薛意斌， 李 雪， 李延嘯， 江正強(qiáng)， 閆巧娟，*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院， 北京 100083)

蛋白酶(EC 3.4.11-24)是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶的統(tǒng)稱。作為三大工業(yè)酶之一，蛋白酯的銷售約占全球酶制劑銷售額的60%，預(yù)計(jì)到2026年將接近87億元[1]。蛋白酶普遍存在于植物、動(dòng)物以及微生物中，其中微生物具有生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單以及遺傳操作方便等特性，是蛋白酶的重要來(lái)源[2]。根據(jù)底物作用機(jī)制及活性中心組成不同，酸性蛋白酶大多屬于天冬氨酸蛋白酶，主要微生物來(lái)源是霉菌和酵母。近年來(lái)，已有許多研究報(bào)道了真菌來(lái)源的天冬氨酸蛋白酶，主要分為類胃蛋白酶和類凝乳酶。類胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶主要來(lái)自曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderm)和青霉(Penicillium)等[3]；而類凝乳酶型天冬氨酸蛋白酶主要來(lái)自毛霉(Mucor)、根霉(Rhizopus)和內(nèi)座殼菌(Endothia)等[4]。

隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白酶基因的克隆和表達(dá)已成為發(fā)掘蛋白酶的一種有效途徑。當(dāng)前用于蛋白酶的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)等[5]。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)因蛋白翻譯后加工機(jī)制比較完善、雜蛋白分泌較少、培養(yǎng)成本低、發(fā)酵工藝成熟、易于純化等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前最成熟的蛋白酶真核表達(dá)系統(tǒng)[6]。迄今已有多種蛋白酶在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。Shu等[7]將科寧木霉絲氨酸堿性蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)，高密度發(fā)酵后測(cè)得酶活力為15 900 U·mL-1。Ke等[8]將米曲霉中性蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)，高密度發(fā)酵后測(cè)得酶活力高達(dá)43 101 U·mL-1。Takenaka等[9]將匍匐曲霉天冬氨酸蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)，搖瓶發(fā)酵后測(cè)得蛋白酶活力僅為1.4 U·mL-1。邱重晏等[10]將粗糙脈孢菌酸性蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)，搖瓶發(fā)酵后測(cè)得蛋白酶活力為6.8 U·mL-1。Guo等[11-12]分別將籃狀菌和青霉菌天冬氨酸蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)，搖瓶發(fā)酵后測(cè)得蛋白酶活力分別為67.8 U·mL-1和89.3 U·mL-1。與中性和堿性蛋白酶相比，酸性蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)水平相對(duì)較低。因此，發(fā)掘新型酸性蛋白酶基因，實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中高效表達(dá)，具有重要理論和實(shí)際意義。

蛋白酶可以水解肉類中的蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)肉的嫩化，同時(shí)產(chǎn)生小分子肽增加肉的風(fēng)味等，已在肉制品加工中廣泛應(yīng)用[13]。目前用于肉類嫩化的蛋白酶大都來(lái)源于植物，微生物來(lái)源的蛋白酶在肉類嫩化研究方面的報(bào)道較少[14]。本研究從日本曲霉(Aspergillusjaponicus)中克隆了一個(gè)新型酸性蛋白酶基因，在畢赤酵母中分泌表達(dá)，進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)和對(duì)豬肉嫩化的效果，希望為微生物來(lái)源酸性蛋白酶在肉類嫩化中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

