葛笑笑， 鄧淑芳， 曾凱芳， 鄧麗莉

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院/食品貯藏與物流研究中心， 重慶 400715)

色澤是柑橘果實重要的感官指標(biāo)之一。受成熟期積溫等因素影響，早熟柑橘的轉(zhuǎn)色往往發(fā)生在采收后，該轉(zhuǎn)色過程主要受到貯藏溫度、光照、植物激素等因素的影響，其中，貯藏溫度是最重要的環(huán)境因素之一[1-2]。研究表明：適宜的貯藏溫度促進果實轉(zhuǎn)色，而過高或過低的溫度則會抑制果實轉(zhuǎn)色[3-5]。

柑橘油胞的發(fā)育與果皮色澤有關(guān)。柑橘油胞是合成和儲存柑橘精油的重要細(xì)胞器，柑橘精油主要由烯萜類揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成，而一些烯萜類物質(zhì)是由類胡蘿卜素降解產(chǎn)生的[6]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄柚果皮油胞與薄壁組織的差異基因主要富集在類異戊二烯代謝途徑[7]，而類胡蘿卜素代謝的前體物質(zhì)正是類異戊二烯代謝途徑的產(chǎn)物。除油胞外，柑橘果實的色澤變化也與質(zhì)體發(fā)育密切相關(guān)。質(zhì)體是綠色植物中特有的細(xì)胞器，根據(jù)功能可分為：原生質(zhì)體、葉綠體、有色體、油粒體等[8]。其中，葉綠體是典型的光合質(zhì)體，用于光合作用和光保護[9]。有色體是類胡蘿卜素合成和積累的場所，根據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)可分為晶狀、球狀、纖維狀等[10-11]。葉綠體向有色體的分化是柑橘果實成熟最具標(biāo)志性的現(xiàn)象之一[12-13]。此外，一些與質(zhì)體發(fā)育有關(guān)或定位于葉綠體的蛋白質(zhì)被證明與色澤變化有關(guān)，如4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶(HDS)、質(zhì)體脂質(zhì)相關(guān)蛋白(PAP)、質(zhì)體小熱激蛋白(psHSPs)等[8]。因此，油胞和質(zhì)體是柑橘果實著色的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究不同溫度下果實超微結(jié)構(gòu)變化對闡明柑橘果實采后著色的機理具有重要意義；而目前關(guān)于貯藏溫度如何調(diào)控蜜橘果皮轉(zhuǎn)色過程中質(zhì)體發(fā)育及相關(guān)基因表達的研究較少。

本研究以重慶早熟蜜橘(綠熟)為實驗材料，研究5、25、32 ℃短期貯藏過程中蜜橘果皮色澤和超微結(jié)構(gòu)的變化，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對質(zhì)體相關(guān)基因的表達水平進行分析，探討不同貯藏溫度對采后蜜橘果皮轉(zhuǎn)色過程中質(zhì)體結(jié)構(gòu)及其相關(guān)基因表達量的影響，以期為進一步理解貯藏溫度調(diào)控柑橘果實果皮著色的機理提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜橘果實為采摘于重慶市北碚區(qū)的早熟蜜橘(綠熟)。綠熟蜜橘果實(盛花后170 d)于2021年9月采收后立即運回實驗室，挑選大小均一、色澤一致、無機械傷、無病蟲害的健康果實作為實驗材料。

次氯酸鈉(體積分?jǐn)?shù)2%)，成都市科龍化工試劑廠；聚乙烯套果袋(170 mm×140 mm，厚度為0.02 mm)，四川綠果林制袋有限公司；電鏡固定液，北京索萊寶科技有限公司；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、乙醇，重慶躍翔化工有限公司；叔丁醇，重慶市鈦新化工有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

OmniPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Takara- RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒，成都微克生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MIR553型恒溫培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；DW- HL528型超低溫保存箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；Chroma CR- 400型色差儀，日本Minolta公司；GSL- 1100X- SPC- 16M型磁控濺射鍍膜儀，沈陽科晶自動化設(shè)備有限公司；Phenom Pro10102型掃描電子顯微鏡，荷蘭Phenom公司；JEM 1200EX型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社(Jeol)；2100型生物分析儀，美國Agilent公司；CFX384型熒光定量PCR儀、Mini- Sub cell GT型電泳儀，美國Bio- Rad公司；4100型凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1果實處理方法

