胡磊，謝慶超,2，劉會(huì)，劉海泉,2,3*，趙勇,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

膽固醇是人體或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的甾醇類脂，屬于環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，也是膽汁酸、固醇激素和維生素D產(chǎn)生的重要前體[1-2]。在一定水平上，膽固醇對(duì)人體十分有益，但高膽固醇血癥與許多疾病有關(guān)。膽固醇在人體內(nèi)的流動(dòng)運(yùn)輸主要是基于與血液中低密度脂蛋白的結(jié)合，過(guò)量的膽固醇會(huì)沉積在動(dòng)脈中，促進(jìn)斑塊的形成，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。血液中膽固醇超過(guò)200 mg/dL，有患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

近年來(lái)，隨著人口老齡化的加速，心血管類的疾病已成為威脅人體健康的重要因素，人體攝入過(guò)多膽固醇引起疾病的風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。因此，除了適量減少對(duì)高膽固醇食物的攝入，及時(shí)有效地對(duì)食品中的膽固醇進(jìn)行檢測(cè)與脫除具有重要的意義。本文綜述了食品中膽固醇的檢測(cè)技術(shù)，包括比色法、酶-熒光法、色譜法、近紅外光譜法和電化學(xué)法，以及食品中膽固醇脫除的物理(蒸餾法、吸附法和超臨界流體萃取法)、化學(xué)(沉淀法和微膠囊包合法)、生物(微生物法和酶法)技術(shù)，討論了食品中常見(jiàn)的檢測(cè)與脫除技術(shù)的特點(diǎn)、原理和應(yīng)用，并對(duì)未來(lái)食品中膽固醇檢測(cè)與脫除技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望。

1 食品中膽固醇的檢測(cè)技術(shù)

目前食品中膽固醇的檢測(cè)與定量分析一直在改進(jìn)完善中，膽固醇的檢測(cè)技術(shù)主要有比色法、酶-熒光法、色譜法、近紅外光譜法和電化學(xué)法。

1.1 比色法

比色法是以顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)比較或測(cè)定有色物質(zhì)濃度來(lái)間接確定待定組分含量的方法。樣品中脂肪提取后，經(jīng)乙醇-KOH皂化，用正己烷萃取，濃縮后加入乙酸酐，以NH4Fe(SO4)2為顯色劑，用分光光度計(jì)進(jìn)行膽固醇的定量。張曉儒[4]比較了比色法和氣相色譜法對(duì)內(nèi)蒙古家畜肉中膽固醇含量的測(cè)定，結(jié)果表明比色法測(cè)定樣品中膽固醇的含量較氣相色譜法高4.74%。利用傳統(tǒng)的化學(xué)比色法測(cè)定食品中膽固醇時(shí)，食品中某些脂類也會(huì)與顯色劑發(fā)生反應(yīng)造成定量誤差，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏大。馬麗娜等[5]建立了一種快速測(cè)定禽蛋中膽固醇的酶比色法，膽固醇通過(guò)酶水解生成膽甾-4-烯-3-酮和H2O2，H2O2經(jīng)過(guò)氧化物酶作用在4-氨基安替比林及苯酚參與下, 生成紅色醌亞胺，并在波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定樣品吸光度，確定顯色時(shí)間15 min，顯色溫度37 ℃的最優(yōu)條件下，膽固醇的檢出限為1.0 mg/100 g。將納米技術(shù)與傳統(tǒng)的化學(xué)比色法相結(jié)合，基于銅納米團(tuán)簇的過(guò)氧化酶活性，膽固醇被催化氧化產(chǎn)生H2O2，以愈創(chuàng)木酚作為顯色底物, 利用銅納米團(tuán)簇的納米探針比色來(lái)定量牛奶中的膽固醇，檢出限為5 μg/mL[6]。