克隆宿主大腸桿菌DH5α，購(gòu)自北京全式金生物有限公司；經(jīng)密碼子優(yōu)化后AjproA1基因由上海捷瑞生物工程公司合成；pPIC9K質(zhì)粒和巴斯德畢赤酵母GS115，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。LB(Luria-Bertani培養(yǎng)基)、MD(最小葡萄糖培養(yǎng)基)、YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基)、BMGY(緩沖甘油復(fù)合培養(yǎng)基)、BMMY(緩沖甲醇復(fù)合培養(yǎng)基)、BSM(發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基)等培養(yǎng)基[15]，購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶，NEB(北京)有限公司；膠回收試劑盒，南京諾維贊生物技術(shù)公司；無(wú)縫克隆試劑盒，北京博邁德生物公司。木瓜蛋白酶(400 U·mg-1)，北京諾維信生物技術(shù)有限公司。其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FUG- 5L型單層玻璃機(jī)械攪拌發(fā)酵罐，上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；MyCycler型PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO- RAD公司；CBIO- GelPro型凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽百奧科技有限公司；GL- 20B 型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；AKTA型蛋白純化系統(tǒng)，美國(guó)GE Healthcare公司； TA.XT Plus型物性測(cè)試儀，英國(guó)SMS公司；TU- 1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1日本曲霉酸性蛋白酶基因的克隆和表達(dá)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的日本曲霉基因組中發(fā)掘到一個(gè)酸性蛋白酶基因(Genbank 登錄號(hào)：RAH76988.1)，基于畢赤酵母偏好性對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并交由上海捷瑞生物工程公司合成，名為AjproA1。依據(jù)優(yōu)化后基因序列，設(shè)計(jì)上游引物AjproA1- F(5′-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCTCCCTTGGCCGAAACTC-3′)和下游引物AjproA1- R(5′-AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTCATGCCTGAGCAGCGAAA-3′)。以pUC57- AjproA1載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)：10×TransStart Fast Pfu buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，F(xiàn)ast Pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1.0 μL，補(bǔ)水至 50.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，與EcoRI和NotI雙酶切表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行無(wú)縫克隆連接，之后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌落PCR和測(cè)序(5′ AOX1: 5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC -3′，3′ AOX1: 5′- GGCAAATGGCATTCTGACATCC -3′)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并提取重組質(zhì)粒pPIC9K-AjproA1。重組質(zhì)粒pPIC9K-AjproA1用限制性內(nèi)切酶PmeI進(jìn)行線性化，經(jīng)乙醇沉淀回收后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，菌液涂布于MD板于30 ℃培養(yǎng)48 h。挑取MD板上單菌落接種至BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基中，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，每24 h添加體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇。培養(yǎng)5 d后8 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定蛋白酶活力。

1.3.2畢赤酵母高密度發(fā)酵AjproA1與純化

根據(jù)畢赤酵母發(fā)酵指導(dǎo)手冊(cè)(Version B，053002，Invitrogen)，重組菌株GS115- AjproA1在5L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵。種子液在YPD培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至OD600為10.0左右接種，發(fā)酵過(guò)程分為分批培養(yǎng)階段、甘油流加階段和100%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，每12 h取樣分析蛋白酶活力、蛋白含量和菌體質(zhì)量濃度。用截留分子質(zhì)量為5 kDa的膜包對(duì)粗酶液進(jìn)行濃縮并在緩沖液[20 mmol·L-1、pH值為7.0的磷酸鹽(PBS)緩沖液]中透析過(guò)夜，用20 mmol·L-1、pH值為7.0的PBS緩沖液預(yù)先平衡強(qiáng)陰離子交換層析柱QSFF，透析后的粗酶液以0.5 mL·min-1速度上樣。利用含500 mmol·L-1NaCl 、pH值為7.0的20 mmol·L-1PBS緩沖液進(jìn)行線性洗脫，收集洗脫下來(lái)具有酶活力的組分，采用SDS- PAGE法分析蛋白純度，回收純化后的蛋白于pH值為3.0的檸檬酸緩沖液中透析。

1.3.3AjproA1酶活力和蛋白含量的測(cè)定

蛋白酶活力采用福林酚法(GB/T 23527—2009)測(cè)定[16]。以酪蛋白為底物，適當(dāng)稀釋酶液，將100 μL酶液和100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白溶液(pH 值為3.0)混合，于45 ℃反應(yīng)10 min，加入200 μL的0.4 mol·L-1三氯乙酸(TCA)溶液終止反應(yīng)。將終止后的反應(yīng)混合體系于10 000 r/min離心3 min，取100 μL上清液與500 μL濃度為0.4 mol·L-1的碳酸鈉溶液混合，最后加入100 μL福林酚試劑，于45 ℃反應(yīng)20 min，待其冷卻后在吸光度值為680 nm下測(cè)定其吸光度。以先加入TCA終止反應(yīng)的酶液作為對(duì)照。酶活力單位定義：在pH值為3.0和溫度為45 ℃條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需酶量，為1個(gè)酶活力單位(U·mL-1)。