果實用次氯酸鈉溶液浸泡1 min進行表面殺菌后用清水洗凈，在室溫下自然晾干，將實驗果實分為3組，每組100個，用聚乙烯套果袋單獨包裝并密封。將果實分別貯藏于5、25、32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。處理的果實分為觀察組和取樣組，取樣組分別于第0天、第3天、第6天、第9天取果實赤道部位果皮1～2 cm寬處，快速切成小塊后放入液氮中冷凍，再置于超低溫保存箱中用于后續(xù)實驗指標(biāo)的測定，每個指標(biāo)的測定重復(fù)3次。觀察組分別于第0、3、6、9天拍照記錄及測定色差。

1.3.2色差測定

使用色差儀測定果實果皮色差值。根據(jù)國際照明委員會L*、a*、b*顏色空間，測定果實果皮赤道部位的L*、a*、b*、H*和C*值。其中，L*表示光澤度，a*表示紅綠值，b*表示黃藍值，H*表示色相角(0°～90°：紅- 黃，90°～180°：黃- 綠，180°～270°：綠- 藍，270°～360°：藍- 紅)，C*表示彩度。每個處理測量20個果實，每個果實取果皮赤道處對應(yīng)3點，取平均值作為果皮色差值。

1.3.3掃描電鏡的制片方法

樣品于第0、3、6、9天進行取樣，根據(jù)果皮的結(jié)構(gòu)特征，將赤道部位的蜜橘果皮切成1 mm×1 mm×3 mm，迅速放入電鏡固定液內(nèi)，樣品保存在4 ℃下以待掃描電鏡檢測。掃描電鏡制片方法參照袁梓洢[14]的方法，制片完成后，樣品于磁控濺射鍍膜儀中鍍金膜，采用掃描電子顯微鏡對樣品進行觀察、拍照、記錄等。

1.3.4透射電鏡的制片方法

透射電鏡的樣品與掃描電鏡的樣品取樣一致。透射電鏡制片方法參照北京中科百測技術(shù)服務(wù)有限公司的常規(guī)制片方法，采用透射電子顯微鏡進行樣品觀察、拍照、記錄等。

1.3.5轉(zhuǎn)錄組測序

0 d和經(jīng)5、25、32 ℃貯藏6 d后的蜜橘果實的轉(zhuǎn)錄組測序委托廣州基迪奧生物科技有限公司進行，文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組分析的過程同樣參考該公司的方法。本研究所參考的基因組為Citrus_Clementina_v1.0(GCF_000493195.1)。以上下調(diào)倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)作為篩選差異基因的指標(biāo)，|log2(FC)|>0，且FDR<0.05為判別標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6RNA提取和cDNA合成

使用OmniPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒提取樣品總RNA。RNA純度在生物分析儀上進行了評估，并使用無RNase葡萄糖凝膠電泳進行檢查。使用RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒對質(zhì)量合格的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，最終獲得的cDNA置于-20 ℃下保存。

1.3.7實時熒光定量PCR分析

實驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。用熒光定量PCR儀進行qPCR檢測。10 μL的PCR反應(yīng)體系(所有操作均在冰上進行)：0.4 μL cDNA模板(將總RNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物cDNA稀釋20倍)、5.4 μL 2×SG Fast qPCR Master Mix、 0.4 μL引物F(10 μmol/L)、 0.4 μL引物R(10 μmol/L)、3.4 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：按照95 ℃、5 s，60 ℃、30 s的程序進行40個循環(huán)，最后從65 ℃以0.5 ℃/s的速度提高至95 ℃。采用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

圖1 不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮外觀顏色變化Fig.1 External color changes of mandarin fruit peel stored at different temperatures

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。所有數(shù)據(jù)用Excel 2016和SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件進行分析處理，ANOVA和Duncan’s多重比較用于分析顯著性差異，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下蜜橘果皮外觀及色差變化