傳統(tǒng)的化學(xué)比色法方法重現(xiàn)性良好，但操作復(fù)雜，樣品的前處理和脂肪的提取消耗時(shí)間長(zhǎng)，溶劑消耗量大，有一定的測(cè)定誤差；酶比色法無(wú)需使用有毒試劑，操作步驟簡(jiǎn)單，但需要對(duì)顯色時(shí)間和顯色溫度進(jìn)行優(yōu)化；納米探針比色法簡(jiǎn)單快速，抗干擾性強(qiáng)，但納米團(tuán)簇的合成與表征比較耗時(shí)。傳統(tǒng)的化學(xué)比色法已經(jīng)不適合食品中膽固醇的精準(zhǔn)定量，酶比色法和納米探針比色法很好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)一些食品膽固醇的檢測(cè)分析[5-6]。目前這些新型的比色法多應(yīng)用于血清中膽固醇的快速檢測(cè)[7]，受限于食品基質(zhì)的復(fù)雜性，在食品中的應(yīng)用并不廣泛。

1.2 酶-熒光法

利用膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase, ChOx)來(lái)測(cè)定食品中總膽固醇的含量是基于酶偶聯(lián)反應(yīng)。20世紀(jì)70年代后，利用ChOx反應(yīng)間接定量膽固醇已得到廣泛應(yīng)用[8]。如圖1所示，膽固醇被ChOx氧化成4膽甾烯-3-酮，副產(chǎn)物H2O2極易被高靈敏的熒光探針檢測(cè)。10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪能在辣根過(guò)氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的催化作用下形成H2O2存在下的熒光產(chǎn)物9-羥基-3-異吩噁嗪酮而被用作膽固醇的測(cè)定[9]。此外，酪胺能夠作為氧化物酶的理想供氫熒光底物，利用ChOx反應(yīng)間接定量膽固醇。

圖1 酶-熒光法的酶偶聯(lián)反應(yīng)示意圖Fig.1 The scheme of the enzyme-coupled reaction of fluorometric enzymatic assay

王令臣等[10]利用H2O2在氯化血紅素催化下氧化酪胺產(chǎn)生熒光，通過(guò)計(jì)算H2O2的量間接定量膽固醇，確定了ChOx含量28 mU/mL。氯化血紅素濃度0.1 mmol/L。酪胺濃度0.7 mmol/L。反應(yīng)時(shí)間15 min的最優(yōu)條件，此時(shí)檢測(cè)限為0.08 μmol/L，并將其應(yīng)用于牛奶中膽固醇的加標(biāo)檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.1%，回收率高達(dá)98.7%～112.7%。LARSEN[11]利用酶-熒光法測(cè)定出牛乳中的膽固醇含量為80～756 μmol/L，其原理也是膽固醇氧化分解后產(chǎn)生H2O2，H2O2在過(guò)氧化物酶的影響下與非熒光物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生等量的熒光物質(zhì)。

然而，酶-熒光法對(duì)膽固醇的測(cè)定不具有嚴(yán)格的選擇性。ChOx也可能與其他固醇發(fā)生反應(yīng)[12]。此外，樣品中存在的一些化學(xué)物質(zhì)(如抗壞血酸和膽紅素)可能消耗H2O2，在間接測(cè)定膽固醇時(shí)發(fā)生定量誤差。

1.3 色譜法

1.3.1 氣相色譜法

氣相色譜法(gas chromatography，GC)因選擇性高，分離效果好，操作簡(jiǎn)單而用于食品中膽固醇的檢測(cè)。陳月曉等[13]采用GC測(cè)定植物油中的膽固醇，該法可使植物油中的膽固醇與各類甾醇有效分離。以5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo)參照物，測(cè)得玉米油中的膽固醇含量為4.54 mg/100 g，檢出限和定量限低，分別為0.3和1.0 mg/100 g。GC測(cè)定食品中的膽固醇時(shí)，為提高分析的精準(zhǔn)度，消除實(shí)驗(yàn)引起的誤差，常采用內(nèi)標(biāo)法，5α-膽甾烷為常用的內(nèi)標(biāo)參照物。衍生化的處理方式也會(huì)提高GC測(cè)定的準(zhǔn)確度，通過(guò)GC結(jié)合火焰離子化檢測(cè)器分析衍生化物-三甲基甲硅烷基醚來(lái)定量膽固醇。該法已被用于母乳中膽固醇的檢測(cè)分析，與傳統(tǒng)采用KOH與甲醇混合液進(jìn)行皂化相比，運(yùn)用脂肪酶對(duì)樣品酶解，采用K2CO3-乙醇皂化法效果更好，所耗時(shí)間更少[14]。

GC的選擇性與分離性也是相對(duì)的，當(dāng)樣品中含有的雜質(zhì)較多，分離效果變差時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的誤差也難以有效控制。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜法