以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，蛋白含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行。SDS- PAGE參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。

1.3.4AjproA1酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1)最適pH值及酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定。最適pH值的測(cè)定：配制不同pH值體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白底物溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定不同pH值下的酶活力。以酶活力最高點(diǎn)為100%，分別計(jì)算不同pH值條件下的相對(duì)酶活力。所用緩沖體系(50 mmol·L-1)及pH值范圍：甘氨酸- 鹽酸緩沖液(pH值1.5～3.0)、檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液(pH值 2.5～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH值7.0～9.0)。酸堿穩(wěn)定性測(cè)定：用不同pH值的緩沖液稀釋酶液，于45 ℃水浴處理30 min，迅速冰浴30 min，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定其殘余酶活力；以未經(jīng)處理的酶液為對(duì)照(100%)，計(jì)算不同pH值緩沖液處理下的殘余酶活力。

2)最適溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定。最適溫度測(cè)定：用最適pH值緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白底物溶液，在不同溫度(30～70 ℃)下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力。以酶活力最高點(diǎn)為100%，分別計(jì)算不同溫度條件下的相對(duì)酶活力。熱穩(wěn)定性的測(cè)定：用最適pH值緩沖液適當(dāng)稀釋酶液后，在不同溫度(30～70 ℃)下保溫處理30 min，再迅速冰浴30 min，在最適條件下測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)處理的酶液為對(duì)照(100%)，計(jì)算不同溫度處理下的殘余酶活力。

3) 金屬離子和化合物對(duì)AjproA1酶活力影響的測(cè)定。將酶液用檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH值為3.0)適當(dāng)稀釋，與不同金屬離子及化合物混勻(終濃度1 mmol·L-1)，置于45 ℃保溫處理30 min，迅速冰浴30 min后，在最適條件下測(cè)定其殘余酶活力。以相同條件下未加入金屬離子及化合物的酶液為對(duì)照(100%)，計(jì)算不用金屬離子和化合物處理后比酶活力和相對(duì)酶活力。金屬離子及化合物包括：Ba2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Li+、Mg2+、Mn2+、Sn2+、Sr2+、Zn2+、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和曲拉通(TritonX- 100)。

4)蛋白酶抑制劑對(duì)AjproA1酶活力影響的測(cè)定。利用不同類型濃度的蛋白酶抑制劑[胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin A)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酰胺(Iodoacetamid)、乙二胺四乙酸(EDTA)]處理酶液，置于45 ℃保溫處理30 min，迅速冰浴30 min后，在最適條件下測(cè)定其殘余酶活力。以未處理酶液作為對(duì)照(100%)，計(jì)算不同抑制劑處理后的殘余酶活力。

1.3.5AjproA1底物特異性及對(duì)酪蛋白水解特性分析

使用檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH值為3.0) 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪蛋白、乳清蛋白、脫脂奶粉、偶氮酪蛋白、牛血清蛋白、血紅蛋白、大豆分離蛋白、β-乳球蛋白、明膠、卵清蛋白、人血清白蛋白、肌紅蛋白、魚(yú)精蛋白和膠原蛋白等，以上述蛋白作為底物，在最適條件下測(cè)定酶活力。以酪蛋白為底物時(shí)的酶活力為100%，分別計(jì)算不同底物下酶活力的相對(duì)值。

使用檸檬酸- 磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH值為3.0)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白底物溶液，在不同底物中分別加入7.5 U·mL-1的重組AjproA1，于45 ℃分別水解0、5、15、30、60 min。通過(guò)SDS- PAGE電泳分析AjproA1對(duì)不同酪蛋白組分水解能力，并參照Rocha等[19]方法進(jìn)行水解度測(cè)定。