不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮外觀變化如圖1。隨著貯藏時間的延長，25 ℃下貯藏蜜橘果實的果皮逐漸從綠色轉(zhuǎn)為黃色，在第9天時果皮完全轉(zhuǎn)黃；而貯藏在5 ℃和32 ℃的蜜橘果實仍然保持綠色。

不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮色差值(C*、H*、a*/b*)的變化如表2。25 ℃貯藏果實的C*、a*/b*值隨著貯藏時間延長呈顯著增加的趨勢，H*值逐漸下降。貯藏9 d后，25 ℃下貯藏果實的a*/b*值比5 ℃和32 ℃分別高72.22%和62.50%。5 ℃下貯藏果實的C*、H*、a*/b*值在貯藏期間(0～9 d)沒有明顯變化。而在32 ℃下貯藏果實的C*、a*/b*值有輕微上升的趨勢，H*值緩慢下降，第9天時，C*、H*、a*/b*值與5 ℃、25 ℃組有顯著差異(P<0.05)。與25 ℃組相比，雖然5 ℃和32 ℃下貯藏均抑制果皮著色，但兩者對色差值的影響存在一定差異(P<0.05)。

表2 不同貯藏溫度對蜜橘果實果皮色差值的影響

2.2 不同貯藏溫度下蜜橘果皮油胞結(jié)構(gòu)的變化

不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮油胞的結(jié)構(gòu)變化如圖2。采收時蜜橘果實果皮油胞形態(tài)為橢圓形，由油胞和薄壁組織組成，薄壁細(xì)胞圍繞著油胞形成層狀結(jié)構(gòu)，油胞中央出現(xiàn)油胞腔，大小不等，深淺不一，油胞腔的出現(xiàn)也說明油胞已達到成熟形態(tài)，同時也可看出蜜橘果皮較薄，油胞緊貼著表皮生長。在25 ℃貯藏時，蜜橘果實油胞腔內(nèi)出現(xiàn)大量碎片物質(zhì)，油胞腔形態(tài)逐漸消失，油胞腔內(nèi)層狀組織聚集，貯藏9 d時，油胞層狀組織完全融合。5 ℃貯藏第6天時蜜橘果實油胞腔內(nèi)部細(xì)胞逐漸裂解并融合，但層狀結(jié)構(gòu)依然存在；但在9 d時，油胞腔內(nèi)部結(jié)構(gòu)破裂，片層結(jié)構(gòu)發(fā)生裂解，腔內(nèi)出現(xiàn)一些碎片物質(zhì)。32 ℃貯藏過程中果實油胞的層狀結(jié)構(gòu)被破壞的同時向腔室內(nèi)聚集，油胞腔室周圍的薄壁組織形態(tài)被破壞，在第9天時，油胞腔內(nèi)結(jié)構(gòu)融合后破裂，整個細(xì)胞腔呈半真空狀態(tài)。

放大倍數(shù)為250倍。圖2 不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮油胞的結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Structural changes of oil glands in mandarin fruit peel at different storage temperatures

2.3 不同貯藏溫度下蜜橘果皮質(zhì)體結(jié)構(gòu)及質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因表達水平變化