質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為食品科學(xué)分離學(xué)科中最受歡迎的檢測(cè)技術(shù)之一。相較于GC，氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)更能準(zhǔn)確地分離并定量動(dòng)物源食品的膽固醇，且定量更準(zhǔn)確，誤差更小[15]。目前， GC-MS檢測(cè)食品中膽固醇的技術(shù)日趨完善。CHEN等[16]建立了一種不經(jīng)衍生化的GC-MS，測(cè)定普通植物油、雞蛋和奶粉中的膽固醇。樣品用7.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH的乙醇進(jìn)行皂化，(正己烷)∶(石油醚)=1∶1萃取，四氫呋喃定容，該法定量限為2 mg/kg，加標(biāo)回收率在91%～100%。陳樹(shù)東等[17]開(kāi)發(fā)了一種基于固相萃取作為預(yù)處理方式的GC-MS，用來(lái)測(cè)定植物油中的膽固醇。該法采用Florisil固相萃取柱萃取，無(wú)須皂化和衍生化，其中膽固醇的檢出限為0.2 mg/kg，回收率為84.5%～105.0%，適用于油類的膽固醇測(cè)定。

隨著前處理?xiàng)l件的不斷優(yōu)化，食品中膽固醇的檢測(cè)時(shí)間也在不斷縮短。但GC-MS測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)受到食品基質(zhì)的干擾。與GC相似，利用GC-MS測(cè)定食品中的膽固醇，采用內(nèi)標(biāo)法能使基質(zhì)效應(yīng)的影響降到最低。高靈敏度、高精密度、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)使GC-MS成為食品中膽固醇檢測(cè)的主流技術(shù)之一。

1.3.3 高效液相色譜法

基于從非皂化物中分離膽固醇的測(cè)定目的，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)逐漸被應(yīng)用到食品中膽固醇含量的測(cè)定。

食品中膽固醇測(cè)定的HPLC選擇極性有機(jī)溶劑乙腈與甲醇、乙醇或異丙醇作為混合流動(dòng)相，采用硅膠與辛基(C8)或十八烷基(C18)的合相為固定相。DANESHFAR等[18]提出了一種基于分散液-液微萃取的快速、簡(jiǎn)便、靈敏的樣品制備方法，利用 HPLC測(cè)定食品中的膽固醇,檢出限和定量限分別為0.01 μg/L和0.03 μg/L, 并用于牛奶、蛋黃中的膽固醇分析。張曉林等[19]針對(duì)動(dòng)物源食品中含有大量的甾醇和脂肪的特點(diǎn)，建立了加速溶劑萃取-凝膠色譜凈化的HPLC，通過(guò)凝膠色譜凈化，排除了甾醇和脂肪等雜質(zhì)的干擾。測(cè)定結(jié)果表明，膽固醇濃度在1.0～40.0 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～7.8%，對(duì)于富含脂類的動(dòng)物源食品有較好的檢測(cè)效果。

相比于傳統(tǒng)的HPLC，超高效液相色譜法(ultra high performance liquid chromatography，UHPLC)能夠有效地減少有機(jī)溶劑的消耗、縮短分析時(shí)間，且分離效果更好。ALBUQUERQUE等[20]研究發(fā)現(xiàn)，相較于HPLC，簡(jiǎn)單、可靠、經(jīng)濟(jì)和快速的UHPLC對(duì)于動(dòng)物源食品基質(zhì)中膽固醇含量的質(zhì)量控制更好，并易于被分析實(shí)驗(yàn)室采用。

色譜法因具有高選擇性、低檢出限和高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，將長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)室中食品膽固醇的定量分析。