1.3.6AjproA1在豬肉嫩化中的應(yīng)用

將從超市購(gòu)買的豬后腿肉剔除可見(jiàn)的結(jié)締組織及脂肪，切成方塊稱重并記錄。配制400 U·mL-1的AjproA1和木瓜蛋白酶酶液，根據(jù)肉塊質(zhì)量以20 U·g-1(酶活力/肉質(zhì)量)進(jìn)行注射嫩化處理，于4 ℃放置24 h。以未進(jìn)行嫩化處理和水處理的豬肉作為對(duì)照。

蒸煮損失率的測(cè)定：稱取50 g肉塊，放于蒸煮袋中，在80 ℃水浴鍋中加熱。當(dāng)肉中心溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，取出樣品，冷卻至室溫，用濾紙擦干表面水分，稱重，測(cè)定蒸煮損失率。蒸煮損失率計(jì)算方法[20]見(jiàn)式(1)。

蒸煮損失率=(蒸煮前質(zhì)量-蒸煮后質(zhì)量)/
蒸煮前質(zhì)量×100%。

(1)

剪切力是考察肉類品質(zhì)的重要指標(biāo)，通常用來(lái)表征肉的嫩度。剪切力測(cè)定參照Sun等[21]的方法進(jìn)行。測(cè)定參數(shù)：HDP/BS(Warner- Bratzler Shear)探頭。測(cè)試模式：TPA。肉嫩度測(cè)定程序：測(cè)試前速度，1 mm·s-1；剪切速度，1 mm·s-1；測(cè)試后速度，5 mm·s-1；壓縮距離，20 mm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 AjproA1基因克隆和表達(dá)結(jié)果分析

該酸性蛋白酶AjproA1基因的克隆與表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1。以pUC57-AjproA1克隆載體為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，得到長(zhǎng)度1 177 bp的片段[圖1(a)]。 片段與酶切后的pPIC9K載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-AjproA1[圖1(b)]，并通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子[圖1(c)]，將線性化的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中。該基因采用無(wú)縫克隆技術(shù)在畢赤酵母中表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)化子篩選，測(cè)得高產(chǎn)重組菌株搖瓶發(fā)酵后酶活力為28.1 U·mL-1。

圖1 AjproA1基因的克隆與表達(dá)結(jié)果Fig.1 Cloning and expression of AjproA1

AjproA1基因全長(zhǎng)1 200 bp，編碼399個(gè)氨基酸，含有N端信號(hào)肽(1～20 AA)，通過(guò)ExPASy分析可知該蛋白理論預(yù)測(cè)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為39.5 kDa(剔除信號(hào)肽)和4.75。預(yù)測(cè)無(wú)N-糖基化位點(diǎn)，有16個(gè)O糖基化位點(diǎn)。AjproA1經(jīng)BLAST蛋白多重序列比對(duì)，分析結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，該蛋白酶編碼的氨基酸序列與海棗曲霉(A.phoenicis)來(lái)源Aspergillopepsin- 1(GenBank：Q12567.1)[22]同源性最高，為73.0%，與黑曲霉(A.niger)來(lái)源Aspergillopepsin- 1(GenBank：P55325.1)[23]同源性為72.5%。根據(jù)同源序列比對(duì)結(jié)果可知：該酸性蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶A1家族，含有DTGS和DTGT兩個(gè)特征催化序列，推測(cè)含有49個(gè)氨基酸前導(dǎo)肽，成熟肽編碼331個(gè)氨基酸蛋白，成熟蛋白預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為32.5 kDa。結(jié)合多重序列比對(duì)結(jié)果，采用系統(tǒng)鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)分析該酸性蛋白酶AjproA1與其他同源A1家族蛋白酶的進(jìn)化關(guān)系，分析結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，AjproA1不同于進(jìn)化樹(shù)中的其他真菌蛋白酶，聚集在一個(gè)新的分支上。