2.3.1不同貯藏溫度下質(zhì)體結(jié)構(gòu)的變化

不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變化如圖3。采收時，蜜橘果皮葉綠體結(jié)構(gòu)完整、呈橢圓形或圓形狀，排列在細(xì)胞壁周圍；基粒片層清晰可見，垛疊類囊體數(shù)目較多；質(zhì)體膜清晰、完整，質(zhì)體內(nèi)分布著少量淀粉粒和質(zhì)體小球。在25 ℃下貯藏6 d后，蜜橘果皮質(zhì)體排列在細(xì)胞壁周圍，但形狀開始變化，由原來的圓形發(fā)展為不規(guī)則橢圓形，且開始出現(xiàn)晶狀體，質(zhì)體內(nèi)淀粉粒數(shù)量增多且體積增大，類囊體結(jié)構(gòu)開始解體，說明伴隨果皮色澤由綠轉(zhuǎn)黃，葉綠體開始向有色體分化；第9天時，蜜橘果皮質(zhì)體結(jié)構(gòu)完整，呈橢圓形狀，質(zhì)體附近出現(xiàn)多個線粒體結(jié)構(gòu)，質(zhì)間空間變大，淀粉粒增多，類囊體結(jié)構(gòu)解體為絲狀。在5 ℃下貯藏6 d后，質(zhì)體基粒片層與質(zhì)體長軸平行，淀粉粒增多，質(zhì)體小球無明顯變化，葉綠體雙層膜明顯；貯藏9 d后，質(zhì)體內(nèi)的質(zhì)體小球數(shù)量增多，觀察到少許淀粉粒，類囊體呈跺疊狀，葉綠體雙層膜仍然存在，說明5 ℃在一定程度上延緩了葉綠體的發(fā)育。在32 ℃下貯藏6 d時，質(zhì)體中質(zhì)體小球數(shù)量增多且體積增大，類囊體解體為絲狀，排列方向與質(zhì)體長軸方向一致，質(zhì)間間隙增大，質(zhì)體膜部分模糊，說明葉綠體正在分化為有色體；第9天時，蜜橘果皮質(zhì)體表現(xiàn)為葉綠體形態(tài)，質(zhì)體內(nèi)出現(xiàn)少量淀粉粒，基粒片層和基質(zhì)片層清晰可見，由此說明32 ℃貯藏9 d可能導(dǎo)致蜜橘果皮有色體再分化為葉綠體。

PL：質(zhì)體；Pg：質(zhì)體小球；t：類囊體；s：淀粉粒；m：線粒體；GL：基粒片層；Cr：晶狀體。放大倍數(shù)分別為1 200倍和5 000倍。圖3 不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮質(zhì)體的結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Structural changes of plastid in mandarin fruit peel at different storage temperatures

2.3.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因表達水平的變化

在5、25、32 ℃下貯藏6 d的蜜橘果實果皮差異表達基因如圖4。5 ℃貯藏蜜橘果實的果皮中共有5 528個基因上調(diào)表達，5 626個基因下調(diào)表達；在25 ℃下貯藏的蜜橘果實的果皮中共有5 131個基因上調(diào)表達，5 814個基因下調(diào)表達；在32 ℃下貯藏的蜜橘果實的果皮中共有4 834個差異基因上調(diào)表達，5 169個基因下調(diào)表達。

同一指標(biāo)、同一貯藏時間下的不同字母表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。圖5 不同貯藏溫度對蜜橘果實果皮質(zhì)體相關(guān)基因相對表達量的影響Fig.5 Effect of different storage temperatures on relative expression of plastid-related genes of mandarin fruit peel

質(zhì)體是類胡蘿卜素合成和儲存的重要場所，不同貯藏溫度下的蜜橘果皮質(zhì)體結(jié)構(gòu)變化有顯著區(qū)別(圖3)。質(zhì)體相關(guān)基因的表達可能會對質(zhì)體轉(zhuǎn)化和色素產(chǎn)生影響。不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮質(zhì)體相關(guān)差異表達基因如表3。根據(jù)已有研究報道的與質(zhì)體發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)，本研究篩選到38個差異表達基因，這些差異表達基因可分為4大類：HDS(篩選到3個差異表達基因)、HSPs(熱休克蛋白，篩選到18個差異表達基因)、PAP(篩選到9個差異表達基因)以及PPR(五肽重復(fù)蛋白，篩選到8個差異表達基因)。