1.4 近紅外光譜法

近紅外光譜技術(shù)作為一種準(zhǔn)確、快速和無(wú)損的質(zhì)量分析技術(shù)，近年來(lái)發(fā)展迅速。目前近紅外光譜技術(shù)已普遍運(yùn)用到肉與肉制品的感官品質(zhì)及理化指標(biāo)的分析檢測(cè)中[21-22]，但在食品中膽固醇檢測(cè)方面的研究較為有限。早期用于膽固醇定量的近紅外光譜技術(shù)是基于對(duì)樣品中的膽固醇的化學(xué)提取，但沒(méi)有達(dá)到省時(shí)的目的。通過(guò)將近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量相結(jié)合，以偏最小二乘法(partial least-squares，PLS)為基礎(chǔ)，分析模型的構(gòu)建，快速定量食品中的膽固醇。研究發(fā)現(xiàn)，中波近紅外光譜技術(shù)在60～100 mg/100 g和50～70 mg/100 g區(qū)間定量分析生鮮雞肉和牛肉中膽固醇的效果最好，其適用于生鮮雞肉和牛肉中膽固醇的定量分析[23-24]。CHITRA等[25]利用傅里葉變換近紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)構(gòu)建的二階導(dǎo)數(shù)PLS模型，具有最佳性能指標(biāo)。測(cè)得不同奶粉中膽固醇的含量在61.40～235.22 mg/100 g，交叉驗(yàn)證的均方根誤差只有 1.05 mg/100 g。應(yīng)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與近紅外光譜技術(shù)結(jié)合也可定量膽固醇，已開(kāi)發(fā)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可通過(guò)紫外可見(jiàn)-近紅外光譜來(lái)區(qū)分低、中、高膽固醇值[26]。

近紅外光譜技術(shù)可用于肉類、奶粉中膽固醇的定量。近紅外光譜技術(shù)往往與化學(xué)計(jì)量或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相結(jié)合，在相應(yīng)的濃度區(qū)間對(duì)膽固醇準(zhǔn)確定量。該技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是快速無(wú)損，綠色環(huán)保。因此，通過(guò)定量模型的構(gòu)建與優(yōu)化，未來(lái)近紅外光譜技術(shù)在食品中膽固醇的定量仍可作為一種常規(guī)方式。

1.5 電化學(xué)法

電化學(xué)法具有高選擇性、易制樣、儀器成本低、簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，是膽固醇檢測(cè)的常用方式。其中酶?jìng)鞲衅鞯膽?yīng)用由來(lái)已久。目前，大多數(shù)利用酶?jìng)鞲衅鲗?duì)膽固醇測(cè)定是基于固定在導(dǎo)電聚合物、金屬及其氧化物納米材料、碳納米材料和復(fù)合型納米材料等電極表面的ChOx的氧化反應(yīng)，通過(guò)H2O2還原或氧化電流來(lái)間接定量膽固醇[27]。XIA等[28]開(kāi)發(fā)了一種ChOx傳感器，通過(guò)加入氧化還原介質(zhì)[Fe(CN)63-]促進(jìn)膽固醇氧化過(guò)程中從分析物到修飾電極的方法，檢出限低至0.11 nmol/L。相較于酶電化學(xué)法，非酶?jìng)鞲衅黠@示出獨(dú)特的優(yōu)越性。DERINA等[29]報(bào)道了一種基于1，4-二乙?；孰宥⑺嶙鳛殡姌O表面修飾劑的新型非酶?jìng)鞲衅鳎憩F(xiàn)出高穩(wěn)定性和高靈敏度，膽固醇能在修飾的碳基電極上獲得穩(wěn)定的陽(yáng)極響應(yīng)，測(cè)得牛奶中膽固醇含量在15～25 mg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.6。WILLYAM等[30]制備了一種靈敏、特異和小型化的非酶膽固醇傳感器，如圖2所示，通過(guò)利用β-環(huán)糊精與含不同濃度膽固醇溶液之間反應(yīng)釋放的甲基藍(lán)電化學(xué)測(cè)量結(jié)果作輸入信號(hào)間接計(jì)算膽固醇濃度，可以在0～150 μmol/L的濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的線性關(guān)系、出色的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性，檢出限為 2.88 μmol/L。

圖2 利用β-環(huán)糊精的非酶電化學(xué)膽固醇檢測(cè)機(jī)制Fig.2 Non-enzymatic electrochemical cholesterol detection mechanism using β-cyclodextrin

電化學(xué)酶?jìng)鞲衅髟谥苽溥^(guò)程中，固載材料和固定方法選擇尤為重要，這直接影響到傳感器的性能。與酶?jìng)鞲衅飨嗨?，非酶?jìng)鞲衅鞯闹苽湟彩忠蕾囯姌O表面修飾材料的選擇。目前利用電化學(xué)法主要通過(guò)收集電信號(hào)的形式來(lái)間接測(cè)定膽固醇的含量，多應(yīng)用于人體的血清[31]，由于食品天然基質(zhì)的復(fù)雜性，電化學(xué)法在食品中膽固醇的定量檢測(cè)實(shí)踐不多。