序列比對(duì)包括日本曲霉(A.j. AjproA1)、海棗曲霉(A.p. Q12567.1)、黑曲霉(A.n.P55325.1)、泡盛曲霉(A.a.P17946.1)、黑曲霉(A.n. A2R3L3.1)、煙曲霉(A.f.BOY1V8.1)、煙曲霉(A.f. A1DDK1)、產(chǎn)紅青霉(P.r. B6HL60.1)來(lái)源的蛋白酶氨基酸序列。嚴(yán)格保守的特征基序(Asp-Thr-Gly/Thr)用紅色框突出顯示。紅點(diǎn)表示天冬氨酸蛋白酶 A1 家族中潛在催化殘基。圖2 日本曲霉AjproA1與其他同家族酸性蛋白酶的多重序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of Aspergillus japonicus AjproA1 and other acid proteases from same family

AjproA1蛋白酶氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)：RAH76988.1)，通過(guò)BLAST分析獲得其他相同A1家族酸性蛋白酶氨基酸序列，采用系統(tǒng)鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。宿主真菌序列用GenBank 登錄號(hào)標(biāo)記。AjproA1顯示為紅色分支，屬于新的未知分支。圖3 酸性蛋白酶AjproA1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of acid protease AjproA1

2.2 AjproA1高密度發(fā)酵與純化分析

AjproA1重組菌株的高密度發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4(a)可知，在發(fā)酵168 h時(shí)菌體質(zhì)量濃度為383.6 g·L-1，酶活力和蛋白質(zhì)量濃度分別達(dá)669.6 U·mL-1和6.64 mg·mL-1。誘導(dǎo)過(guò)程中胞外分泌蛋白組成的SDS- PAGE電泳分析結(jié)果如圖4(b)所示。由圖4(b)可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，目的條帶逐漸變粗，發(fā)酵上清液中蛋白分泌含量逐漸增多。將粗酶液經(jīng)膜包濃縮超濾后，利用QSFF強(qiáng)陰離子交換層析柱一步純化得到電泳級(jí)純酶見(jiàn)圖5。純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示，純化后的比酶活力由78.9 U·mg-1上升至93.9 U·mg-1，純化倍數(shù)為1.2。

圖4 重組畢赤酵母高密度發(fā)酵歷程和電泳分析Fig.4 Time-course of high cell-density fermentation of recombinant P. pastoris and electrophoretic analysis

目前已成功實(shí)現(xiàn)多種蛋白酶在畢赤酵母中分泌表達(dá)。已報(bào)道酸性蛋白酶在畢赤酵母表達(dá)中，大多數(shù)產(chǎn)酶水平都較低。密碼子優(yōu)化能夠提高密碼子的使用頻率和適應(yīng)指數(shù)，提高外源蛋白表達(dá)量[24]。本研究首次將日本曲霉酸性蛋白酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在畢赤酵母中分泌表達(dá)，經(jīng)高密度發(fā)酵后測(cè)得酶活力為669.6 U·mL-1。AjproA1產(chǎn)酶水平顯著高于大多數(shù)A1家族天冬氨酸蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)水平，如黑曲霉來(lái)源酸性蛋白酶(8.76 U·mL-1)[25]、棘孢木霉來(lái)源天冬氨酸蛋白酶(18.5 U/mL)[26]和匍匐曲霉來(lái)源天冬氨酸蛋白酶(1.4 U·mL-1)[9]。

M. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker；1.粗酶液；2.純酶。圖5 純化酸性蛋白酶AjproA1 SDS- PAGE分析Fig.5 SDS- PAGE analysis of purified acid protease AjproA1

