體的增殖期；3 d后低溫培養(yǎng)，為代謝物的合成期。陳泉等[14]以紫色紅曲菌突變株MP60-6為試驗(yàn)菌株，甘油和米粉作碳源，蛋白胨作氮源的搖瓶液態(tài)發(fā)酵中，在培養(yǎng)3、4 d時(shí)添加0.1%乙酸和0.2%檸檬酸，8 d補(bǔ)加10%甘油，培養(yǎng)17 d，Monacolin K產(chǎn)量可達(dá)1 302 mg/L，為出發(fā)菌株ZH01產(chǎn)量(489.2 mg/L)的2.66倍。乙酸和檸檬酸均是紅曲菌代謝中產(chǎn)生乙酰輔酶A的直接前體物質(zhì)，根據(jù)已知的Monacolin K的合成途徑，胞內(nèi)的乙酰CoA含量是決定Monacolin K產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。甘油作為速效碳源，既可作為合成代謝物的能源物質(zhì)，又可經(jīng)紅曲菌的酶系轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蒑onacolin K的前體物質(zhì)。唐旭等[30]以紫色紅曲菌誘變株M215作試驗(yàn)菌株，以米粉或米粉與葡萄糖混合物為碳源，蛋白胨為氮源的發(fā)酵罐液態(tài)發(fā)酵中，在培養(yǎng)至第48、60、72和84 h，分別以100、200、200 和100 mL的葡萄糖和蛋白胨混合液補(bǔ)料，Monacolin K產(chǎn)量最高達(dá)79.83 mg/L，發(fā)酵時(shí)間119 h。這表明在發(fā)酵前3 d補(bǔ)充碳源與氮源，能大幅度縮短發(fā)酵時(shí)間。

3.5 Monacolin K代謝途徑控制方法的構(gòu)建

控制 Monacolin K代謝途徑應(yīng)從分子水平上著手[31]。一方面，運(yùn)用蛋白組學(xué)和基因組學(xué)等方法分析Monacolin K的代謝途徑和合成相關(guān)基因，再通過基因改造或添加能夠使相關(guān)基因抑制表達(dá)或過表達(dá)的添加物，達(dá)到控制Monacolin K合成途徑的目的[7,32]。林琳等[33]以mokE為目的基因，構(gòu)建紅曲菌mokE過表達(dá)工程菌株，通過RT-qPCR確定mokE過表達(dá)轉(zhuǎn)化子，對(duì)轉(zhuǎn)化子Monacolin K產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)利用掃描電鏡對(duì)野生株紅曲菌M1及轉(zhuǎn)化子菌絲、孢子進(jìn)行觀察。研究發(fā)現(xiàn)：其中的3株轉(zhuǎn)化子mokE表達(dá)量增加，內(nèi)酯型Monacolin K產(chǎn)量分別為2 159.7、4 177.6、3 365.7 μg/g，與野生株M1 Monacolin K產(chǎn)量(1 447.8 μg/g)相比，分別提高了49.2%、188.5%、132.5%，說明mokE過表達(dá)能提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量。掃描電鏡結(jié)果顯示，mokE過表達(dá)是通過影響紅曲菌菌絲體及孢子的生長(zhǎng)，最終影響Monacolin K的產(chǎn)生。HUANG等[34]研究發(fā)現(xiàn)，添加512 μmol/L亞油酸時(shí)，紅色紅曲霉Monacolin K的產(chǎn)量增加了135%。其機(jī)理為亞油酸通過激活cAMP-pkA途徑來上調(diào)mokA和mokH基因的轉(zhuǎn)錄水平，而mokA是Monacolin K合成途徑聚酮體合成酶的編碼基因，mokH是與紅曲霉次級(jí)代謝相關(guān)的Zn(Ⅱ)2Cys6結(jié)合蛋白的編碼基因，從而增加紅色紅曲霉Monacolin K的產(chǎn)量。從分子水平上調(diào)控紅曲菌Monacolin K 的代謝合成應(yīng)是今后研究的重點(diǎn)。

4 展望

以大米為原料，由紅曲霉發(fā)酵生成的含Monacolin K等生物活性物質(zhì)的紅曲稱為功能紅曲,按中國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)》規(guī)定，該標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)的功能紅曲為固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)的產(chǎn)品；液態(tài)發(fā)酵研制的功能紅曲尚未列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)正在制定中?，F(xiàn)階段，功能紅曲全部采用塑料三角瓶的固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)，尚未見有采用大米為原料的液態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)的相關(guān)報(bào)道。只報(bào)道在實(shí)驗(yàn)室，采用甘油為原料的15 L發(fā)酵罐的液態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)Monacolin K的含量達(dá)到888.9 mg/L，但采用甘油或含甘油成分的原料為碳源，既不符合GB 2760—2014標(biāo)準(zhǔn)，也不符合QB/T 2847—2007標(biāo)準(zhǔn)的要求。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的含量一般為液態(tài)發(fā)酵的20倍左右，采用不含甘油原料的液態(tài)發(fā)酵的Monacolin K含量一般小于30 mg/L，故如何提高采用不含甘油的原料為碳源的液態(tài)發(fā)酵的Monacolin K含量，使最終的制成品Monacolin K質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.4%，為當(dāng)前液態(tài)發(fā)酵的瓶頸，嚴(yán)重制約著功能紅曲液態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化。