迄今為止，比色法、酶-熒光法、色譜法、近紅外光譜法和電化學(xué)法都在食品膽固醇的檢測(cè)分析方面有所應(yīng)用，表1列出了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 食品中膽固醇檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Adantages and disadantages of cholesterol detection techniques in food

傳統(tǒng)比色法作為最經(jīng)典的食品中膽固醇定量方法一直被沿用，但存在測(cè)定誤差，酶比色法和納米探針比色法逐漸被應(yīng)用于膽固醇的定量。酶-熒光法雖適用于膽固醇的常規(guī)分析，但因食品基質(zhì)的復(fù)雜性，酶-熒光法對(duì)膽固醇的測(cè)定選擇性較差。色譜法具有選擇性高，分離效果好，分析所需樣品較少的特點(diǎn)，但色譜技術(shù)的性能更依賴于樣品制備，如皂化、萃取和濃縮。近紅外光譜法在食品中膽固醇的檢測(cè)應(yīng)用較少，對(duì)于定量模型的選擇更為重要。電化學(xué)法最主要的特點(diǎn)在于簡(jiǎn)便快速，但酶電化學(xué)法穩(wěn)定性低，溫度和酸堿度等因素會(huì)影響實(shí)際工作中酶?jìng)鞲衅鞯男阅?，而非酶?jìng)鞲衅鞯闹饕魬?zhàn)是化學(xué)修飾電極選擇性。

2 食品中膽固醇的脫除技術(shù)

目前食品中膽固醇的脫除方法包括物理法(蒸餾法、吸附法和超臨界流體萃取法)、化學(xué)法(沉淀法和微膠囊包合法)、生物法(微生物法和酶法)。

2.1 物理法

2.1.1 蒸餾法

目前食品中膽固醇的脫除方法包括蒸汽蒸餾法和分子蒸餾法。BOUDREAU等[32]利用真空蒸汽蒸餾實(shí)現(xiàn)乳脂中膽固醇的分離，在真空環(huán)境中，蒸汽通過(guò)鼓泡的形式穿過(guò)液態(tài)乳脂，可去除乳脂中93%的游離膽固醇。此法對(duì)乳脂中膽固醇的脫除率很高，但實(shí)際應(yīng)用成本較高。分子蒸餾法的原理是在合理控制壓強(qiáng)和溫度的情況下，使膽固醇從蒸發(fā)液體的熱表面轉(zhuǎn)移到冷凝器的冷表面，此法要考慮到食品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的揮發(fā)和膽固醇氧化的問(wèn)題。BERTI等[33]通過(guò)分子蒸餾技術(shù)分離乳脂中的膽固醇，并分析處理前后的乳脂感官特性，該法可除去約60%的膽固醇，可用于乳脂中膽固醇的脫除。

采用蒸餾法會(huì)導(dǎo)致食品中其他揮發(fā)性成分的損失。因此，如何有效地回收這些揮發(fā)性成分是蒸餾法脫除膽固醇亟待解決的問(wèn)題。

2.1.2 吸附法

吸附法是利用物理吸附作用，對(duì)食品中的膽固醇進(jìn)行脫除。朱林韜等[34]分析比較了6種不同的吸附劑對(duì)蠶蛹油中膽固醇的脫除效果，其中中性Al2O3的效果最明顯，膽固醇的脫除率達(dá)到(38.24±2.92)%。馮艷平等[35]利用活性白土吸附魚(yú)油中的膽固醇，在190 ℃，真空條件下吸附45 min，魚(yú)油中膽固醇的脫除率達(dá)到72.89%。YILMAZ等[36]利用金屬有機(jī)骨架對(duì)黃油和羊脂中的膽固醇進(jìn)行脫除，含金屬的單元與具有永久孔隙率結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子或晶體框架結(jié)合，鋁-金屬有機(jī)骨架和鈦-金屬有機(jī)骨架的降膽固醇率分別為27.45%和26.28%，不會(huì)對(duì)原樣品造成危害。