表3 蜜橘果實果皮質(zhì)體相關(guān)差異表達基因

2.3.3不同貯藏溫度對質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因相對表達量的影響

不同貯藏溫度對蜜橘果皮質(zhì)體相關(guān)基因相對表達量的影響見圖5。根據(jù)表3的結(jié)果，對9個質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因的相對表達量進行分析。在第9天時，25 ℃貯藏的果實CcISPH1和CcISPH3都保持較高的表達水平，相對表達量是0天的276.24%和389.32%；而5 ℃貯藏的果實CcISPH1、CcISPH2和CcISPH3表達水平較低，相對表達量分別為0天的14.85%、4.90%、57.28%；32 ℃貯藏的果實CcISPH3僅在貯藏前期表現(xiàn)出高表達水平，與葉綠體結(jié)構(gòu)變化一致。第6天時，25 ℃和32 ℃貯藏的果實CcHSP17.6II表達水平顯著增加，2個貯藏組間存在顯著差別；5 ℃貯藏的果實CcHSP17.6II在第3天表現(xiàn)下調(diào)且達到最低值，但在隨后的貯藏中表達水平呈上升趨勢。25 ℃貯藏的果實CcHSP89.1相對表達量在貯藏期間沒有顯著變化，但5 ℃和32 ℃貯藏的果實CcHSP89.1相對表達量在第3天達到最低值，而后表現(xiàn)出不同程度的上升趨勢。3個貯藏溫度下果實的CcHSP21- 1和CcGUN4基因表現(xiàn)出較低的表達水平，但在第9天時出現(xiàn)顯著差別(P<0.05)。25 ℃貯藏的果實CcGUN4的相對表達量分別是5 ℃和32 ℃的12.00倍和1.71倍(P<0.05)。第9天時，25 ℃貯藏的果實CcCRR22表達水平較高；32 ℃貯藏組的CcCRR22無顯著變化，說明32 ℃對該基因無明顯調(diào)控作用；5 ℃貯藏的果實CcCRR22的基因表達水平在貯藏過程中有波動，但與0 d相比無顯著性差異，與葉綠體結(jié)構(gòu)變化結(jié)果一致。3個貯藏溫度下的蜜橘果實CcPAP12表現(xiàn)下調(diào)，但5 ℃和25 ℃貯藏的果實在第6天達到最低值后在隨后的貯藏中存在上升的趨勢；而32 ℃貯藏的果實CcPAP12相對表達量隨著貯藏時間的延長緩慢降低。總的來說，與采收時相比，5 ℃貯藏的蜜橘果實果皮質(zhì)體相關(guān)基因均表現(xiàn)出低表達水平；在第6天和第9天時，25 ℃貯藏激活果實CcISPH1、CcISPH3、CcHSP17.6II和CcCRR22的表達；由于32 ℃下蜜橘果皮質(zhì)體結(jié)構(gòu)變化較為特別，質(zhì)體相關(guān)基因表達水平波動較大，但值得注意的是，32 ℃和5 ℃對CcISPH2、CcHSP21- 1、CcGUN4表達的抑制程度存在顯著性差異，說明兩者對質(zhì)體結(jié)構(gòu)的影響存在差異。

2.4 不同貯藏溫度下質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因與色差值的相關(guān)性分析

不同貯藏溫度下蜜橘果皮質(zhì)體相關(guān)基因與色差值的相關(guān)性分析如圖6。25 ℃貯藏組的蜜橘果皮H*值與CcISPH1、CcISPH3、CcCRR22呈極顯著負(fù)相關(guān)，與CcISPH2、CcPAP12呈顯著正相關(guān)；a*/b*值與CcISPH3、CcCRR22呈極顯著正相關(guān)，與CcISPH1、CcHSP17.6II呈顯著正相關(guān)，與CcISPH2、CcPAP12呈顯著負(fù)相關(guān)，說明25 ℃下蜜橘果皮色澤變化與CcISPH1、CcISPH2、CcISPH3、CcHSP17.6II、CcCRR22表達水平關(guān)系緊密。5 ℃貯藏的蜜橘果皮H*值與CcISPH2、CcHSP21- 1、CcGUN4呈顯著正相關(guān)；而a*/b*值與CcISPH2、CcHSP21- 1、CcGUN4呈顯著負(fù)相關(guān)，說明5 ℃貯藏的蜜橘果皮CcISPH2、CcHSP21- 1、CcGUN4表達水平對果皮色澤變化有一定影響。32 ℃貯藏的蜜橘果皮H*值與CcISPH1、CcISPH2呈顯著正相關(guān)，與CcHSP21- 1、CcGUN4、CcPAP12呈極顯著正相關(guān)，與CcHSP17.6II呈顯著負(fù)相關(guān)；a*/b*值與CcHSP17.6II呈顯著正相關(guān)，與CcISPH1、CcISPH2、CcGUN4和CcPAP12呈顯著負(fù)相關(guān)，與CcHSP21- 1呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明32 ℃下蜜橘果皮呈綠色與多基因表達有關(guān)，并與各基因呈不同的相關(guān)關(guān)系。