表1 重組酸性蛋白酶AjproA1的純化結(jié)果

2.3 AjproA1的酶學(xué)性質(zhì)分析

AjproA1的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6(a)及圖6(b)表明，AjproA1的最適pH值為3.0，在pH值為3.0～6.0的緩沖液中處理30 min后仍保留80%以上殘余酶活力。圖6(c)及圖6(d)表明，AjproA1的最適溫度為45 ℃，在40 ℃下處理30 min后仍保留80%以上殘余酶活力。本實(shí)驗(yàn)中所用金屬離子和化合物對(duì)酶活力的影響見(jiàn)表2。表2顯示，金屬離子Mn2+對(duì)酶活力無(wú)明顯影響，其余金屬離子對(duì)酶活力均有不同程度抑制作用；化合物對(duì)酶活力也均有不同程度抑制作用，而SDS幾乎全部抑制酶活力，殘余相對(duì)酶活力為1.5%(P<0.05)。不同類型蛋白酶抑制劑對(duì)AjproA1酶活力影響見(jiàn)表3。表3顯示，4種蛋白酶抑制劑對(duì)AjproA1均有不同程度抑制作用，金屬蛋白酶抑制劑EDTA和絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)酶活力有較大影響，半胱氨酸蛋白酶抑制劑Iodoacetamide對(duì)酶活力沒(méi)有顯著影響。當(dāng)胃蛋白酶抑制劑Pepstatin A濃度為0.01 mmol·L-1時(shí)，酶活力受到完全抑制，表明該蛋白酶是一種天冬氨酸蛋白酶。

圖6 AjproA1的酶學(xué)性質(zhì)分析Fig.6 Enzymatic properties analysis of acid protease AjproA1

表2 金屬離子和化合物對(duì)AjproA1活力的影響

表3 蛋白酶抑制劑對(duì)AjproA1活力的影響

大多數(shù)真菌來(lái)源酸性蛋白酶的最適pH值為3.0～5.5，在pH值為3.0～6.0時(shí)保持穩(wěn)定[21]。AjproA1的最適pH值為3.0，與大多數(shù)真菌來(lái)源酸性蛋白酶相似，但高于黑曲霉來(lái)源酸性蛋白酶PepAb(pH值為2.5)[27]，低于棘孢木霉來(lái)源TAASP[28](pH值為4.0)和米曲霉來(lái)源PepA[29](pH值為4.5)。不同來(lái)源酸性蛋白酶的最適反應(yīng)pH值不同，可能與酶活性中心含有的羧基有關(guān)[30]。大多數(shù)研究報(bào)道真菌酸性蛋白酶最適溫度在50～60 ℃。AjproA1的最適溫度為45 ℃，低于大多數(shù)真菌來(lái)源的酸性蛋白酶，如黑曲霉酸性蛋白酶PepAb(50 ℃)[31]和米曲霉酸性蛋白酶PepA(55 ℃)[32]。金屬蛋白酶抑制劑EDTA對(duì)AjproA1酶活力有較大影響，說(shuō)明某些離子對(duì)酶的穩(wěn)定性或其活性很重要[21]。

2.4 AjproA1的底物水解特異性及對(duì)酪蛋白水解特性分析

AjproA1對(duì)多種蛋白質(zhì)底物的水解活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。表4顯示，該蛋白酶表現(xiàn)出廣泛底物特異性，對(duì)血紅蛋白表現(xiàn)出最高水解活力(116.9%)，高于酪蛋白(100.0%)；其余依次為肌紅蛋白(65.4%)、人血清蛋白(53.8%)、脫脂乳(43.1%)、β-乳球蛋白(41.5%)、牛血清白蛋白(38.5%)等，但對(duì)魚(yú)精蛋白無(wú)活性。AjproA1對(duì)不同酪蛋白水解特性分析結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，AjproA1能在不同程度上水解酪蛋白的3種組分(α、β和κ-酪蛋白)，生成分子質(zhì)量較小的肽段。圖7(a)表明，3種酪蛋白的水解度隨水解時(shí)間延長(zhǎng)在逐漸增加，且在水解60 min時(shí)，κ-酪蛋白表現(xiàn)最高水解度(16.65%)，其次為β-酪蛋白(13.38%)、α-酪蛋白(10.89%)。圖7(d)表明，水解5 min后，AjproA1將κ-酪蛋白主條帶徹底水解。圖7(b)和圖7(c)表明，隨水解時(shí)間延長(zhǎng)，α-酪蛋白和β-酪蛋白主條帶呈現(xiàn)逐漸變淺趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，AjproA1對(duì)不同酪蛋白組分水解能力有較大差異，對(duì)κ-酪蛋白表現(xiàn)出最高的水解能力。