近年來(lái)，分子印跡聚合物逐漸地應(yīng)用于食品中膽固醇的脫除。KARTAL等[37]開(kāi)發(fā)了從牛奶樣品中分離膽固醇分子印跡的低溫凝膠珠，具有特定的膽固醇結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)吸附牛奶中的膽固醇達(dá)到膽固醇脫除的目的，脫除率高達(dá)60%，回收率為94.3～100.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0～5.2%。這表明利用分子印跡低溫凝膠珠吸附牛奶中的膽固醇能達(dá)到很好的效果。使用這些吸附材料進(jìn)行吸附作用時(shí)，要同時(shí)顧及吸附材料對(duì)食品造成的安全性問(wèn)題。如何減少甚至消除吸附性殘留的危害，開(kāi)發(fā)更綠色環(huán)保的吸附材料是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向。

2.1.3 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取因良好的萃取效果廣泛用于規(guī)?；a(chǎn)中。如圖3所示，利用超臨界CO2萃取法能特定進(jìn)行膽固醇的分離，并實(shí)現(xiàn)CO2的循環(huán)利用。同時(shí)合理地改變壓力或溫度能提高超臨界流體的溶解能力，使得從更加復(fù)雜的化合物中分離膽固醇成為可能[38]。

圖3 超臨界CO2萃取膽固醇流程圖Fig.3 Flow chart of supercritical CO2 extraction of cholesterol

CHITRA等[39]研究了超臨界CO2萃取對(duì)于全脂奶粉中的膽固醇脫除的影響，確定在68 ℃，20.7 MPa的條件下，靜態(tài)時(shí)間40 min，動(dòng)態(tài)時(shí)間2 h，流速6 L/min時(shí)，膽固醇降低約55.8%，且全脂奶粉中的有益成分不會(huì)減少。有研究表明，相較于超臨界CO2，對(duì)于某些卵粉的膽固醇溶解性在超臨界四氟乙烷中要好[40]。DEY PAUL等[41]采用乙醇作為共溶劑的超臨界CO2從全脂奶粉中提取膽固醇，采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，在48 ℃、17 MPa和31 mL共溶劑的優(yōu)化條件下，膽固醇降低了約46%。同時(shí)全脂奶粉的脂肪含量、溶解指數(shù)和透光率限值分別為183.67 g/kg、96.3%和96.90%，對(duì)理化性質(zhì)變化影響不大。

超臨界流體萃取法可對(duì)特定食品中的膽固醇進(jìn)行脫除，通過(guò)優(yōu)化調(diào)節(jié)超臨界流體的溫度、壓力、密度和流量等參數(shù)，能不斷提高膽固醇的脫除率。

2.2 化學(xué)法

2.2.1 沉淀法

研究表明，植物中的皂苷可脫除奶油中膽固醇[42]。皂苷可以與膽固醇相互作用，形成膽固醇-皂苷復(fù)合物。65 ℃混合1 h后，通過(guò)硅藻土過(guò)濾并洗滌可使奶油中的膽固醇減少80%，且不會(huì)對(duì)奶油產(chǎn)生不良影響。海星中也存在有膽固醇結(jié)合能力的皂苷，最高結(jié)合膽固醇達(dá)33%，對(duì)食品中的膽固醇的脫除有著重要意義[43]。RAJU等[44]研究了在不同條件下，利用皂苷和硅藻土聯(lián)合去除凡納濱對(duì)蝦頭胸部脂質(zhì)中的膽固醇，在脂質(zhì)與皂苷質(zhì)量比1∶6并混合20倍體積50%乙醇的條件下，膽固醇去除率達(dá)到(88.77±0.18)%。

沉淀法所用的天然皂苷可以從人參或者文冠果葉中提取得到[45]，其易與膽固醇結(jié)合，具有良好的降膽固醇的功效，優(yōu)化皂苷的提取與尋找有效天然的沉淀材料將有助于這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。

2.2.2 微膠囊包合法

微膠囊包合法的原理是某些具有膽固醇選擇性的高分子化合物與膽固醇相結(jié)合，形成穩(wěn)定的包合復(fù)合物，利用特定的分離技術(shù)，將復(fù)合物從原有的食品體系中分離出來(lái)。