4.1 菌株的誘變與篩選

在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域，微生物菌種的優(yōu)異性能來自人們持續(xù)不斷的菌種選育。因此，通過誘變篩選菌株仍是今后工作中提高M(jìn)onacolin K產(chǎn)量的重要方法。由于基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)品對(duì)人們健康的影響尚未明確，菌株的選育不推薦采用基因改造法(GMO)即轉(zhuǎn)基因法，大多仍采用誘變選育法，尤其為ARTP的誘變方式, 推薦采用紫外誘變與ARTP相結(jié)合的方式。

4.2 Monacolin K開環(huán)比例的調(diào)節(jié)

解決功能紅曲液態(tài)發(fā)酵低產(chǎn)Monacolin K問題的關(guān)鍵是降低紅曲菌胞內(nèi)代謝物的反饋抑制，這就要求對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成與控制工藝進(jìn)行深入的研究，構(gòu)建出高效表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基，力求大幅增加紅曲菌細(xì)胞膜的通透性，以利于水溶性的開環(huán)結(jié)構(gòu)的酸式Monacolin K分泌至胞外，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)Monacolin K。

4.3 補(bǔ)料工藝的突破

現(xiàn)有的技術(shù)中，以淀粉為唯一碳源的紅曲菌液態(tài)發(fā)酵中，尚未見采用補(bǔ)料工藝實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)Monacolin K的報(bào)道。一般地，不管是初級(jí)代謝還是次級(jí)代謝的發(fā)酵，補(bǔ)料工藝是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)代謝物的重要途徑，這就要求對(duì)補(bǔ)料工藝進(jìn)行深入的研究，包括在補(bǔ)料配方、補(bǔ)料方式、補(bǔ)料時(shí)間方面摸索出成熟的工藝，特別是如何激活聚酮體合成酶活性的物質(zhì)的添加，并采用特別有效的遲效碳源，既可保證經(jīng)紅曲菌酶系轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蒑onacolin K前體的碳源供應(yīng)，又不會(huì)形成葡萄糖的阻遏效應(yīng)，同時(shí)又能保證合成代謝物的能源的供應(yīng)，繼而增強(qiáng)發(fā)酵的后勁，從而突破紅曲菌液態(tài)發(fā)酵低產(chǎn)Monacolin K的技術(shù)瓶頸。

4.4 桔霉素含量的調(diào)控

控制發(fā)酵代謝物中桔霉素含量，可從以下方面入手：一方面，可通過基因調(diào)控手段，敲除產(chǎn)桔霉素的基因，篩選出不產(chǎn)桔霉素的菌株；另一方面，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加某種抑制紅曲菌產(chǎn)桔霉素的物質(zhì)，大幅降低代謝物中的桔霉素的含量，使代謝物中桔霉素的含量符合國(guó)家的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。HUANG等[35]在橙黃色紅曲菌的液態(tài)發(fā)酵中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入黃酮類物質(zhì)，如蘆丁、α-葡萄糖基蘆丁或曲克蘆丁進(jìn)行培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，上述黃酮類物質(zhì)的添加對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響較小，然而與對(duì)照組培養(yǎng)基相比，桔霉素的濃度均有不同程度的降低。添加蘆丁可以在一定程度上抑制桔霉素的產(chǎn)量，但不能大幅抑制桔霉素的產(chǎn)生；加入α-葡萄糖基蘆丁或曲克蘆丁后，橙黃色紅曲菌產(chǎn)桔霉素的能力明顯下降，相關(guān)的機(jī)理正在研究中。

4.5 政策法規(guī)的完善

紅曲菌作為食藥兩用的安全菌株，具有悠久的使用歷史，其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品早已被廣泛接受，安全可靠。眾所周知，液態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)方式有著固態(tài)發(fā)酵無可比擬的優(yōu)勢(shì)，尤其為功能紅曲的液態(tài)發(fā)酵，其產(chǎn)品在純度、水溶性、開環(huán)活性物質(zhì)的比例、風(fēng)味性、應(yīng)用范圍等方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)，建議國(guó)家相關(guān)職能部門，盡快把紅曲菌液態(tài)發(fā)酵的代謝物納入等同固態(tài)發(fā)酵的代謝物的相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，以利于紅曲菌液態(tài)發(fā)酵的代謝物盡快產(chǎn)業(yè)化，惠及社會(huì)。