*表示相關(guān)性顯著(P<0.05)，**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)。圖6 不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮質(zhì)體相關(guān)基因 與色差值相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of plastid-related genes and chromatism values of mandarin fruit peel at different storage temperatures

3 討 論

在柑橘采后貯藏過程中，溫度是影響果皮顏色的重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，重慶產(chǎn)早熟蜜橘果實采后在不同貯藏溫度下表現(xiàn)出不同的著色情況，在適宜的溫度(25 ℃)下蜜橘果皮C*以及a*/b*值顯著升高，果皮正常著色。而5 ℃和32 ℃都抑制果皮著色，但5 ℃下貯藏蜜橘果皮H*以及a*/b*值無顯著變化，32 ℃下貯藏蜜橘果皮的C*、H*以及a*/b*值有輕微變化，且與5 ℃存在顯著性差異，說明兩者的抑制效果是有區(qū)別的。

結(jié)合色差與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化結(jié)果，與其他組相比，5 ℃貯藏果實果皮色差值無明顯變化，油胞結(jié)構(gòu)變化不大，保持了油胞基本形態(tài)，葉綠體結(jié)構(gòu)變化緩慢，說明5 ℃貯藏延緩了果實果皮著色與果皮結(jié)構(gòu)變化；25 ℃貯藏的果實色差值在貯藏期間發(fā)生顯著變化，油胞形態(tài)也隨著貯藏時間的延長逐漸消失，油胞層狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，質(zhì)體結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)晶狀體，存在葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化的趨勢。前期有研究表明，在棗果實成熟轉(zhuǎn)色過程中，內(nèi)源揮發(fā)性物質(zhì)反式-2-乙烯醛含量顯著提高[15]。柑橘中大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)儲存在油胞中，那么25 ℃下蜜橘果皮油胞形態(tài)變化后，是否有揮發(fā)性物質(zhì)釋放以及揮發(fā)性物質(zhì)與蜜橘果皮色澤變化的關(guān)系需要進一步研究。另外，32 ℃貯藏蜜橘果實的果皮色差值有輕微增加但果皮仍然呈綠色，果皮油胞中層狀結(jié)構(gòu)解體，薄壁組織形態(tài)被破壞，存在葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化的趨勢，但在貯藏后期又再分化為葉綠體。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到38個與質(zhì)體相關(guān)的差異表達基因，分別屬于HDS、HSPs、PAP和PPR家族，其中比較突出的是編碼HDS、HSPs和PPR的基因。在質(zhì)體中發(fā)生的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP)途徑的代謝產(chǎn)物異戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)是類胡蘿卜素生物合成的前體物質(zhì)，HDS參與了IPP的合成，同時也與葉綠體發(fā)育有關(guān)[16]。ISPH是位于MEP途徑中的關(guān)鍵基因，同時也是編碼HDS的基因。色差值與質(zhì)體相關(guān)基因的相關(guān)性結(jié)果表明，蜜橘果皮H*、a*/b*值與ISPH存在相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，25 ℃和32 ℃貯藏組果實果皮的CcISPH1和CcISPH3上調(diào)表達，同時葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化，C*和a*/b*值上升。5 ℃貯藏組蜜橘果皮的CcISPH1、CcISPH2、CcISPH3下調(diào)表達，葉綠體發(fā)育緩慢，C*、H*以及a*/b*值無顯著變化，果皮保持綠色。同樣，Hsieh和Goodman[17]報道在ispH突變體中，擬南芥葉綠體發(fā)育受阻，表現(xiàn)為白化，與本研究結(jié)果一致。