目前應(yīng)用最多的微膠囊是β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)，利用β-CD對(duì)膽固醇的包合作用進(jìn)行膽固醇脫除的應(yīng)用十分廣泛。β-CD是由β-1, 4-糖苷鍵連接的截錐晶形結(jié)構(gòu)的環(huán)狀寡糖，對(duì)膽固醇等非極性分子有親和力，因此β-CD可以與膽固醇形成非共價(jià)的主客體包合物。β-CD無(wú)毒、不吸濕、具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和可食用性[46]。劉琳等[47]利用β-CD對(duì)牛油中膽固醇的脫除工藝進(jìn)行了優(yōu)化，膽固醇脫除率可達(dá)到(47±1.83)%，且對(duì)牛油感官品質(zhì)的影響較小。JIA等[48]開(kāi)發(fā)合成了一種基于玉米蛋白與β-CD為主體的玉米蛋白-接枝-β-CD薄膜(圖4)。這種薄膜有良好的膽固醇吸附能力，最大吸附量達(dá)(5.70±0.56)mg/g，在3次重復(fù)使用后仍然保持(3.10±0.89)mg/g的吸附能力，采用蛋白酶與淀粉酶混合形成的復(fù)合酶1周內(nèi)降解率達(dá)到98.81%。在未來(lái)的食品工業(yè)中，基于β-CD作為吸附劑對(duì)食品中膽固醇脫除的良好效果，以β-CD為主體與某些化合物結(jié)合使用將是食品中膽固醇脫除的重要發(fā)展方向。

a-薄膜的合成;b-薄膜吸附膽固醇與酶降解圖4 玉米蛋白-接枝-β-CD薄膜的合成、吸附膽固醇的過(guò)程與酶降解[48]Fig.4 Synthesis, adsorption of cholesterol and enzyme degradation of zein-graft-β-CD film[48]

2.3 生物法

2.3.1 微生物法

研究表明，許多微生物都具有轉(zhuǎn)化降解膽固醇的能力，如乳桿菌屬[49-50]、雙歧桿菌屬[51]等。乳酸菌降解膽固醇主要機(jī)制的爭(zhēng)論在于乳酸菌對(duì)膽固醇的共沉淀作用與吸收作用。酵母菌主要通過(guò)產(chǎn)生的膽鹽水解酶與膽固醇的共沉淀作用以及酵母菌細(xì)胞壁上的膳食纖維對(duì)膽固醇進(jìn)行吸收。郭晶晶等[49]從天然發(fā)酵豆醬樣品中篩選出的3株乳酸菌對(duì)膽固醇的降解率分別為34.56%、27.12%和29.20%。王成濤等[52]利用篩選出的紅球菌和短桿菌脫除2種鮮肉糜中膽固醇，脫除率分別為40.5%和41.3%，并將其產(chǎn)生的粗酶液應(yīng)用于實(shí)際香腸制作中，降膽固醇效果明顯，食品風(fēng)味保持良好。

用于食品中膽固醇脫除的微生物最好是從同類型食品中篩選出來(lái)，并且盡可能避免對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)與感官品質(zhì)造成影響。盡管如此，考慮到微生物的來(lái)源與種類不同，微生物本身的代謝活動(dòng)也會(huì)影響膽固醇的降解，微生物對(duì)膽固醇的降解均建立在實(shí)驗(yàn)研究的角度，在實(shí)際中微生物脫除食品中膽固醇應(yīng)用并不廣泛。

2.3.2 酶法

相比于直接利用微生物降解膽固醇，多數(shù)研究更傾向于將微生物產(chǎn)生的酶進(jìn)行分離純化再直接作用于膽固醇的降解。KHIRALLA等[53]從羊肉中篩選出14種乳酸菌，從中分離純化的ChOx能對(duì)肉湯中90%的膽固醇進(jìn)行降解。JITPAKDEE等[54]將從發(fā)酵食品中篩選出的2種乳酸菌共同培養(yǎng)，產(chǎn)出的ChOx能有效地降低牛奶中的膽固醇(10.98±3.80)%。除了膽固醇氧化物酶，從細(xì)菌和植物葉子中能夠提取的膽固醇還原酶，可將牛奶、奶油、碎牛肉和豬肉中的膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾烷醇，達(dá)到膽固醇脫除的作用。