表4 AjproA1的底物水解特異性

不同微生物來(lái)源酸性蛋白酶表現(xiàn)出不同的底物水解特異性。Guo等[12]報(bào)道的酸性蛋白酶PsAPA對(duì)酪蛋白表現(xiàn)出最高水解活力，能夠水解魚(yú)精蛋白，不能夠水解膠原蛋白、卵清蛋白；Sun等[21]報(bào)道的酸性蛋白酶RmproA也對(duì)酪蛋白表現(xiàn)出最高水解活力，能夠水解卵清蛋白，不能夠水解魚(yú)精蛋白和膠原蛋白。二者與AjproA1的底物水解特異性表現(xiàn)出較大差異。AjproA1對(duì)不同酪蛋白水解特性與Wang等[33]報(bào)道的MoringaoleiferaSeeds來(lái)源天冬氨酸蛋白酶對(duì)κ-酪蛋白表現(xiàn)出最高水解能力的情況相似；然而Sun等[21]報(bào)道的米黑根毛霉來(lái)源酸性蛋白酶RmproA對(duì)α-酪蛋白表現(xiàn)出最高水解能力。說(shuō)明不同來(lái)源酸性蛋白酶對(duì)酪蛋白中不同組分的水解能力具有差異性。

圖7 AjproA1對(duì)不同酪蛋白的水解特性Fig.7 Hydrolysis properties of AjproA1 for different casein

2.5 AjproA1在豬肉嫩化中的應(yīng)用

嫩化實(shí)驗(yàn)以蒸煮損失率和剪切力為指標(biāo)，考察了AjproA1對(duì)豬肉的嫩化效果，結(jié)果見(jiàn)表5。表5顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)水、木瓜蛋白酶和AjproA1處理的豬肉蒸煮損失率均有不同程度增加(P<0.05)；AjproA1與木瓜蛋白酶相比，AjproA1對(duì)豬肉的蒸煮損失率(19.55%)低于木瓜蛋白酶(22.73%)，表明AjproA1在持水力方面優(yōu)于木瓜蛋白酶；同時(shí)與對(duì)照組相比，經(jīng)水、木瓜蛋白酶和AjproA1處理的豬肉都表現(xiàn)出剪切力下降，且木瓜蛋白酶和AjproA1對(duì)豬肉剪切力無(wú)顯著差異(P>0.05)。本研究結(jié)果表明，AjproA1具有作為嫩肉劑的潛力。

表5 AjproA1對(duì)豬肉的嫩化效果

3 結(jié) 論

從日本曲霉中克隆了一個(gè)新型酸性蛋白酶基因(AjproA1)，該酶屬于天冬氨酸蛋白酶A1家族。將AjproA1密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，經(jīng)5L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后測(cè)得酶活力為669.6 U·mL-1。AjproA1最適反應(yīng)溫度45 ℃，最適pH值為3.0，在pH值為3.0～6.0保持穩(wěn)定。與其他酸性蛋白酶的特性相比，AjproA1較低的溫度特性更有利于低溫條件下肉的嫩化和蛋白質(zhì)水解。不同于大部分真菌來(lái)源的酸性蛋白酶對(duì)酪蛋白表現(xiàn)出最高催化活性，AjproA1對(duì)血紅蛋白具有最高催化活性。與α-酪蛋白和β-酪蛋白相比，AjproA1更能有效地水解κ-酪蛋白。AjproA1對(duì)豬肉進(jìn)行嫩化的結(jié)果表明，AjproA1具有作為嫩肉劑的潛力。本研究結(jié)果旨在為食品工業(yè)中肉類嫩化蛋白酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。