HSPs是植物在逆境下產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，不同的HSPs家族具有不同的功能，有研究表明葉綠體的分化和發(fā)育也需要HSP70和小熱休克蛋白(small heat shock proteins，sHSPs)的參與[18-19]。相關(guān)性結(jié)果表明了25 ℃和32 ℃下蜜橘果皮H*、a*/b*值與HSP的表達有一定聯(lián)系。CcHSP17.6II編碼了17.3II類熱休克蛋白，該蛋白質(zhì)屬于sHSP。HSP中的sHSP已被證明能在高溫下做出氧化應(yīng)激響應(yīng)，同時李娜娜等[20]發(fā)現(xiàn)sHSP26在高溫下對玉米葉綠體有保護作用。推測在一定范圍內(nèi)的高溫脅迫下，sHSP能保護葉綠體，使其正常發(fā)育。CcHSP17.6II在25 ℃和32 ℃貯藏組果實中上調(diào)表達，0～6 d時，25 ℃和32 ℃貯藏組的蜜橘果皮葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化，但32 ℃貯藏組的蜜橘果皮在第9天表現(xiàn)為葉綠體形態(tài)，說明25 ℃對于早熟蜜橘而言不屬于高溫，葉綠體正常轉(zhuǎn)化為有色體，而蜜橘果實貯藏在32 ℃下，打破了果實體內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，sHSP做出氧化應(yīng)激響應(yīng)，增強了果實體內(nèi)氧化脅迫的耐受能力，形成“葉綠體保護模式”。

PAP是一類參與質(zhì)體小球和原纖維合成的蛋白家族，又被稱為原纖維蛋白，其被定位于葉綠體中，目前有研究證實PAP與質(zhì)體小球的形成和類胡蘿卜素生物合成有關(guān)[21-23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，32 ℃貯藏的蜜橘果皮CcPAP12在第6天時的表達量均顯著高于5 ℃和25 ℃貯藏組，超微結(jié)構(gòu)結(jié)果同樣表明32 ℃下的蜜橘果皮有色體中的質(zhì)體小球大量增多，與超表達OsFBN1并經(jīng)高溫處理的水稻葉片中的質(zhì)體小球大量積累的結(jié)果一致[22]。

五肽重復(fù)(pentatricopeptide repeat，PPR)蛋白是一類RNA結(jié)合蛋白，參與了細(xì)胞器基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，大多數(shù)定位于葉綠體或線粒體中。有研究表明PPR蛋白可以調(diào)控質(zhì)體基因和葉綠體發(fā)育[24-26]。水稻中PPR蛋白的缺失會導(dǎo)致葉綠體發(fā)育缺陷以及葉綠素代謝異常[27-28]。CcCRR編碼了PPR蛋白At1g11290，其亞細(xì)胞定位于葉綠體，At1g11290是PPR家族成員之一，具有特殊的DYW結(jié)構(gòu)域，與葉綠體及線粒體RNA轉(zhuǎn)錄本成熟發(fā)育有關(guān)[29]。本研究中發(fā)現(xiàn)伴隨C*和a*/b*值顯著上升，25 ℃貯藏組中CcCRR22上調(diào)表達的同時，葉綠體向有色體轉(zhuǎn)化。而5 ℃和32 ℃貯藏組中的CcCRR22下調(diào)表達，推測CRR蛋白可能在不適的溫度脅迫下做出一系列反應(yīng)，從而影響葉綠體發(fā)育。

4 結(jié) 論

本研究以重慶產(chǎn)早熟蜜橘為實驗材料，研究了不同貯藏溫度下蜜橘果皮色澤和質(zhì)體結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：25 ℃貯藏的蜜橘果實表現(xiàn)出顯著的著色現(xiàn)象，同時葉綠體正常轉(zhuǎn)化成有色體，CcISPH1、CcISPH3、CcCRR22表達水平與該組果實色澤變化密切相關(guān)。5 ℃和32 ℃貯藏的蜜橘果皮無明顯著色現(xiàn)象，但5 ℃延緩了葉綠體的發(fā)育，而32 ℃誘導(dǎo)葉綠體分化為有色體后又再分化為葉綠體，同時質(zhì)體相關(guān)基因表達存在顯著差異，說明在質(zhì)體結(jié)構(gòu)方面，5 ℃和32 ℃抑制蜜橘果皮著色的機制有顯著區(qū)別。本研究發(fā)現(xiàn)，不同貯藏溫度下蜜橘果實果皮色澤發(fā)育與質(zhì)體結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，同時質(zhì)體發(fā)育相關(guān)基因的表達水平與色澤存在一定的相關(guān)性。然而貯藏溫度如何調(diào)控質(zhì)體中的色素物質(zhì)以及質(zhì)體分化與果實色素物質(zhì)代謝的關(guān)系需要進一步研究。