目前利用微生物降解能力對(duì)食品中膽固醇的脫除沒(méi)有在食品商業(yè)運(yùn)作中得到推廣。從微生物中分離出ChOx的方法早已經(jīng)建立，膽固醇還原酶也可通過(guò)分離純化得到，但基于膽固醇氧化與還原產(chǎn)物的安全性問(wèn)題始終沒(méi)有定論。目前研究者們也在積極尋找具有膽固醇降解能力的微生物及相關(guān)酶。

不同食品中膽固醇的脫除技術(shù)都有優(yōu)勢(shì)和局限性(表2)。物理法中的蒸餾法和化學(xué)法脫除率高，但會(huì)造成食品中部分成分的損失；超臨界流體萃取法和微膠囊包合法適合工業(yè)化生產(chǎn)；生物法還處于實(shí)驗(yàn)研究階段。目前大多數(shù)膽固醇脫除技術(shù)更適用于液體類的食品，如油脂、牛奶、奶油，蛋黃等，固體類食品中膽固醇脫除的技術(shù)并不成熟。從實(shí)際食品加工來(lái)看，低膽固醇食品的開(kāi)發(fā)和膽固醇的脫除需要有配套的技術(shù)。目前，保持食品原有風(fēng)味是膽固醇脫除所面臨的挑戰(zhàn)。

表2 食品中膽固醇脫除技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Adantages and disadantages of cholesterol remoal techniques in food

3 總結(jié)與展望

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)的要求也逐漸提高，低膽固醇食品的開(kāi)發(fā)有著十分廣闊的發(fā)展前景，因此對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新是適應(yīng)未來(lái)發(fā)展的必由之路。本文系統(tǒng)地闡述了食品中膽固醇的檢測(cè)及脫除技術(shù)的應(yīng)用，總結(jié)了各種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和局限性。

傳統(tǒng)比色法的測(cè)定誤差較大，不適合膽固醇的精準(zhǔn)定量，新型比色法與酶熒光法均利用膽固醇水解酶產(chǎn)生H2O2來(lái)間接定量膽固醇，多應(yīng)用于血清、牛奶等液體樣品中膽固醇的檢測(cè)。由于食物天然基質(zhì)的復(fù)雜性，近紅外光譜法和電化學(xué)法測(cè)定食品中的膽固醇的應(yīng)用有限。色譜法因具有選擇性高、分離效果好、分析所需樣品較少的特點(diǎn)，是目前食品中膽固醇檢測(cè)最主流的方法。色譜法應(yīng)用廣泛，不僅可以定量牛奶、動(dòng)物油以及蛋黃液等液體樣品中的膽固醇，各類動(dòng)物組織肉、水產(chǎn)品中的膽固醇都可采用色譜法進(jìn)行分離定量。針對(duì)未來(lái)食品中膽固醇的檢測(cè)，色譜法仍是最受歡迎的檢測(cè)技術(shù)，尤其是GC-MS和HPLC。建立一套針對(duì)不同類型食品的檢測(cè)體系勢(shì)在必行，可以更加快速、準(zhǔn)確地對(duì)食品中的膽固醇進(jìn)行檢測(cè)定量。

特定食品中膽固醇脫除符合未來(lái)人們對(duì)食品安全的要求。從目前脫除技術(shù)的特點(diǎn)來(lái)看，微膠囊包合法和超臨界流體萃取法可大規(guī)模應(yīng)用于商業(yè)性膽固醇的脫除。以β-CD為主的微膠囊包合法和以CO2為主的超臨界流體萃取法可使鮮奶、稀奶油、蛋黃液中膽固醇得以脫除，為生產(chǎn)低膽固醇奶、低膽固醇奶油(奶油粉)以及低膽固醇蛋黃粉奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。β-CD法的應(yīng)用也為我國(guó)乳制品的生產(chǎn)提出了新的方向，而超臨界CO2流體萃取法也成為乳制品中膽固醇脫除的重要手段，可以通過(guò)研究超臨界流體萃取法的工業(yè)化工藝降低其對(duì)試劑的限制。目前研究者們也在積極尋找能提取出具有膽固醇降解能力的微生物及相關(guān)酶，這必然會(huì)推動(dòng)這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。未來(lái)可通過(guò)多種膽固醇脫除技術(shù)的結(jié)合，構(gòu)建高效、綠色、經(jīng)濟(jì)和保質(zhì)的聯(lián)合脫除技術(shù)，以滿足實(shí)際食品生產(chǎn)的需要。